Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

Este método detalla, de principio a fin, el procedimiento quirúrgico para generar tumores pancreáticos ortotópicos utilizando una cantidad mínima de material celular y la posterior disociación rápida de tumores establecidos para el análisis integral de la citometría de flujo de las poblaciones de células inmunitarias, incluyendo el análisis ex vivo de la función de células T.

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es un carcinoma agresivo con sólo el 8 % de los pacientes que sobreviven a 5 años^1. Dado que menos del 20 % de los pacientes son elegibles para la resección quirúrgica^2,las muestras de pacientes frescos no son fácilmente accesibles para la investigación y, por lo tanto, los modelos in vivo proporcionan herramientas esenciales para investigar esta enfermedad. Existen múltiples modelos murinos de PDAC: ortotópicos, subcutáneos, transgénicos, intravenosos y derivados del paciente (PDX), ampliamente descritos aquí³. El modelo ortotópico descrito aquí permite la inyección de células PDAC singénicas en el páncreas de ratones inmunocompetentes. Esto se puede realizar en grandes cohortes de ratones de tipo salvaje o mutante, y por lo tanto proporciona un modelo rentable y consistente para la comparación de agentes terapéuticos. Es importante destacar que el modelo ortotópico proporciona el microambiente cognado para el crecimiento de células tumorales y metástasis en nuestras manos y otros⁴ a sitios clínicamente relevantes (por ejemplo, hígado), haciéndolo más relevante clínicamente que los modelos subcutáneos o inducidos químicamente. Los tumores ortotópicos muestran características clave de PDAC, como una fuerte reacción desmoplástica con una abundancia de fibroblastos y la deposición de matriz extracelular⁵. Los modelos transgénicos de PDAC son el estándar de oro del modelo murino y el más utilizado es el modelo KPC, que expresa el mutante Kras^G12D/+ y Trp53^R172H/+ bajo el promotor Pdx-1-Cre 6 específico del páncreas. Los modelos adicionales de KPC y otros modelos de In vivo PDAC se revisan aquí⁷. Los ratones KPC desarrollan espontáneamente tumores pancreáticos con una progresión de la enfermedad que replica fielmente las características de PDAC⁶humano. Sin embargo, en cuanto a todos los modelos transgénicos, el programa de cría es costoso, la progresión tumoral es variable y, por lo tanto, a menudo requiere grandes cohortes de ratones. Los modelos PDX utilizan células tumorales derivadas del paciente o piezas que luego se cultivan ortopédicamente o más a menudo por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos. Los modelos Xenograft proporcionan herramientas útiles para el cribado de compuestos terapéuticos y tienen en cuenta la heterogeneidad del paciente. Sin embargo, no proporcionan un microambiente inmune completo, limitando así sus aplicaciones^8,9.

Una vez establecidos, los tumores ortotópicos suelen tardar alrededor de 1 mes o más en crecer (dependiendo de la línea celular utilizada) y forman tumores grandes que pueden ser fácilmente imageados por ultrasonido o RMN para realizar un seguimiento de la progresión y determinar la eficacia del tratamiento^4,5,10. Sin embargo, una vez en crecimiento exponencial, la última fase del crecimiento tumoral puede ser rápida, por lo que la mayoría de los regímenes de tratamiento se inician relativamente temprano (por ejemplo, 14 días)^11,12. El sistema inmunitario desempeña un papel crítico en el desarrollo tumoral, incluso en el PDAC, que se caracteriza por un infiltrado tumoral inmunosupresor con escasez relativa de células T y presencia frecuente de células mieloides^13. Una alta presencia de células T en PDAC confiere un mejor pronóstico^14,15. Sin embargo, como agentes individuales, los inhibidores del punto de control inmune que alivian la inmunosupresión de células T, como anti-CTLA-4¹⁶ y anti-PD-L1^17,no han mostrado beneficio clínico en pacientes con PDAC, probablemente porque la reactividad general de los tnéficos es muy baja. Sin embargo, los agentes que priman las respuestas de los células T, como el anti-CD40, pueden superar la resistencia anti-PD-L1/CTLA-4^18,19 y la vacunación con la vacuna primaria-CSF PDAC (GVAX) puede aumentar la inmunogenicidad de los tumores PDAC^20,lo que indica que la mejora de las respuestas a los células T forma una importante vía terapéutica.

