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Artículo de método

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

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DOI:

10.3791/60617

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20 de febrero de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo compilado para evaluar la infección cutánea de ratones con Leishmania amazonensis. Este es un método confiable para estudiar la virulencia del parásito, permitiendo una visión sistémica de la respuesta del huésped vertebrado a la infección.

Resumen

Leishmania spp. son parásitos protozoarios que causan leishmaniasas, enfermedades que presentan un amplio espectro de manifestaciones clínicas desde lesiones cutáneas hasta lesiones viscerales. Actualmente, se estima que 12 millones de personas están infectadas con Leishmania en todo el mundo y más de 1.000 millones de personas viven a riesgo de infección. La leishmania amazonensis es endémica en América Central y del Sur y generalmente conduce a la forma cutánea de la enfermedad, que se puede visualizar directamente en un modelo animal. Por lo tanto, las cepas de L. amazonensis son buenos modelos para estudios de leishmaniasis cutánea porque también se cultivan fácilmente in vitro. Los ratones C57BL/6 imitan la progresión de la enfermedad impulsada por L. amazonensisobservada en humanos y son considerados uno de los mejores modelos de cepas de ratones para la leishmaniasis cutánea. En el huésped vertebrado, estos parásitos habitan macrófagos a pesar de los mecanismos de defensa de estas células. Varios estudios utilizan ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar la infectividad del parásito en diferentes condiciones. Sin embargo, el enfoque in vitro se limita a un sistema celular aislado que no tiene en cuenta la respuesta del organismo. Aquí, compilamos un método de infección murino in vivo que proporciona una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito. El protocolo detallado para la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis comprende la diferenciación de parásitos en amastígolos infecciosos, la inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, el desarrollo de lesiones y la determinación de la carga del parásito. Proponemos este método bien establecido como el método más adecuado para los estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la leishmaniasis cutánea.

Introducción

Las leishmaniases son enfermedades infecciosas parasitarias prevalentes en todo el mundo que representan importantes desafíos en los países en desarrollo y son reconocidas como una de las enfermedades tropicales desatendidas más importantes por la Organización Mundial de la Salud1,2. Las leishmaniasas se caracterizan por manifestaciones cutáneas, mucosas y/o viscerales. La leishmaniasis cutánea suele ser causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica y L. aethiopica3. Esta forma de la enfermedad es a menudo la autorreparación en los seres humanos debido a la inducción de la respuesta inmune celular protectora. Sin embargo, la respuesta inmune celular puede fallar, y la enfermedad puede progresar a leishmaniasis cutánea diseminada4,5. No hay vacuna disponible debido a la diversidad entre las especies de Leishmania y a los antecedentes genéticos del huésped6,7. Las opciones de tratamiento también son limitadas, ya que la mayoría de los medicamentos disponibles actualmente son caros, tóxicos y/o pueden requerir tratamiento a largo plazo8,9. Además, ha habido informes de resistencia a los medicamentos contra los tratamientos disponibles10,11.

El agente causal de las leishmaniases es el parásito protozoario Leishmania. El parásito presenta dos formas morfológicas distintas en su ciclo de vida: los promastigotes, la forma flagelada que se encuentra en las moscas de arena; y amastigotes, la forma intracelular que se encuentra en las vacuolas parasitopóforas de los macrófagos huésped de mamíferos12,13. La capacidad de Amastigotes para invadir, sobrevivir y replicarse a pesar de los mecanismos de defensa de los macrófagos del huésped vertebrado están sujetos a muchos estudios14,15,16,17. En consecuencia, varios grupos de investigación han estado describiendo ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar el impacto de factores ambientales específicos, así como genes parásitos y de acogida en la infectividad del parásito. Este ensayo presenta varias ventajas, como la capacidad de adaptar los estudios a un formato de alto rendimiento, un período de tiempo relativamente más corto para obtener resultados y un número reducido de animales de laboratorio sacrificados18. Sin embargo, los resultados de los ensayos in vitro son limitados porque no siempre replican los estudios in vivo14,19,20,21. Los ensayos in vivo proporcionan una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito, que no puede ser completamente imitada por ensayos in vitro. Por ejemplo, los estudios inmunológicos se pueden realizar a través de ensayos inmunohistoquímicos de secciones de tejido de la almohadilla de pie recogidas o incluso de ganglios linfáticos popliteales para el análisis de las células inmunitarias recuperadas22.

