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Artículo de método

Medición de la plasticidad de la privación visual monocular y la dominación ocular en la corteza visual primaria del ratón

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DOI:

10.3791/60600

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8 de febrero de 2020

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1The Clinical Hospital of Chengdu Brain Science Institute, MOE Key Lab for NeuroInformation, University of Electronic Science and Technology of China, 2Sichuan Institute for Brain Science and Brain-inspired Intelligence, 3Department of Electronic Engineering, City University of Hong Kong, 4Centre for Biosystems, Neuroscience, and Nanotechnology, City University of Hong Kong

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos protocolos detallados para la privación visual monocular y el análisis de plasticidad de dominio ocular, que son métodos importantes para estudiar los mecanismos neuronales de la plasticidad visual durante el período crítico y los efectos de genes específicos en desarrollo visual.

Resumen

La privación visual monocular es un excelente paradigma experimental para inducir la plasticidad de la respuesta cortical visual primaria. En general, la respuesta de la corteza al ojo contralateral a un estímulo es mucho más fuerte que la respuesta del ojo ipsilateral en el segmento binocular de la corteza visual primaria del ratón (V1). Durante el período crítico de los mamíferos, la sutura del ojo contralateral dará lugar a una rápida pérdida de capacidad de respuesta de las células V1 a la estimulación ocular contralateral. Con el desarrollo continuo de tecnologías transgénicas, cada vez más estudios utilizan ratones transgénicos como modelos experimentales para examinar los efectos de genes específicos en la plasticidad de la dominación ocular (OD). En este estudio, introducimos protocolos detallados para la privación visual monocular y calculamos el cambio en la plasticidad de la DoS en el ratón V1. Después de la privación monocular (MD) durante 4 días durante el período crítico, se miden las curvas de ajuste de orientación de cada neurona, y las curvas de afinación de la capa cuatro neuronas en V1 se comparan entre la estimulación de los ojos ipsilaterales y contralaterales. El índice de sesgo contralateral (CBI) se puede calcular utilizando la puntuación de DO ocular de cada célula para indicar el grado de plasticidad de la DoD. Esta técnica experimental es importante para estudiar los mecanismos neuronales de la plasticidad de la DoC durante el período crítico y para examinar las funciones de genes específicos en el desarrollo neuronal. La principal limitación es que el estudio agudo no puede investigar el cambio en la plasticidad neuronal del mismo ratón en un momento diferente.

Introducción

La privación visual monocular es un excelente paradigma experimental para examinar la plasticidad V1. Para estudiar la importancia de la experiencia visual en el desarrollo neuronal, David Hubel y Torsten Wiesel1,2 gatitos privados de visión normal en un ojo en varios momentos y durante diferentes períodos de tiempo. A continuación, observaron los cambios en la intensidad de respuesta en V1 para los ojos desfavorecidos y no desfavorecidos. Sus resultados mostraron un número anormalmente bajo de neuronas reaccionando al ojo que habíasido suturadas cerradas en los primeros tres meses. Sin embargo, las respuestas de las neuronas en los gatitos permanecieron idénticas en todos los aspectos a las de un ojo de gato adulto normal que fue suturado cerrado durante un año, y los gatitos no se recuperaron. El MD en gatos adultos no puede inducir plasticidad de la DO. Por lo tanto, el impacto de la experiencia visual en el cableado V1 es fuerte durante una fase breve y bien definida de desarrollo, antes y después de la cual los mismos estímulos tienen menos influencia. Tal fase de mayor susceptibilidad a la entrada visual se conoce como el período crítico en la corteza visual.

