Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

Resumen

Describimos un protocolo de inoculación retardada para generar infecciones crónicas por heridas en ratones inmunocompetentes.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es un importante patógeno nosocomial de creciente relevancia para la salud humana y la enfermedad, particularmente en el establecimiento de infecciones crónicas de heridas en pacientes diabéticos y hospitalizados. Existe una necesidad urgente de modelos de infección crónica para ayudar en la investigación de la patogénesis de heridas y el desarrollo de nuevas terapias contra este patógeno. Aquí, describimos un protocolo que utiliza la inoculación retrasada 24 horas después de la herida escisión de espesor completo. La infección de la matriz de heridas provisionales presente en este momento es un aclaramiento rápido o la diseminación de la infección y, en su lugar, establece una infección crónica que dura de 7 a 10 días sin necesidad de implantación de materiales extraños o supresión inmunitaria. Este protocolo imita un curso temporal típico de infección postoperatoria en humanos. El uso de una cepa luminiscente de P. aeruginosa (PAO1:lux) permite una evaluación diaria cuantitativa de la carga bacteriana para las infecciones de la herida de P. aeruginosa. Este nuevo modelo puede ser una herramienta útil en la investigación de la patogénesis bacteriana y el desarrollo de nuevas terapias para infecciones crónicas de la herida de P. aeruginosa.

Introducción

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es una bacteria Gram-negativa en forma de varilla con creciente relevancia para la salud humana y la enfermedad. Es responsable de la extensiva morbilidad y mortalidad en entornos nosocomiales, particularmente involucrando infecciones de heridas en pacientes inmunocomprometidos^1,2. La aparición de cepas multirresistentes de este patógeno ha proporcionado un mayor impulso para la investigación de factores que contribuyen a la virulencia de P. aeruginosa, mecanismos de resistencia a los antibióticos P. aeruginosa, y nuevos métodos para la prevención y el tratamiento de esta infección mortal³. Como tal, la necesidad de modelos animales de infección crónica de heridas como herramientas para investigar estas preguntas de investigación nunca ha sido mayor.

Desafortunadamente, muchos modelos animales de infección por P. aeruginosa tienden a simular una infección aguda con rápida resolución de infección o declive rápido debido a la sepsis^4,5, que no simula adecuadamente la naturaleza crónica a menudo de estas infecciones. Para hacer frente a este inconveniente, algunos modelos utilizan la implantación de cuerpos extraños como cuentas de agar, implantes de silicona, o geles de alginato^6,7,8. Otros modelos utilizan ratones inmunocomprometidos debido a la edad avanzada, obesidad o diabetes, o a través de medios farmacológicos como la neutropenia inducida por ciclofosfamida^9,10,11,12. Sin embargo, el uso de materiales extraños o huéspedes inmunes comprometidos probablemente altera el proceso inflamatorio local, lo que dificulta obtener una comprensión de la fisiopatología implicada en infecciones crónicas de heridas en huéspedes con sistemas inmunitarios normales.

Hemos desarrollado un modelo crónico de infección por herida de P. aeruginosa en ratones que implica una inoculación tardía con bacterias después de la herida escisión. La inoculación tardía permite experimentos que evalúan la carga bacteriana extendiéndose hasta al menos 7 días. Este modelo abre nuevas oportunidades para investigar tanto la patogénesis como los nuevos tratamientos de las infecciones crónicas de P. aeruginosa.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Stanford.

1. Preparación y crecimiento de bacterias

1. Llevar a cabo todo el trabajo con P. aeruginosa y animales con precauciones BSL-2 según el comité institucional de bioseguridad del investigador y las directrices del comité de uso animal. Realice todos los pasos descritos aquí con P. aeruginosa,incluida la inoculación del ratón, en un gabinete de bioseguridad.
2. La cepa luminiscente PAO1:lux de P. aeruginosa está disponible en nuestro laboratorio bajo petición. Streak PAO1, almacenado como caldo de glicerol congelado, en el agar de lysabagenia (LB). Para la cepa luminiscente PAO1:lux, el agar LB debe contener antibióticos selectivos (100 g/ml de carbenicilina y 12,5 g/ml de kanamicina). Crecer a 37oC durante la noche en una incubadora bacteriana.
3. Escoge una colonia aislada y crece durante la noche a 37oC en medio LB de 3 ml, pH 7,4. Para las cepas luminiscentes, el caldo debe contener 100 g/ml de carcarbenicilina. Crecer bajo condiciones aeróbicas y temblorosas.