Los animales se utilizan a menudo como modelo para las enfermedades humanas en la investigación biológica y biomédica para comprender mejor los mecanismos fisiológicos subyacentes de las enfermedades23. En el caso de la leishmaniasis, la ruta, el sitio o la dosis de inoculación influyen en el resultado de la enfermedad24,25,26,27. Además, la susceptibilidad y resistencia a la infección en humanos y ratones están altamente reguladas por los antecedentes genéticos del huésped y parásito4,5,22,28,29,30,31. Los ratones BALB/c son altamente susceptibles a la infección cutánea de L. amazonensis, mostrando una rápida progresión de la enfermedad con la diseminación de los parásitos a los ganglios linfáticos, el bazo y el hígado32. Como la enfermedad puede progresar a metástasis cutáneas, la infección puede ser mortal. Por el contrario, los ratones C57BL/6 a menudo desarrollan lesiones crónicas con cargas persistentes de parásitos en los ensayos de infección de L. amazonensis 33. Por lo tanto, la infección por L. amazonensis con esta especie de ratón en particular se ha considerado un excelente modelo para estudiar formas crónicas de leishmaniasis cutánea en humanos, ya que imita mejor la progresión de la enfermedad que la infección de ratones BALB/c modelo5,34.

Por lo tanto, proponemos que la infección murine in vivo es un método útil para los estudios fisiológicos de virulencia de Leishmania aplicables a la enfermedad humana, permitiendo una visión sistémica de la interacción huésped-parásito. Revisitando los ensayos bien establecidos22, presentamos aquí un protocolo paso a paso compilado de la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis que comprende la diferenciación del parásito en amastigotes axensicos, inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, desarrollo de lesiones y determinación de la carga del parásito. Este protocolo se puede adaptar a otras cepas de ratones y especies de Leishmania que causan leishmaniasis cutáneas. En conclusión, el método presentado aquí es crucial para identificar nuevas dianas y vacunasanti-Leishmania, así como en estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la infección por Leishmania.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Biociencia de la Universidad de Sao Paulo (CEUA 342/2019), y se llevaron a cabo de conformidad con las recomendaciones y políticas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Estado de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) y el gobierno brasileño (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todos los pasos descritos en las secciones 1-5 deben llevarse a cabo asépticamente dentro de armarios de flujo laminar. El equipo de protección personal debe utilizarse mientras se manipulan parásitos vivos de Leishmania.

1. In Vitro Diferenciación de L. amazonensis Promastigotes en Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

NOTA: En este ensayo se utilizó el parásito L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La). Dependiendo del propósito del estudio, la forma del parásito infeccioso se puede obtener ya sea mediante la purificación de la forma metacíclica utilizando un gradiente de densidad, como se describió anteriormente14,o por diferenciación de promastigotes en axensic amastigotes, de acuerdo con el siguiente protocolo.

  1. Cultivar La promastigotes en un matraz de cultivo de 25 cm2 células que contenga 10 ml de medio para promastigotes (pro-medio) (pH a 7,0).
  2. Incubar a 25oC durante 3 días.
    NOTA: Utilizar cultivos de promastigote que fueron pasados in vitro menos de 10veces para evitar la pérdida de virulencia y cambios aneuploidede de parásitos39,40,41,42,43,44.
  3. Pipetear 5 ml de cultivo de promastigote de fase de crecimiento logarítmico en un nuevo matraz de 25 cm2.
  4. Añadir 5 ml de medio para axenic amastigotes (ama-medium) (pH a 5,2).
  5. Incubar a 34oC durante 3-4 días.
  6. Divida el cultivo diluyendo con ama-medio en una proporción de 1:3 en un nuevo matraz de 25 cm2.
  7. Incubar a 34oC durante 3-5 días.
    NOTA: Incubar los axencinos avales durante un máximo de 5 días, ya que representa el final de la maduración37.

