Generación de paisajes químicos controlados y dinámicos para estudiar el comportamiento microbiano

Resumen

Se presenta un protocolo para la generación de paisajes químicos dinámicos por fotólisis dentro de configuraciones microfluídicas y milifluídicas. Esta metodología es adecuada para estudiar diversos procesos biológicos, incluyendo el comportamiento móvil, la acumulación de nutrientes o la adaptación a los productos químicos de los microorganismos, tanto a nivel de una sola célula como de población.

Resumen

Demostramos un método para la generación de pulsos químicos controlados y dinámicos, donde la quimioattractant localizada se vuelve repentinamente disponible a escala micropara crear microambientes para experimentos de quimiotaxis microbianos. Para crear pulsos químicos, desarrollamos un sistema para introducir fuentes de aminoácidos casi instantáneamente por fotólisis de aminoácidos enjaulados dentro de una cámara microfluida de polidimetilsiloxano (PDMS) que contiene una suspensión bacteriana. Aplicamos este método a la bacteria quimiotáctica, Vibrio ordalii,que puede escalar activamente estos degradados químicos dinámicos mientras se rastrea mediante microscopía de vídeo. Los aminoácidos, que se vuelven biológicamente inertes («enjaulados») por modificación química con un grupo protector fotoextraíble, están uniformemente presentes en la suspensión, pero no están disponibles para su consumo hasta su liberación repentina, que se produce en puntos definidos por el usuario en el tiempo y el espacio mediante un haz LED centrado cerca de los rayos UV-A. El número de moléculas liberadas en el pulso puede determinarse mediante una relación de calibración entre el tiempo de exposición y la fracción de desauno, donde el espectro de absorción después de la fotólisis se caracteriza por el uso de espectroscopia UV-Vis. Una membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) se puede integrar en el dispositivo microfluídico para permitir la eliminación continua por flujo de los compuestos no enjaulados y los medios gastados. Un enlace fuerte e irreversible entre la membrana PCTE y la estructura microfluídica PDMS se logra recubriendo la membrana con una solución de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguida de la activación plasmática de las superficies a unir. Un sistema controlado por ordenador puede generar secuencias de pulsos definidas por el usuario en diferentes ubicaciones y con diferentes intensidades, con el fin de crear paisajes de recursos con variabilidad espacial y temporal prescrita. En cada paisaje químico, se puede obtener la dinámica del movimiento bacteriano a escala individual y su acumulación a nivel de población, permitiendo así la cuantificación del rendimiento quimiotáctico y sus efectos en las agregaciones bacterianas en entornos ecológicamente relevantes.

Introducción

Los microbios se basan en la quimiotaxis, el proceso de detección de gradientes químicos y la modificación de la motilidad en la respuesta^1,para navegar por paisajes químicos, acercarse a fuentes de nutrientes y huéspedes, y escapar de sustancias nocivas. Estos procesos a microescala determinan la cinética macroeconómica de las interacciones entre los microbios y su entorno^2,3. Los recientes avances en microfluídicas y tecnologías de microfabricación, incluida la litografía blanda^4,han revolucionado nuestra capacidad de crear microambientes controlados en los que....

Protocolo

1. Fabricación del dispositivo microfluídico para el experimento de pulso químico único

1. Diseñe el canal utilizando el software de diseño asistido por ordenador (CAD) e imprímalo en una película de transparencia para crear la máscara de foto(Figura 1A).
2. Fabricar al maestro por litografía suave (en condiciones de sala limpia).
   1. Limpie una oblea de silicio (4 pulgadas) en rápida sucesión con acetona, metanol e isopropanol, luego seque con nitrógeno. Hornee la oblea en el horno a 130 oC durante 5 min.
   2. Coloque la oblea en el centro de un spin-coater y vierta su-8 fotorresistente en la oble....

Resultados

Utilizamos los dispositivos microfluídicos y milifluidos(Figura 1)para estudiar perfiles de acumulación bacteriana en condiciones de nutrientes dinámicos. Las trayectorias bacterianas se extrajeron de los videos grabados adquiridos por microscopía de contraste de fase de la dinámica de acumulación-disipación de una población bacteriana después de un pulso químico liberado por la fotólisis(Figura 2 y Figura 3). Al promediar millones .......

Discusión

Este método permite a los investigadores estudiar la quimiotaxis bacteriana bajo gradientes dinámicos controlados en dispositivos micro y milifluidos, lo que permite la adquisición de datos reproducibles. La creación casi instantánea de pulsos químicos a microescala por fotólisis tiene como objetivo reproducir los tipos de pulsos de nutrientes que las bacterias encuentran en la naturaleza a partir de una gama de fuentes, por ejemplo, la difusión difusa de plumas detrás del hundimiento de partículas marinas

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(3-aminopropilo) trietoxisilano (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% de pureza, altamente tóxico
Tubo CELLSTAR	Centrífuga Greiner Bio-One	210261	50 ml
	Eppendorf	5424R	para eliminar los medios gastados del cultivo bacteriano
Incubadoras digitales Incu-Line	VWR-CH	390-0384	para hornear 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	para limpiar la oblea y los microcanales
Placa calefactora	VWR-CH	444-0601	para unir los microcanales
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
Tubos de microcentrífuga LightSafe	Sigma-Aldrich	Z688312	1,5 ml
MATLAB	Mathworks		para el análisis de imágenes y el seguimiento bacteriano
Tubo de microcentrífuga	Eppendorf	30120086	1,5 ml
Portaobjetos de vidrio para microscopio	VWR-CH	631-1552
Microscopio Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	con platina motorizada
MNI-Glutamato	Tocris Bioscience	1490	>98 % pureza, fotosensible
Equipo de impresión	de moldes Stratasys		Objet30 3D impresora
Servicio de impresión de moldes	Estudios de impresión 3D	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	para calibrar el desenjaulado
Elementos NIS	Nikon Instruments		Imágenes de microscopio Software
Horno Venti-Line	VWR-CH	466-3516	para hornear PDMS (con convección forzada)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Cámara de plasma Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	para funcionalizar las superficies antes de la unión
Membrana de policarbonato	Sterlitech		PCT0447100 0.4 µ m tamaño de poro, 19 % de área abierta, 24 &; m de espesor
Microtubo de polietileno	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	Diámetro interno x diámetro exterior: 0,015" x 0,043" / 0,38 mm x 1,09 mm
Placa de Petri de poliestireno	VWR-CH	25373-100	superficie inferior (90 mm x 15 mm) para unir el dispositivo milifluídico
Báscula	VWR-CH	611-2605	para ponderar la mezcla de PDMS
cámara sCMOS Andor Zyla	Oxford Instruments		para contraste de fase y microscopía de fluorescencia (máx. 100 fps)
Sal marina	Instant Ocean	Nº de producto. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systèmes SolidWorks		Utilizado para diseñar el molde
Spectra X motor de luz	Lumencolor		para LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Kit de elastómero de silicio; agente de curado
Jeringa (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Aguja de jeringa	Agani	A228	de 10 a 30 ml Bomba de
jeringa 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani calibre 23 5/8 pulgadas (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Bomba de jeringa doble
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Material del molde