2. Preparación del procedimiento

1. Pida a todo el personal que realiza la cirugía que use una bata limpia/capa de laboratorio, máscara facial, red capilar y guantes.
2. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas, incluyendo tijeras y fórceps. Utilice una técnica aséptica para esterilizar herramientas entre animales.
3. Limpie la mesa quirúrgica con etanol y prepare un campo quirúrgico limpio.

3. Depilación

1. Anestetiza ratones C57BL/6J de 8–12 semanas usando 1%-3% de isoflurano. Los investigadores deben seguir las pautas del personal veterinario de su institución para la anestesia cuando se utiliza isoflurano.
   1. Comience la anestesia entregando 1%-3% de isoflurano y ajuste el caudal de oxígeno a 1,5 L/min. Coloque el ratón en la cámara de inducción.
   2. Pellizca el dedo del ratón para evaluar la profundidad de la anestesia. Cuando el ratón ya no responda a la estimulación, retírelo de la cámara de inducción y colóquelo en el banco quirúrgico con la nariz en el cono de la nariz de isoflurano.
   3. Aplique lubricante ocular en ambos ojos.
2. Pesar el ratón para obtener un peso pre-procedimiento basal.
3. Coloque el ratón en posición propensa. Inyectar el ratón por vía subcutánea con cloruro de sodio estéril precalentado al 0,9%, 250 ml en cada flanco para un total de 500 ml.
4. Afiérase el área dorsal del ratón con una afeitadora eléctrica. El afeitado debe ocurrir en un lugar diferente al de la estación quirúrgica para evitar la contaminación capilar de la herida.
5. Aplica una fina capa de loción para depilar. Deje que la loción se sente durante 20–60 s. Retire el cabello y el exceso de loción con gasa humedecida en agua tibia. Después de la depilación, proceda al procedimiento de herida sin cisional.

4. Cirugía de herida de escisión de espesor completo

1. Inyectar buprenorfina de liberación sostenida 0,6–1 mg/kg por vía subcutánea utilizando una aguja de 25 G en el área dorsal media del ratón. La buprenorfina de liberación lenta proporciona alivio del dolor durante 48–72 h.
2. Desinfectar el sitio quirúrgico. Limpie la superficie dorsal con un hisopo estéril de betadina. Limpie el exceso de betadina con un hisopo de alcohol estéril. Esto debe realizarse 3 veces (alternando entre betadina y alcohol), frotando moviéndose desde el centro de una manera circular hasta el borde. Deje que el área se seque al aire.
3. Cree una cortina que rodea el sitio quirúrgico utilizando una gasa estéril o una envoltura de plástico.
4. Estirar la piel tensa durante la mayor parte. Utilice un punzón de biopsia de piel estéril de 6 mm de diámetro para hacer una incisión inicial a través de la epidermis dorsal izquierda. Repita en la epidermis dorsal derecha.
5. Usa fórceps para poner en la piel de la piel del centro de la zona de la herida delineada izquierda. Reutilice las capas epidérmicas y dérmicas con tijeras. Repita en el área de la herida delineada derecha para crear heridas de escisión simétricas.
6. Lavar las heridas con 50 ml de solución salina estéril. Deje que el sitio quirúrgico y la piel circundante se sequen al aire. A continuación, cubra las heridas y el dorso con un vendaje de película transparente.
7. Vuelva a colocar el ratón en una jaula limpia. Casa 1 animal por jaula.
8. Coloque la jaula en una almohadilla de calentamiento y monitor hasta que el ratón se despierte.
9. Al realizar la cirugía anterior en varios animales, utilice un esterilizador de cuentas calientes para limpiar todos los instrumentos quirúrgicos entre animales.
10. Dejar 24 h para que los ratones se recuperen del procedimiento quirúrgico y para la formación de una matriz de herida provisional sobre las heridas antes de proceder a la inoculación con bacterias.