2. C57BL/6 Infección de la almohadilla con L. amazonensis

NOTA: Las hembras de ratones C57BL/6 (6-8 semanas de edad) fueron obtenidos y mantenidos en el Centro Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sao Paulo. Los animales recibieron comida y agua ad libitum.

  1. Contar el cultivo de axenéticos anunciantes transfiriendo una alícuota de la suspensión del parásito diluida en PBS a una cámara Neubauer (es decir, hemocitómetro). Contar los parásitos no flagelados, que representan formas de amastigotes.
    NOTA: Alternativamente, el azul Trypan (1:1) se puede utilizar para contar el número de acomodatos viables (es decir, aquellos que no están manchados con el azul de Trippan).
  2. Diluir los axenic amastigotes en PBS de acuerdo con la dosis de inóculo deseada y se recomienda el número de inóculos previstos (1 x 106 axenic amastigotes en 50 l de PBS se recomienda).
  3. Cargue una jeringa de tuberculina con una aguja de 27 G con la suspensión del parásito preparada.
  4. Anestetizar un ratón C57BL/6 usando 3-5% isoflurano, según lo recomendado por johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Evalúe la profundidad anestésica probando la respuesta del ratón a un pellizco del dedo del dedo del dedo del ratón.
  5. Inocular 50 l de la suspensión homogeneizada del parásito (1 x 106 amastigotes axenicos o la dosis de inóculo deseada) en el tejido subplantar de la almohadilla trasera izquierda, utilizando la jeringa de tuberculina previamente cargada (paso 2.3).

3. Desarrollo de lesiones en el padel de ratón

  1. Mida la progresión de la lesión una vez a la semana midiendo el grosor de las almohadillas izquierda (infectadas) y derechas (no infectadas) utilizando una pinza.
  2. Calcule semanalmente la diferencia de grosor entre las almohadillas traseras izquierda y derecha para evaluar la progresión de la lesión.
  3. Trazar las diferencias calculadas en el eje Y y el tiempo de infección en el eje X y calcular la significancia estadística.
    NOTA: De acuerdo con las recomendaciones de los Comités de Cuidado y Uso de Animales, los animales deben ser sacrificados antes de que la lesión infectada se ulcere, ya que las úlceras cutáneas pueden conducir a una infección secundaria. Como se muestra en la Figura Suplementaria 1, las lesiones tardan aproximadamente 10 semanas en presentar signos de ulceración con la dosis del parásito (106 axensic amastigotes) y la cepa huésped (C57BL/6) utilizada en este protocolo. Los ratones deben sacrificarse para la extracción de lesiones antes de que se observen los signos de ulceración.