Aunque el ratón es un animal nocturno, las neuronas individuales en el ratón V1 tienen propiedades similares a las neuronas que se encuentran en los gatos3,4,5. En los últimos años, con el rápido desarrollo de la tecnología transgénica, un número cada vez mayor de estudios en neurociencia visual han utilizado ratones como modelo experimental6,7,8. En estudios visuales con ratones, los neurocientíficos utilizan mutantes y líneas de ratón noqueadas, que permiten controlar la composición genética de los ratones. Aunque los ratones V1 carecen de columnas OD, las neuronas individuales en la zona binocular V1 muestran propiedades significativas de La DoS. Por ejemplo, la mayoría de las células responden con más fuerza a la estimulación contralateral que a la estimulación ipsilateral. El cierre temporal de un ojo durante el período crítico induce un cambio significativo en la distribución del índice OD9,10,11. Por lo tanto, MD se puede utilizar para establecer un modelo de plasticidad de OD para investigar cómo los genes involucrados en trastornos del desarrollo neural influyen en la plasticidad cortical in vivo.

Aquí, introducimos un método experimental para MD y sugerimos un método comúnmente utilizado (grabación electrofisiológica) para analizar el cambio en la plasticidad de la DO durante la privación visual monocular. El método ha sido ampliamente utilizado en muchos laboratorios durante más de 20 años12,13,14,15,16. Hay otros métodos utilizados en la medición de la plasticidad De OD, como el potencial evocado visual crónico (VEP) que registra17,y las imágenes ópticas intrínsecas (IOI)18. La ventaja significativa de este método agudo es que es fácil de seguir, y los resultados son notablemente fiables.

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Protocolo

En este protocolo, los machos C57Bl/6 fueron obtenidos del Instituto de Animales de Laboratorio de la Academia de Ciencias Médicas de Sichuan y del Hospital Popular Provincial de Sichuan. Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China.

1. Privación monocular (MD) en el día 28 postnatal en ratones

  1. Coloque las herramientas quirúrgicas, la aguja de sutura (0,25 mm de diámetro, diámetro de la cuerda 0,07 mm) y los hisopos de algodón en una caja de aluminio y autoclave a 120 oC durante 0,5 h. Esterilice la campana con 75% de etanol. Seque las herramientas quirúrgicas en un horno de secado.
  2. Preparar una solución de agarosa del 2%, ponerla en un baño de agua a 75 oC para evitar la solidificación.
  3. Utilice isoflurano mezclado con oxígeno para anestesiar al ratón (2% de inducción y 1,2–1,5% de mantenimiento). Fije el ratón en el aparato estereotaxico y utilice un dispositivo regulador de calor para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 oC y evitar la hipotermia.
  4. Aplique una fina capa de pomada ocular a base de petróleo en ambos ojos.
  5. Bajo el microscopio anatómico con iluminación, sutura el párpado en un ojo. Haga pasar la aguja a través de ambos lados del párpado 2x(Figura 1A)y haga alrededor de cuatro puntos de sutura.
  6. Anudar el hilo 2–3x y luego recortar el hilo. Aplicar 3 ml de pegamento de secado instantáneo en el nudo para aumentar su estabilidad. A continuación, corte el hilo de sutura adicional.
  7. Proporcione una inyección intraperitoneal de buprenorfina (1 mg/kg) al ratón.
  8. Transfiera el ratón a una almohadilla de calentamiento para mantener su temperatura corporal a 37 oC y evitar la hipotermia y controlarla hasta que recupere la conciencia.
  9. Cuando el ratón esté completamente despierto, colóquelo en una jaula de sujeción separada.
  10. Revise los párpados diariamente para asegurarse de que permanezcan cerrados y no infectados. Excluya el ratón si se encuentra una abertura del párpado.
  11. Antes del registro electrofisiológico, utilice isoflurano mezclado con oxígeno para anestesiar al ratón (2% de inducción y 1,2-1,5% de mantenimiento).
  12. Retire los puntos con tijeras para los ojos para exponer el globo ocular. Recorte cuidadosamente los párpados.
  13. Enjuague el ojo con solución de lente y compruebe el ojo bajo un microscopio para mayor claridad. Excluya a los ratones con opacidades corneales o signos de infección.

