Artículo de método

Un método revisado para inducir el linfedema secundario en la extremidad posterior de los ratones

DOI:

10.3791/60578

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2 de noviembre de 2019

 ,  ,  ,  , 
1University of Southern Denmark, 2Department of Plastic Surgery, Odense University Hospital

En este artículo

Resumen

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Este modelo animal permite a los investigadores inducir linfedema secundario estadísticamente significativo en la extremidad posterior de los ratones, que dura al menos 8 semanas. El modelo se puede utilizar para estudiar la fisiopatología del linfedema e investigar nuevas opciones de tratamiento.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los modelos animales son de suma importancia en la investigación del linfedema con el fin de entender la fisiopatología de la enfermedad, pero también para explorar posibles opciones de tratamiento. Este modelo de ratón permite a los investigadores inducir linfedema significativo que dura al menos 8 semanas. El linfedema se induce mediante una combinación de radioterapia fraccionada y ablación quirúrgica de linfáticos. Este modelo requiere que los ratones reciban una dosis de 10 radiación gris (gy) antes y después de la cirugía. La parte quirúrgica del modelo implica la ligadura de tres vasos linfáticos y la extracción de dos ganglios linfáticos de la extremidad posterior del ratón. Tener acceso a herramientas microquirúrgicas y un microscopio es esencial, debido a las pequeñas estructuras anatómicas de los ratones. La ventaja de este modelo es que resulta en un linfedema estadísticamente significativo, que proporciona una buena base para evaluar diferentes opciones de tratamiento. También es una gran opción y fácilmente disponible para el entrenamiento microquirúrgico. La limitación de este modelo es que el procedimiento puede llevar mucho tiempo, especialmente si no se practica de antemano. El modelo da como resultado un linfedema objetivamente cuantificable en ratones, sin causar morbilidad grave y ha sido probado en tres proyectos separados.

Introducción

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El linfedema se caracteriza por una acumulación de líquido linfático que conduce a la hinchazón localizada del tejido, que se produce principalmente debido a la alteración o alteración del flujo de líquido linfático en los vasos linfáticos1. El flujo linfático puede verse afectado o interrumpido por infección, obstrucción, lesiones o defectos congénitos en el sistema linfático2. Estas etiologías dan lugar a la acumulación de líquido linfático, lo que conduce a un estado crónico de inflamación, lo que resulta en fibrosis posterior, así como la deposición de tejido adiposo3. El linfedema se puede clasificar como linfedema primario o secundario. El linfedema primario es causado por anomalías del desarrollo o mutación genética2,4. El linfedema secundario ocurre debido a una enfermedad sistémica subyacente, cirugía otraumatismo2,4. El linfedema secundario es la forma más común de linfedema en el mundo2. En los países desarrollados, la causa más común del linfedema secundario es la terapia oncológica como la radioterapia adyuvante y la disección5de los ganglios linfáticos. El linfedema es más frecuente entre los pacientes con cáncer de mama, pero también puede desarrollarse en pacientes con cáncer ginecológico, melanoma, genitourinario o de cuello6. Se ha sugerido que de todas las mujeres diagnosticadas con cáncer de mama, el 21% desarrollará linfedema7.

El linfedema puede ser estresante para el paciente tanto física como psicológicamente. Los pacientes con linfedema tienen un mayor riesgo de infección5,8,9, mala calidad de vida y pueden desarrollar ansiedad social y síntomas de depresión10. Las complicaciones del linfedema crónico conducen a un alto costo de atención y un aumento de la carga de morbilidad9,11. Los hallazgos también han sugerido que el linfedema podría estar asociado con un mayor riesgo de muerte después del tratamiento con cáncer de mama12. El manejo conservador, como la compresión de la zona afectada, el drenaje linfático manual y el cuidado general de la piel, siguen siendo el primer enfoque. Actualmente no existe un tratamiento curativo6. Aunque se han hecho progresos en el campo de la terapia quirúrgica y médica, todavía hay margen de mejora. Se necesita más investigación, que proporciona información sobre la fisiopatología y la progresión de la enfermedad, para permitir a los médicos proporcionar mejores opciones de tratamiento para los pacientes5.