4. Extracción de lesiones del reposapiés de ratones y dilución limitante del parásito

  1. Preparar una placa de 96 pocillos (parte inferior plana) para el ensayo de dilución limitante46,47 añadiendo 180 s de pro-medio a todos los pozos.
    NOTA: Utilice cuatro carriles de placas (la mitad de la placa) para cada animal, representando ensayos cuadrúpedos (es decir, animales 1 carriles A-D; animal 2 carriles E-H).
  2. Añadir 1 ml de pro-medio en un tubo molinillo de tejido de vidrio por lesión y pesar el tubo.
    NOTA: El tubo debe mantenerse estéril, así que utilice una tapa estéril y pese el tubo con la tapa cerrada, si pesa fuera del armario de flujo laminar.
  3. Sacrificar al animal en una cámara de CO2, siguiendo las recomendaciones de los Comités de Cuidado y Uso de Animales. Desinfectar el animal mediante la pulverización con 70% de etanol.
  4. Retusie el pie del animal en los talones para extraer la almohadilla infectada y rociar 70% etanol en la almohadilla para la desinfección. Asegurar la esterilización de tijeras y fórceps manteniéndolas empapadas en 70% de etanol.
  5. Coloque la almohadilla infectada en un plato estéril de Petri y diseccione con fórceps estériles y un bisturí para recoger todos los tejidos blandos. Descarta los huesos.
    NOTA: Se recomienda la uniformidad en el paso de disección para evitar la recuperación sesgada del tejido.
  6. Transfiera los tejidos recogidos al tubo molinillo de tejido de vidrio con pro-medio, luego pese el tubo de nuevo para determinar el peso de la lesión.
    NOTA: Evite colocar los fórceps y el bisturí directamente en el medio, ya que se pueden eliminar pequeños volúmenes, lo que resulta en un peso tisular subestimado. El peso de la lesión se calcula restando el peso del tubo que contiene pro-medio con el tejido recogido del peso del tubo que contiene sólo pro-medio.
  7. Homogeneizar el tejido 10veces utilizando la amoladora para una interrupción completa del tejido.
  8. Dejar sedimentar la mezcla durante 10 min, luego recoger 20 sl del sobrenadante.
  9. Cargue 20 l del sobrenadante en la1a columna del1er carril de la placa de 96 pozos preparada en el paso 4.1. Repita esto para que los siguientes tres carriles tengan cuadrúlicados para cada animal (es decir, para el animal 1 añadir 20 l a cada pocto y etiquetar A1, B1, C1 y D1).
  10. Homogeneizar cada pocal en la1a columna 10x utilizando una pipeta multicanal. A continuación, transfiera 20 l de las muestras diluidas de la1a columna a la2a columna.
    NOTA: Es importante homogeneizar cada pozo 10 veces de una columna a la siguiente.
  11. Repita el paso 4.10 a todas las columnasrestantes hasta la última columna (12th ) y deseche los 20 oL final de la muestra diluida.
    NOTA: Cambie las puntas después de cada dilución para evitar la contaminación cruzada.
  12. Sellar las placas con una película e incubar a 25oC durante 7 días en una cámara húmeda.

5. Determinación de la carga del parásito de la lesión

  1. Analizar las placas después de 7 días de incubación utilizando un microscopio invertido para determinar el último pozo que contiene parásitos para cada carril.
    NOTA: También es posible tener una indicación del crecimiento de los parásitos, o densidad celular, mediante el análisis visual de los cambios de color y la turbidez del medio.
  2. Calcule la carga de tejido del parásito para cada carril dividiendo el factor de dilución por peso de lesión.
    NOTA: En un carril específico, si los parásitos están presentes sólo en las columnas 1-5 (es decir, los pozos A1-A5 son positivos para el crecimiento del parásito), esto significa que la columna 5 contenía sólo 1 parásito, la columna 4 contenía 10 parásitos, y así sucesivamente, en múltiplos de diez. La columna 1 contendría 104 parásitos, que representa el número de parásitos en los 20 oL iniciales de sobrenadante (la muestra no diluida en el paso 4.7). Debido a que este 20 l se diluyó con 180 ol de pro-medio, el tubo inicial contenía 5 x 105 parásitos: (1 x 104) / (0,02 ml) a 5 x 105 parásitos/1 ml. A continuación, la carga del parásito en esa lesión se puede calcular dividiendo la concentración inicial del parásito por el peso de la lesión: (5 x 105) / peso de la lesión (ver paso 4.6).
  3. Trazar el promedio del resultado cuadrúpedo para cada animal con una escala Y de tronco.

6. Análisis estadístico

  1. Representar los datos como promedio - desviación estándar utilizando al menos cinco animales por grupo experimental como réplicas.
  2. Realice análisis estadísticos utilizando una prueba de dos colas no emparejada, considerando un valor p < 0.05 como significativo.

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Resultados

Los parásitos protozoos de leishmania existen en dos formas de desarrollo durante su ciclo de vida en huéspedes de invertebrados y vertebrados: promastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en el lumen de la mosca de la arena femenina; y amastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en las vacuolas parasitopóforas de las células huésped de los mamíferos. Los promastigotes tienen un cuerpo alargado de aproximadamente 1,5 m de ancho y 20 m de largo, con un f...