2. Craniotomía en la región binocular del ratón V1 después de la privación monocular el 4o día

  1. Después de anestesiar el ratón, compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del tiempo.
  2. Coloque y fije el ratón en el aparato estereotaxico. Ajuste la altura de la barra del oído y la barra dental para mantener el cerebro plano y estable.
  3. Utilice una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal.
  4. Aplique una pomada ocular a base de petróleo en la superficie de los ojos para mantenerlos húmedos.
  5. Retire el pelo de la cabeza del ratón para exponer su piel. Frote la piel con exfoliantes alternados de yodo y 70% etanol 3x.
  6. Incise un área de 8 x 8 mm de la piel entre las orejas para exponer el cráneo y extraer el tejido del cuero cabelludo. A continuación, retire el tejido conectivo que cubre con un 30% de peróxido de hidrógeno.
  7. Taladre un agujero de 1 x 1 mm en el cráneo por encima del cerebelo. Fije un pequeño tornillo óseo en el agujero como referencia.
  8. Realizar una pequeña craneotomía de 1 mm de diámetro en la región binocular V1 desde el hemisferio contralateral hasta el ojo desfavorecido(Figura 1B, A-P: lambda -0.51–lambda +1.67 mm; M-L: -2.6– -3.0 mm; D-V: 0-1 mm). Retire cuidadosamente el fragmento del cráneo sin lastimar el cerebro.
  9. Cubrir la superficie cortical expuesta con 75 ml de agarosa del 2% a 40 oC para evitar el secado.
  10. Fijar un electrodo de tungsteno en el marco estereotaxico. Coloque el electrodo de tungsteno verticalmente sobre la superficie de la corteza expuesta, la región binocular de V1, para asegurarse de que las células que se registran reaccionan a ambos ojos.
  11. Use hisopos de algodón para eliminar el gel para los ojos y aplique aceite de silicio en el ojo cada 2 h.

3. Estimulación visual y grabación electrofisiológica

  1. Enmascarar el ojo con placa de plástico no transparente. Coloque un monitor LCD a 23 cm del ojo del ratón.
  2. Reduzca la anestesia a 0.5–0.8% cuando el ratón esté completamente anestesiado.
  3. Avance el electrodo de microelectrodo lentamente con un micromanipulador hidráulico de aceite. Deténgalo cuando se observe una alta relación señal-ruido y el electrodo esté avanzado a la capa 4(Figura 1C,aproximadamente 250–450 m de profundidad). Asegúrese de que el factor de amplificación esté ajustado en 1.000, el filtro a 300–100 Hz y la frecuencia de muestreo en 40 Hz.
  4. Presentar una rejilla sinusoidal móvil de campo completo(Figura 1D, 12 direcciones, 100% de contraste, 2 Hz de frecuencia temporal, 0,04 ciclos por grado de frecuencia espacial) en el monitor LED.
  5. Mida la respuesta de la célula estimulando el ojo ipsilateral y contralateral por separado. Presente 3-5x total.
  6. Mida las respuestas de cinco a ocho células en cada penetración. Realizar de cuatro a seis penetraciones en cada ratón.
  7. Después de la grabación, ajuste el caudal de isoflurano al 5% o superior, continúe la exposición al isoflurano durante 1 min y, a continuación, realice la luxación cervical.
    NOTA: Las penetraciones separadas se espaciaron al menos a 200 m de distancia en la zona binocular V1.

