Generación de ratas transgénicas utilizando un enfoque vectorial lentiviral

Resumen

Este artículo tiene como objetivo proporcionar la metodología para la transgénesis lentiviral en embriones de rata utilizando múltiples inyecciones de una suspensión de virus en el espacio perivitelina cigota. Las ratas hembra que están apareadas con una cepa masculina fértil con un color de piel dominante diferente se utiliza para generar madres adoptivas pseudoembarazadas.

Resumen

Los modelos animales transgénicos son fundamentalmente importantes para la investigación biomédica moderna. La incorporación de genes extraños en embriones de ratón o rata tempranos es una herramienta invaluable para el análisis de la función génica en organismos vivos. El método de transgénesis estándar se basa en la microinyección de fragmentos de ADN extraños en un pronúcleo de un ovocitos fertilizados. Esta técnica es ampliamente utilizada en ratones, pero sigue siendo relativamente ineficiente y técnicamente exigente en otras especies animales. El transgén también se puede introducir en embriones de una fase celular a través de una infección lentiviral, proporcionando una alternativa eficaz a las inyecciones pronucleares estándar, especialmente en especies o cepas con una estructura embrionaria más desafiante. En este enfoque, se inyecta una suspensión que contiene vectores lentivirales en el espacio perivelinal de un embrión de rata fertilizada, que es técnicamente menos exigente y tiene una mayor tasa de éxito. Se demostró que los vectores lentivirales incorporan eficientemente el transgén en el genoma para determinar la generación de líneas transgénicas estables. A pesar de algunas limitaciones (por ejemplo, requisitos de nivel 2 de bioseguridad, límites de tamaño de fragmentos de ADN), la transgénesis lentiviral es un método de transgénesis rápido y eficiente. Además, el uso de ratas hembra que se aparean con una cepa masculina fértil con un color de piel dominante diferente se presenta como una alternativa para generar madres adoptivas pseudoembarazadas.

Introducción

Durante muchos años, los roedores de laboratorio, como ratas y ratones, se han utilizado para modelar condiciones fisiológicas y patológicas humanas. La investigación en animales ha dado lugar a descubrimientos que eran inalcanzables por cualquier otro medio. Inicialmente, estudios genéticos se centraron en el análisis de trastornos y fenotipos que ocurren espontáneamente y que se consideran para imitar de cerca la condición humana¹. El desarrollo de métodos de ingeniería genética permitió la introducción o eliminación de genes específicos para obtener un fenotipo deseado. Por lo tanto, la generación de animales transgénicos es reconocida como ....

Protocolo

La producción y aplicación de vectores virales se ajustaba a las directrices de nivel 2 de seguridad de la bioseguridad y fue aprobada por el Ministerio de Medio Ambiente de Polonia. Todos los procedimientos animales experimentales que se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Ético Local. Los animales fueron alojados en jaulas ventiladas individualmente a una temperatura estable (21–23 oC) y humedad (50-60%) con acceso ad libitum al agua y alimentos bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.

1. Producción de vectores lentivirales

1. Transfección de células HEK 293T
   NOTA: El protocolo que se presenta aquí está d....

Resultados

Usando el protocolo descrito en el presente documento, se produjeron vectores lentivirales que llevaban la construcción Syn-TDP-43-eGFP (titer físico de LV a 3,4 x 10⁸/L) y luego se podrían utilizar para inyecciones subzonales de embriones en etapa de una célula. Sólo se sometieron al procedimiento embriones con dos pronúcleos visibles. El número de inyecciones de suspensiones virales se determinó experimentalmente. La alta eficiencia de implantación y la falta simultánea de descendencia transgénica se conside.......