Los modelos animales se utilizan en la investigación preclínica para comprender la fisiopatología de las enfermedades y desarrollar posibles opciones de tratamiento. Se han establecido varios modelos animales de linfedema diferentes en caninos13,14,conejos15,ovejas16,cerdos17,18 y roedores19,20, 21,22,23,24. El modelo de roedores parece ser el modelo más rentable, al investigar la reconstrucción de la función linfática, debido a que los roedores son fácilmente accesibles y relativamente de bajo precio25. La mayoría de los modelos de ratones se han centrado en inducir linfedema en la cola de los ratones21,22,23. El modelo de cola es muy fiable, pero la técnica quirúrgica exacta para inducir el linfedema varía significativamente en el material publicado anteriormente. Esto se traduce en fluctuaciones en la duración y robustez del linfedema desarrollado presentado en la litteratura conocida25. También se están utilizando diferentes técnicas para inducir linfedema en el modelo de la extremidad posterior y también producen resultados variables, pero el modelo de la extremidad posterior podría ser más fácil de entender desde una perspectiva traslacional. Los modelos de linfedema anteriores se han visto obstaculizados por la resolución espontánea del linfedema y, por lo tanto, se necesita un modelo de linfedema reproducible y permanente25. Los investigadores han tratado previamente de aumentar la dosis de radiación, para prevenir la resolución espontánea del linfedema, pero esto a menudo ha llevado a la posterior morbilidad grave25.

Este modelo resulta en un linfedema estadísticamente significativo, sin causar morbilidad grave, combinando microcirugía con radiación. El modelo ha sido revisado a partir de un modelo quirúrgico anterior añadiendo una dosis de irradiación que induce linfedema, sin causar morbilidad grave26. También ofrece una gran oportunidad para la formación microquirúrgica. Es necesario tener acceso a equipos microquirúrgicos y un microscopio, debido a las pequeñas estructuras anatómicas de los ratones. El procedimiento quirúrgico se puede realizar cuando al usuario se le han enseñado técnicas microquirúrgicas básicas, como la sutura con instrumentos microquirúrgicos. Los operadores que realizaron este procedimiento vieron videos tutoriales de Acland sobre las condiciones previas de las habilidades microquirúrgicas (1981) y la técnica básica de microsutura (1985). Recomendamos practicar el procedimiento quirúrgico 8 a 10 veces antes de usarlo en la investigación. La práctica del procedimiento garantiza que se cometan menos errores y que el procedimiento se pueda realizar de forma más eficiente. Cuando se domina, el procedimiento quirúrgico se puede realizar en 45 minutos.

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Protocolo

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Los animales fueron alojados en la Instalación de Cuidado de Animales de la Universidad del Sur de Dinamarca según las directrices institucionales. Todos los procedimientos relacionados con sujetos animales han sido aprobados por la Inspección de Experimentos Animales, Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca.

1. Irradiación prequirúrgica

NOTA: La irradiación previa a la cirugía tiene lugar 7 días antes de la cirugía.

  1. Inducir la anestesia.
    1. Coloque el ratón en una caja de inducción y ajuste el vaporizador a 3% de isoflurano con un caudal de oxígeno de 0,8 x 1,2 L/min para inducir anestesia por inhalación.
      NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar anestésicos inyectables, pero durante la corta duración de la irradiación que indujo la anestesia por inhalación fue suficiente. Para obtener los resultados presentados en este artículo, se utilizaron ratones hembra C57BL6 de 9 semanas de edad.
    2. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado por la prueba de pellizco de cola o pata.
  2. Coloque el ratón para la irradiación.
    1. Si está completamente sedado, mueva el ratón de la caja de inducción y colóquelo debajo de la fuente de radiación en posición supina y fije suavemente las extremidades posteriores con cinta adhesiva.
      NOTA: El ratón permanecerá sedado durante la corta duración de la radiación.
    2. Coloque una almohadilla de plomo de 1,5 mm de espesor para asegurarse de que sólo el área que se somete a cirugía (es decir, el área circular con un diámetro de 25 mm alrededor de la rodilla) se irradia.
  3. Administrar una dosis de 10 gy de radiación a una dosis de 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
    ADVERTENCIA: Se deben tomar precauciones de seguridad cuando se trabaja con radiación. Durante este experimento, toda la irradiación se realizó en una sala con aislamiento radiacional, y la fuente de radiación sólo se encendió cuando todo el personal se había ido y sellado la habitación.
  4. Vuelva a colocar el ratón en su jaula.