4. Clasificación de picos fuera de línea y análisis de datos

  1. Detecte picos cuando la señal sin procesar cruce un nivel de umbral. Alinee los picos capturados en el primer pico positivo o negativo. Utilice el software para detectar picos de diferentes células.
  2. Establezca dos cursores: uno para positivo y el otro para la desviación negativa. Establezca la plantilla de pico(Figura 2A). Establezca el área de plantilla con la variación más significativa entre las diferentes clases de picos.
  3. Utilice el análisis de componentes principales para separarlos en clústeres. Los métodos de agrupación en clústeres pueden variar entre diferentes laboratorios.
  4. Clasificar el pico de un límite mediante el algoritmo K-means.
  5. Correlacione la orientación con la velocidad de disparo del pico y trace las curvas de afinación de orientación para el ojo ipsilateral y contralateral.
  6. Calcular el índice OD para la unidad única, que representa la relación de resistencia de respuesta contralateral/ipsilateral:
    figure-protocol-1
    donde Rcontra y Ripsi son la respuesta óptima de la célula para el ojo contralateral e ipsilateral, respectivamente, y Rspon es la actividad espontánea de la célula.
  7. Asigne las puntuaciones de OD a 1–7 de la siguiente manera: de 1 a 0,75 a 1; 0,75 a 0,45 x 2; 0,45 a 0,15 x 3; 0,15 a 0,15 a 4; 0.15 a 0.45 a 5; 0,45 a 0,75 a 6; y de 0,75 a 1 x 7.
  8. Calcular el índice de sesgo contralateral (CBI):
    figure-protocol-2
    donde N es el número de celda, y nx es igual al número de celda con puntuaciones OD iguales a x.

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Resultados

Los resultados experimentales descritos aquí permiten mediciones exitosas de plasticidad MD y OD a partir de un ratón desfavorecido y sin desfundado durante el período crítico (P19–P32). La Figura 1 muestra cómo realizar grabaciones de una sola unidad en la capa 4 de V1 de la zona binocular para comparar las respuestas en el ojo ipsilateral y contralateral 4 días después de MD. La Figura 2 muestra la clasificación de picos y las mediciones de ajuste de orientaci...

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Discusión

Presentamos un protocolo detallado para MD y medición de la plasticidad OD mediante grabación de una sola unidad. Este protocolo es ampliamente utilizado en la neurociencia visual. Aunque el protocolo MD no es complicado, hay algunos procedimientos quirúrgicos críticos que deben seguirse cuidadosamente. En primer lugar, hay dos detalles importantes que garantizan la calidad de la costura. La sutura es lo suficientemente estable si los puntos se concentran en la parte medial del párpado. Por otra parte, se aplica 3 l de p...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81571770, 81771925, 81861128001).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
502 pegamentoM& G Chenguang Papelería Co., Ltd.
Tarjeta de aprobaciónInstrumento NacionalPCI-6250
AgaroseBiowestG-10
AmplificadorSistema A-MModelo 1800
AtropinaAladdin Bio-Chem Technology Co., LtdA135946-5
Aparato estereotáxico cerebralRWD Life Science Co., Ltd68001
Tijeras de resorte Cohan-VannasFine Science Tools15000-02
Soluciones de lentes de contactoBeijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd.
Hisopos de algodónHenan Guangderun Medical Instruments Co., Ltd
Portaagujas finasSuZhou Stronger Medical Instruments Co., LtdCZQ1370
Forcep66 Vision Tech Co., Ltd.53320A
Pinza66 Visión Tech Co., Ltd.53072
Pinza66 Visión Tech Co., Ltd.#5
Almohadilla térmicaStrykerTP 700 T
IluminadorMotic China Group Co., Ltd.MLC-150C
IsofluranoRWD Life Science Co., LtdR510-22
monitor LCDPhilips (China) Investment Co., Ltd.39PHF3251/T3
MicroscopioSOPTOPSZMT1
Monitor de signos vitales no invasivoMouseox
Micromanipulador hidráulico de aceiteNARISHIGE International Ltd.PC-5N06022
Gel de ojos de vaselinaDezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd.17C801
Spike2Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino UnidoSpike2 Versión 9
Tijeras quirúrgicas66 Vision Tech Co., Ltd.54010
Tijeras quirúrgicas66 Vision Tech Co., Ltd.54002
Aguja de suturaNingbo Medical Co., Ltd3/8 arco 2.5 * 8
Electrodo de tungstenoFHC, IncL504-01B
XilocaínaHuaqing
AWG97028GM17064

Referencias

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