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Discusión

El ensayo de infección in vivo descrito en este protocolo permite a cualquier investigador evaluar la leishmaniasis cutánea in vivo teniendo en cuenta la interacción huésped-parásito en un escenario sistémico. Estos ensayos han sido utilizados por muchos grupos22,24,27,29,31,32,34,

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a la Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Cámara del Centro Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sao Paulo por el apoyo y a la Dra. Silvia Reni Uliana por proporcionar la trituradora de tejido de vidrio. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Sao Paulo (FAPESP - Beca MFLS' 2017/23933-3).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 96 pocillosGreiner bio-ne655180Una placa de fondo plano para limitar el ensayo
dilución adeninaSigmaA8626Suplemento añadido al calibrador de medios de cultivo celular M199
Mitutoyo700-118-20Un calibrador para medir el grosor del
matraz de cultivoCorning 353014Un matraz de cultivo celular de 25 cm2 volumen para cultivar centrífuga de parásitos Leishmania
Eppendorf5804RUn equipo utilizado para separar muestras en función de su densidad
CO2 incubadora 34 ° CThermo Scientific3110Una incubadora para etanol de diferenciación de amastigotes
MerckK50237083820Un desinfectante para artículos en general
suero fetal bovinoGibco12657-029Suplemento añadido a M199 medios de cultivo celular
tubo triturador de tejidos de vidrioThomas Scientific3431 E04Un tubo para recoger y alterar el tejido
infectado de las almohadillas de los piesglucosaSynthG1008.01.AHSuplemento añadido a los medios de cultivo celular M199
GraphPad Prism SoftwareGraphPadUn software utilizado para trazar los datos y calcular la significación estadística
heminSigmaH-2250Suplemento añadido a los medios de cultivo celular M199
HEPESPromegaH5303Suplemento añadido a la incubadora de medios de cultivo celular M199
25 ° CFanem347CDUna incubadora para el cultivo de promastigotes
microscopio invertidoNikonTMSUn equipo utilizado para analizar visualmente los cultivos de promastigotes y amastigotes
isofluranoUn anestésico inhalante para ratones (3-5%)
cabina de flujo laminarVecoVLFS-09Una cabina de bioseguridad utilizada para el área de trabajo aséptico
Célula M199 medio de cultivoGibco31100-035Un medio de cultivo celular para el cultivo de Leishmania
tubo de microcentrífugaAxygenMCT150CUn microtubo utilizado para la recogida, el procesamiento y el almacenamiento de muestras
pipeta multicanalLabsystemsF61978Una pipeta multicanal utilizada para el ensayo de dilución limitante
NaHCO3Merck6329Suplemento añadido a los medios de cultivo celular M199
NaOHSigmaS8045Suplemento añadido a los medios de cultivo celular M199
Cámara de NeubauerHBG2266Un hemocitómetro para contar la suspensión de parásitos
microscopio ópticoNikonE200Un equipo óptico utilizado para contar parásitos
parafilmBemis349Un plástico flexible y resistente para sellar el
placa de penicilina/estreptomicinaGibco15140122Suplemento añadido a los medios de cultivo celular M199
Placasde Petri TPP93100Un plato estéril para diseccionar el tejido de la almohadilla para los pies
Kit de pipetasGilson F167360Un kit de micropipetas que contiene cuatro pipetas (P2, P20, P200, P1000)
básculaQuimisBG2000Un equipo utilizado para pesar la almohadilla de pie recogida
Lesiones bisturíSolidor10237580026Un bisturí para cortar y recoger la almohadilla del pie
pipeta serológica de tejido 10 mLNest327001Una pipeta estéril utilizada para transferir volúmenes de mililitros
puntasAxygenUna punta de pipeta utilizada para transferir volúmenes de microlitros
Azul de tripánGibco15250-061Un colorante utilizado para contar parásitos viables
tripticasa peptonaMerckSuplemento añadido a M199 medio de cultivo celular
jeringa de tuberculinaBD 305945Una jeringa con aguja de 27G para inocular la suspensión del parásito
de celular

Referencias

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