2. Configuración del equipo

NOTA: La cirugía debe realizarse en una sala dedicada a los procedimientos quirúrgicos. La superficie operativa debe ser estéril.

  1. Limpie a fondo todas las superficies operativas con un 70% de etanol. Use red para el cabello y fundas. Utilice instrumentos quirúrgicos estériles y guantes estériles.
  2. Prepara la anestesia.
    1. Elaborar 1 ml de fentanilo (0,315 mg/ml), 1 ml de midazolam (5 mg/ml) y 2 ml de agua estéril. Utilice diferentes jeringas y agujas para los diferentes componentes.
    2. Mezcle el fentanilo y el agua estéril vaciando lentamente las jeringas en un tubo de vidrio estéril. Cuando se mezcle, agregue midazolam para completar la solución de trabajo.
  3. Prepara la analgesia.
    1. Elaborar 0,2 ml de buprenorfina (0,3 mg/ml) y 2 ml de salina.
    2. Mezcle los volúmenes vaciando lentamente las jeringas en un tubo de vidrio estéril para completar la solución de trabajo.
  4. Encienda el microscopio y asegúrese de que la iluminación es suficiente y de que el microscopio está bien ajustado para los ojos del operador.
    NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse bajo un microscopio operativo. Un rango de aumento de 4x a 25x es suficiente.

3. Preparación

  1. Pesar la precirugía del ratón colocando el ratón en un recipiente vacío en una escala despejada.
  2. Administrar anestésico.
    1. Elaborar 0,1 ml de anestésico por cada 10 g de peso corporal del ratón. Inyecte el anestésico por vía subcutánea como una inyección de bolo.
    2. Deje que el ratón descanse en una jaula con mucha ropa de cama y refugio durante aproximadamente 10 minutos hasta que esté completamente sedado. Examine la profundidad anestésica evaluando la relajación muscular y realice una prueba de pellizco de pata o cola.
  3. Cuando esté completamente sedado, asemegue la extremidad posterior elegida para el procedimiento utilizando cortadoras eléctricas. Asegúrese de limpiar el exceso de cabello.
  4. Encienda el dispositivo de calefacción, como una almohadilla de calentamiento, y cúbralo con un paño quirúrgico.
  5. Ajuste el flujo de oxígeno a 0,8 L/min y conéctelo con un nosecone. Use 100% de oxígeno.
    NOTA: El nosecone es sólo para la administración de oxígeno y no para la anestesia.
  6. Aplicar pomada oftálmica e inyectar 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea, preferiblemente en el escraro del ratón, para prevenir la hipovolemia durante la cirugía.
  7. Coloque el ratón para la cirugía.
    1. Coloque el ratón sobre el paño quirúrgico en posición supina. Coloque el nosecone sobre el hocico.
    2. Fije suavemente el extremo de las extremidades posteriores con cinta adhesiva para evitar que el ratón se desplace durante la cirugía.
    3. Esterilice la piel con alcohol/clorhexidina o alcohol/povidona.

4. Cirugía

NOTA: En este ejemplo, se ha elegido la extremidad posterior izquierda (cuando el ratón se ve en posición supina) para el procedimiento.