5. Inoculación con P. aeruginosa

1. Diluir el cultivo de PAO1:lux durante la noche a₆₀₀ o00 o 0,05 en 75 ml de medios LB que contengan 100 g/ml de carbenicilina y crezca nalentelen las bacterias hasta que el cultivo esté en fase exponencial temprana (OD₆₀₀ 0.3). Esto debe tomar aproximadamente 2–3 h.
2. Diluir PAO1:lux en PBS a una concentración de (7,5 x 2,5) x 10² CFU/ml. Asegúrese de preparar el exceso de inóculo para asegurar un volumen suficiente y permitir el enchapado después del experimento. Si transporta entre instalaciones (es decir, desde el laboratorio hasta el vivario), utilice la doble contención en una caja de prueba de fugas claramente marcada como Riesgo biológico.
3. Realizar todo el trabajo con P. aeruginosa y ratones utilizando equipos de protección personal aprobados en un gabinete de seguridad biológica (BSC) aprobado por Animal Biosafety Level 2 (ABSL-2). Los equipos reutilizables, como la báscula de pesaje, deben estar cubiertos con envoltura adhesiva para evitar la contaminación.
4. Anestetizar usando 3% isoflurano como se describió anteriormente. Pesar el ratón y registrar el peso. Inyectar el ratón por vía subcutánea con cloruro de sodio estéril precalentado al 0,9%, 250 ml en cada flanco para un total de 500 ml.
5. Si el apósito de película transparente del ratón ha salido de la noche a la mañana, retire cuidadosamente cualquier costra resultante y ponte un apósito nuevo.
6. Utilice una jeringa de tapa de seguridad de 500 l de tuberculina de 27 G para inyectar 40 ml de la suspensión PAO1:lux a través del apósito de película transparente en cada herida. Se deben utilizar diferentes ratones para los controles de heridas no inoculados/PBS con el fin de evitar la contaminación cruzada desde el lado contralateral.
7. Coloque el ratón de nuevo en su jaula en una almohadilla de calentamiento y monitor hasta que se despierte. Todos los ratones deben estar alojados individualmente en jaulas separadas para evitar la contaminación cruzada.
8. Proporcionar pasta de suplemento nutricional alta en calorías intercalada entre pellets de alimentos en el suelo de la jaula.
9. Utilice el inóculo restante para rayar una placa de agar LB. Contar colonias para confirmar el número de bacterias administradas.

6. Imágenes in vivo de heridas infectadas

1. Siga los protocolos de contención BSL-2 para el transporte de ratones hacia y desde el instrumento de imágenes, incluido el uso de un contenedor secundario. Tenga cuidado de no transferir ni dejar caer ninguna ropa de cama de animales durante la transferencia del ratón a la cámara de inducción o al instrumento de imagen.
2. Inducir la anestesia del ratón con isoflurano inhalado 1%–3% en una cámara de inducción como se describe en el paso 3.1.
3. Una vez anestesiado el ratón, colóquelo en posición propensa en la cámara de imágenes de un sistema óptico de imágenes con la nariz en el cono de la nariz de isoflurano.
4. Abra el programa de software.
5. Los parámetros de adquisición variarán en función del número de animales que se den la imagen simultáneamente y la intensidad de la bioluminiscencia. Los parámetros básicos para establecer incluyen el tiempo de exposición, el binning, f/stop y el campo de visión (FOV). Nuestros ajustes de inicio predeterminados son el tiempo de exposición 30 segundos, el binning low (2), f/stop 1.2 y FOV 25. Ajuste estos ajustes según sea necesario dependiendo de las necesidades del investigador.
6. Analizar los datos de luminiscencia utilizando un programa de imágenes (ver Tabla de materiales). La luminiscencia se representará como una imagen pseudocolor superpuesta en una fotografía en color de los ratones.
   1. Cree una región de interés (ROI) en el sitio de la herida y mida el flujo medio (fotones/segundo) detectado. Tenga en cuenta que los datos también se pueden notificar como resplandor (fotones/segundo/cm2/steradian), pero siempre y cuando la distancia de la plataforma de imágenes de la cámara permanezca constante entre imágenes, el flujo es suficiente.
   2. Mida el fondo creando un ROI en un área aleatoria en la plataforma de imágenes. Restar el número de fondo de fotones/segundo.
   3. Exporte los datos a una hoja de cálculo para su posterior análisis.
7. Realice imágenes como se describió anteriormente tan a menudo como todos los días para realizar un seguimiento de la progresión de la infección.