Discusión

Los avances en tecnologías transgénicas han hecho de los modelos de roedores una herramienta invaluable en la investigación biomédica. Proporcionan la oportunidad de estudiar las relaciones genotipo-fenotipo in vivo. Aquí, presentamos una alternativa ampliamente disponible para la transgénesis convencional por inyecciones pronucleares. El uso de la transducción génica lentiviral evita la necesidad de microinyecciones exigentes porque se pueden inyectar vectores virales bajo la zona pellucida. Este enfoque no afecta a la .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
7500 Sistema de PCR en tiempo real	Applied Biosystems
Aerrane (isoflurano)	Baxter	FDG9623
Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas	Sigma	A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml	Eurovet Animal Health BV	N/A	0,5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)	Bayer	N/A	5-10 mg/kg
Capilares de vidrio de borosilicato con filamento GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	capilar inyectable
Bupivacaína 25 mg/ml	Advanz Pharma	N/A	0,25% in  0,9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorfanol  tartrato)	Orion Pharma	N/A	1 mg/kg
CELLSTAR Plato de cultivo celular de tejidos 35 mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR Plato de cultivo celular de tejidos 60 mm	Greiner Bio-One	628160
CellTram Oil	Eppendorf	5176 000.025
Cepetor (Medetomidina) 1 mg/ml	cp-pharma	N/A	0,5 mg/kg
Chorulón, Gonadotropina coriónica humana	Intervet	N/A	150 UI/ml ml 0,9% NaCl
DMEM baja glucosa	Sigma Aldrich	D6048
DNasa, sin ARNasa	A& A Biotechnology	1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil	Sigma	ES-005-C
Plásmido codificante de proteínas de envoltura para vectores lentivirales (plásmido VSVg)	ADDGENE	14888
FemtoJet	Eppendorf	4i /5252 000.013
Suero Fetal Bovino	Sigma Aldrich	F9665-500ML
Folligon, Yegua Preñada' s Gonadotropina sérica	Intervet	N/A	125 UI/ml en células NaCl
HEK 293T al .9%	ATCC	ATCC CRL-3216
Hialuronidasa de testículo bovino	Sigma	H4272-30MG	0,5 mg/ml en medio M2
Microscopio invertido	Zeiss	Axiovert 200
Ketamina 100mg/ml	Biowet Pulawy	N/A	50 mg/kg
Parafina Líquida	Merck Millipore	8042-47-5
M16 medio EmbryoMax	Sigma	MR-016-D
M2 medio	Sigma	M7167
Cloruro de Magnesio 1M	Sigma Aldrich	63069-100ML
Microforge	Narishige	MF-900
Aceite Mineral	Sigma	M8410-500ML
NaCl 0.9%	POLPHARMA OTC	N/A	estéril, ampollas de 5ml
Microscopio de operación	Inami Ophthalmic Instruments	Deca-21
Sistema de empaquetamiento que codifica plásmido para vectores lentivirales  (plásmido delta R8.2)	ADDGENE	12263
Reactivo de PEI (Polietilenimina, Mw ~ 25,000,),	Polysciences, Inc	23966-1
Penicilina-estreptomicina	Sigma Aldrich	P0781-100ML
Solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4, líquido, filtrado estéril, adecuado para cultivo celular	Sigma Aldrich	806552-500ML
Puller	Instrumento Sutter Co.	P-97
Aplicador de Pinzas Reflex/Pinzas Reflex World	Precision Instruments	500345/500346
Safil, ácido poliglicólico, trenzado, recubierto, hilos absorbibles	B.Braun Surgical 1048029
Microscopio estereoscópico	Olympus	SZX16
Hilo de coser quirúrgico	B.Braun
SYBR Green PCR Master Mix	Biosistema Aplicado	4334973
Tolfedina 4% (ácido tolfenámico)	Vetoquinol	N/A	2 mg/kg
TransferMan NK2	Eppendorf	N/A Tripsina
Solución de EDTA	Sigma Aldrich	T3924-500ML
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
VacuTip	Eppendorf	5175108.000	soportes capilares
Vita-POS	Ursapharm	N/A	ungüento para los ojos
Placa calefactora	Semic	N/A
Pinza de relojero	VWR	470018-868

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