  1. Haga una incisión circular.
    1. Levante la piel con fórceps lisos y recorte una pequeña abertura aproximadamente 5 mm proximal a la fosa popliteal.
    2. Deslice las tijeras afiladas en la abertura y recorte hacia la rodilla para que la incisión termine justo por encima de la rodilla. Asegúrese de no perforar los vasos subyacentes levantando la piel con fórceps mientras se recorta.
    3. Mueva el ratón a la posición propensa y continúe recortando desde la rodilla hacia la fosa popliteal hasta que la incisión circunferencial esté completa.
  2. Disecciona la piel debajo de la rodilla.
    1. Diseccione suavemente el área por debajo de la rodilla a un par de milímetros por encima del tobillo, abriendo y cerrando lentamente las microtijeras mientras levanta la piel con fórceps.
    2. Recorte cuidadosamente las adherencias visibles restantes con microtijeras. Use solución salina estéril regularmente para mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento.
  3. Disseccionar la piel en el borde proximal de la incisión circunferencial para que pueda ser retraída con un retractor elástico.
    NOTA: El retractor permite al operador una mejor vista del vaso linfático proximal y evita que el borde proximal cambie durante la cirugía.
  4. Mientras esté en posición propensa, gire la extremidad posterior suavemente y fijarla con cinta adhesiva, de modo que la vena isquiatica sea visible desde el punto más proximal del área expuesta hasta el punto más distal.
  5. Inyectar aproximadamente 0,01 ml de Patente Azul V por vía subcutánea entre el segundo y el tercer dedo del dedo del dedo del dote utilizando una jeringa de 0,5 ml con una aguja de 30 G. Presione suavemente la pata un par de veces para distribuir el Patent Blue V. Visualice los vasos linfáticos y los ganglios linfáticos a través del microscopio mientras el Azul de Patente V llena los vasos linfáticos.
    NOTA: Si el color azul de los vasos linfáticos se desvanece durante el procedimiento, masajee suavemente la pata para promover la sua) , en lugar de inyectar más Patente Azul V. El uso excesivo de Patente Azul V puede conducir a fugas y coloreación del tejido que rodea los vasos linfáticos que puede comprometer el procedimiento.
  6. Localice las estructuras importantes: el ganglio linfático popliteal (PLN), los dos vasos linfáticos distales al ganglio linfático (DLV1 y DLV2) y el único vaso linfático proximal al ganglio linfático (VPL).
    NOTA: Todos los vasos linfáticos se pueden encontrar junto a la vena isquiatica. El vaso linfático proximal generalmente se encuentra medial a la vena, los dos vasos linfáticos distales se encuentran mediales y laterales a la vena. Las abreviaturas de las estructuras se utilizan en el vídeo adjunto.
  7. Amplíe para visualizar claramente el PLV y ligarlo con una sutura de nylon 10-0 usando soporte de microaguja y microfuerzas. Presione la pata un par de veces para asegurarse de que ninguna Patente Azul V pase proximal a la sutura.
    NOTA: Puede ser necesario recortar la grasa que rodea el vaso linfático.
  8. Repita el paso 4.7 para ligar los dos vasos linfáticos distales. Presione la pata varias veces para asegurarse de que ninguna Patente Azul V pase proximal a la ligadura. Si los vasos linfáticos se encuentran cerca de la vena isquiatica, intente disecizar aún más disérmicamente.
    NOTA: En este ejemplo, se puede ver que uno de los vasos linfáticos estalla debido a la ligadura que dificulta el flujo linfático. Los vasos linfáticos a menudo se separan de la vena más abajo.
  9. Retire el ganglio linfático popliteal.
    1. Localice el ganglio linfático popliteal y recorte un pequeño agujero con microtijeras para acceder a él y extirparlo con microcóceps y microtijeras.
      NOTA: El ganglio linfático tiene una superficie lisa similar a una perla en contraste con el tejido graso circundante.
    2. Para comprobar si el tejido extraído es un ganglio linfático, colóquelo en un tubo de ensayo lleno de agua.
      NOTA: Si el tejido está compuesto de grasa, el tejido flotará. Si el tejido es un ganglio linfático, se hundirá hasta el fondo.
  10. Retire la almohadilla de grasa inguinal y el ganglio linfático.
    1. Antes de extraer la almohadilla de grasa inguinal, utilice un coagulador bipolar para cauterizar los vasos que corren a través de la grasa.
    2. Reseque la almohadilla de grasa inguinal usando microfónicos y microtijeras. Sujeta suavemente los vasos cauterizados que corren a través de la grasa. A continuación, reseque suavemente el tejido graso en el área inguinal.
      NOTA: El ganglio linfático situado en la grasa rara vez es coloreado por Patente Azul V y puede ser difícil de diferenciar de la grasa. La eliminación de la almohadilla de grasa en una sola pieza es la mejor manera de asegurarse de que el ganglio linfático ha sido eliminado.
  11. Enjuague bien la pierna con solución salina estéril y confirme a través del microscopio que los pelos y partículas pequeños se han eliminado a fondo del área quirúrgica para evitar la contaminación e infección de la herida. Asegúrese de que no haya sangrado activo.
  12. Sutura los bordes de la piel hasta la facia muscular con una sutura de nylon 6-0 usando fórceps y soporte de aguja, dejando un espacio de 2 x 3 mm para restringir el flujo linfático superficial.
    NOTA: El vídeo que lo acompaña muestra un ejemplo de suturas terminadas.
  13. Administrar analgesia. Elaborar 0,1 ml de analgesia por cada 30 g de peso corporal del ratón. Inyectar la analgesia por vía subcutánea como una inyección de bolo.
  14. Pesar el ratón para post-cirugía para la comparación.
  15. Coloque el ratón en una jaula en un armario calentado para su recuperación.