7. Gestión postoperatoria

1. Supervise a los ratones de acuerdo con las pautas establecidas por el protocolo IACUC del investigador. Monitorizamos todos los ratones diariamente durante los primeros 4 días, luego cada dos días hasta el final del experimento. Pesar los ratones una vez al día durante los primeros 4 días después de la cirugía en un BSC. Inyectar 250 éL de cloruro sódico al 0,9% por vía subcutánea en los días 1 y 2 posteriores a la infección.
2. Compruebe si hay signos de dolor/angustia en los ratones, como la postura encorvada, el pelaje desaliñado, el letargo, la dificultad para respirar, la mueca facial y la pérdida de peso.
3. Si los animales muestran signos de deterioro de la salud, consulte con un veterinario. Cualquier ratón que parezca mostrar signos de empeoramiento de dolor/angustia y una pérdida de peso del 20% o mayor debe ser eutanasiado.

8. Escisión de heridas

1. Al final del experimento, sacrificar los ratones usando la inhalación de CO_2, seguido de la luxación cervical. Deseche la canal de animales de acuerdo con los protocolos ABSL-2 de la institución.
2. Exbote las camas de heridas usando tijeras estériles y fórceps en un BSC. Coloque cada lecho enrollado en PBS estéril de 1 ml en un tubo de polipropileno de 1,5 ml. Mince el tejido de la herida con tijeras. Todas las heridas deben tratarse como ASBL-2, incluso si no se consideran infectadas.
3. Incubar sobre una coctelera a 300 rpm durante 2 h a 4oC. Vortex cada tubo durante 10 s y diluir en serie el efluente bacteriano en PBS. Placar el efluente bacteriano diluido en el agar LB para enumerar la carga bacteriana.
4. Considere las heridas infectadas si la señal luminiscente en la herida está por encima de la luminiscencia de fondo y se detectan más bacterias en el efluente de la herida que en las heridas inoculadas con PBS como control.

Resultados

Utilizando una cepa luminiscente de PAO1 con un plásmido que codifica el sistema de reportero luxABCDE (PAO1:lux), realizamos heridas escisiones en ratones, inoculamos estas heridas con P. aeruginosa planctónica 24 h más tarde, y medimos la carga bacteriana a lo largo del tiempo(Figura 1 y Figura 2). Una imagen representativa obtenida mediante un sistema óptico de imágenes demuestra que este modelo da como resultado una ...

Discusión

Hemos desarrollado un nuevo modelo de infección por heridas de inoculación retardada P. aeruginosa. La estrategia de retrasar la inoculación con bacterias hasta 24 h después de la herida escisión permite la evaluación de infecciones de heridas durante un período de 1 semana. Mediante el uso de una cepa luminiscente de P. aeruginosa, es posible realizar un seguimiento de la progresión de la infección a lo largo del curso de la infección. El curso más largo de la infección en comparación con otros modelos...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de sodio al 0,9% inyectable	Hospira	2484457
18 G x 1 aguja estéril	BD	305195
25 G x 1 1/5 aguja estéril	BD	305127
Hisopo con alcohol	BD	326895
Aura Software de imágenes	Spectral Instruments Imaging	n/a
Betadine	Purdue Frederick Company	19-065534
Buprenorfina SR LAB	Zoopharm	n/a
C57BL/6J ratones machos	The Jackson Laboratory	000664
Punzón de biopsia desechable, 6 mm	Integra	33-36
Tijeras finas - Carburo de tungsteno	Fine Science Tools	14568-09
Esterilizador seco de perlas de vidrio	Aparato Harvard	61-0183
Agar granulado	Fisher BioReagents	BP9744
Almohadilla térmica	Milliard	804879481218
Jeringa de insulina con aguja de 28 G	BD	329461
Lago X Imaging System	Spectral Instruments Imaging	n/a
Caldo LB	Fisher BioReagents	BP1426
Leur-Lok Jeringa de 1 mL	BD	309628
Mini Arco Animal Trimmer	Wahl Professional	919152
Nair Loción Depilatoria con Aceite de Bebé	Church y Dwight	n/a Disponible	en cualquier farmacia
Pinzas de octágono	Herramientas de ciencia fina	11041-08
Placa de Petri	Falcon	351029
solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Envoltura adhesiva para prensar y sellar	Glad	n/a Jeringa
de insulina SafetyGlide con aguja de 30 G	BD	305934
Jeringa de insulina Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	Báscula de	305934
	BD Ohaus Scout Pro	SP202
Suplemento Nutricional Suplical Henry	Schein Salud Animal	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W