5. Cuidado postoperatorio

  1. Dé a los ratones jaulas individuales para recuperarse después de la cirugía con agua y alimentos ad libitum.
  2. Administrar una dosis subcutánea de bolo de 0,02 ml de buprenorfina 3 veces al día durante 3 días para la analgesia.
  3. Monitoree al animal diariamente para la cicatrización adecuada de la herida, signos de dolor e infección. Si hay signos de infección, utilice un unción antibiótica.

6. Irradiación post-cirugía

  1. Tres días después de la cirugía, repita el procedimiento para la irradiación prequirúrgica (pasos 1.1-1.4).

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Resultados

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Este procedimiento se ha utilizado anteriormente en tres experimentos independientes. Todos los experimentos fueron realizados por diferentes investigadores principales que son coautores de este artículo. En los tres experimentos, se tuvo mucho cuidado de adherirse al mismo procedimiento descrito en este protocolo. En los tres experimentos, el linfedema secundario fue inducido en una extremidad posterior, mientras que la otra extremidad posterior sirvió como control. Los volúmenes de las ...

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Discusión

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Hay algunos pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, es importante que los investigadores tomen precauciones de seguridad cuando trabajan con radiactividad. En segundo lugar, durante la parte quirúrgica de este protocolo, es importante iniciar el procedimiento una vez anestesiado el ratón y terminarlo sin pausas innecesarias. Esto es importante para evitar un período quirúrgico excesivamente largo para el animal y para evitar que la anestesia pierde efecto durante la cirugía. Se recomienda administrar sólo una ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Peter Bollen, jefe del Laboratorio Biomédico por prestar el equipo necesario para grabar las imágenes que se ven a través de los microscopios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10-0 Sutura de nylonS& T12051-10
6-0 Sutura de nylon - DafilonB BraunC0933112
Coagulador - ICC 50ERBE
Aplicadores con punta de algodónYibon medical co
Pinza de disecciónLawton09-0190
Retractores elásticosUniversitario de Odense
Eléctrico maquinillaAesculapGT420
Fentanilo 0,315 mg/mlMatriz
Almohadilla térmica - PhysioSuiteKent Scientific Corp.
Isoflurano 1000mg AttaneScan Vet
Vaporizador de isoflurano - PPVPenlon
Micro pinza de jewlerLawton1405-05
Micro PortaagujasLawton25679-14
Micro tijerasLawton10128-15
Micro pinzas de atadoLawton43953-10
Jeringa Microfine U-40 0,5mlBD328821
Jeringa Microlance 25gBD
Jeringa Microlance 27gBD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)Matrix
Portaagujas - Circle woodLawton08-0065
Hisopos no tejidosSelefa
Microscopio óptico Opmi F170Zeiss
Patent azul V - 25 mg/mlTijeras Guerbet
- JosephBDRH1630
Escáner preclínico multimodal Siemens INVEONSoluciones preclínicas Siemens Fuente
de radiación - D3100Gulmay
Stata Software estadístico: Release 15StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mgIndivior
Vet - viscotearsBausch & Lomb
Hospital Ungüento oftalmológico

Referencias

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