La respuesta antitumoral de los linfocitos T es el reconocimiento de antígenos derivados de tumores a través del receptor de células T (TCR) y la posterior producción de citoquinas y gránulos citotóxicos. Mientras que el reconocimiento del antígeno de células T se puede determinar mediante la secuenciación de TCR, este enfoque es costoso y consume mucho tiempo. Sin embargo, la cuantificación de los subconjuntos de células T infiltrantes de tumores proporciona una buena indicación de una respuesta antitumoral. Un examen más profundo de la actividad de los células T ex vivo en términos de degranulación, producción de citoquinas y otros factores citotóxicos proporciona un análisis funcional más profundo. Estos ensayos se pueden realizar en muestras de tumores frescos y muchos parámetros de la función de los células T se pueden medir rápidamente mediante citometría de flujo.

Los células CD8⁺ y CD4⁺ T producen citoquinas como IFN y TNF para potenciar una respuesta inmune²¹. IFN induce la regulación del MHCI sobre las células diana, induce la diferenciación y el reclutamiento de células inmunitarias y ayuda a la muerte celular. La producción de IFN por células CD8⁺ T está bien caracterizada por formar parte de una respuesta antitumoral y se correlaciona con la regresión tumoral^22,23. El TNF es otra citoquina proinflamatoria producida por las células CD8⁺ y CD4⁺ T. Mejora la activación dependiente de TCR y la proliferación de células T, ayudando a la respuesta antitumoral. Tras el compromiso con TCR, los células cd8⁺ T citotóxicas pueden sufrir degranulación, donde los lisosomas secretores preformados que contienen moléculas citotóxicas se liberan en la sinapsis inmunológica para causar la degradación de las células diana^21. Estas moléculas incluyen Perforin, una proteína que se une a la membrana celular diana, formando poros que luego alteran la integridad de la membrana y permiten la difusión²¹ o endocitosis²⁴ de otras moléculas citotóxicas, como Granzyme B, directamente en el citoplasma de la célula diana. Granzyme B es una proteasa que promulga la degradación de múltiples proteínas dentro de la célula diana, lo que lleva a la muerte celular^21. La liberación de tales moléculas requiere exócitosis de endosomas a la superficie celular, donde el marcador endosomal CD107a (también conocido como LAMP-1) se incorpora transitoriamente a la membrana celular²⁵.

La medición de la secreción de citoquinas por células T requiere su aislamiento mediante la clasificación de células asistidas por flujo o ensayos de separación basados en cuentas, que no se pueden realizar fácilmente en un gran número de muestras simultáneamente. Sin embargo, la medición de citoquinas intracelulares no requiere ningún paso previo al aislamiento y se puede realizar fácilmente en varias muestras a la vez, lo que permite un enfoque de mayor rendimiento. Como las citoquinas son secretadas rápidamente por las células T, los niveles intracelulares pueden ser indetectables y por lo tanto la célula T requiere estimulación para aumentar la producción basal de citoquinas. Para evaluar la producción de citoquinas impulsada por antígenos, el antígeno reconocido por el TCR debe presentarse a la célula T mediante un APC in vitro cebado. En los casos en que no se conoce la especificidad del antígeno, se requiere un enfoque de estimulación amplio. La estimulación TCR se puede imitar utilizando perlas anti-CD3/28 que proporcionan activación de TCR y coestimulación, lo que induce la producción y proliferación de citoquinas. Sin embargo, una alternativa más rentable es el uso de PMA y ionomicina, que en conjunto activan ampliamente las vías de señalización que conducen a la síntesis y liberación de citoquinas intracelulares. Específicamente, pmA activa la proteína quinasa C (PKC) y la ionomicina aumenta los iones Ca²⁺ intracelulares, lo que conduce a una mayor señalización celular. Con el fin de preservar el contenido intracelular de citoquinas, esta estimulación se puede combinar eficazmente con inhibidores del transporte de proteínas brefeldina A y monensina, que bloquean las proteínas en el Golgi y así prevenir la liberación extracelular. El uso de PMA/ionomicina es un método bien establecido para estimular las células T y existe una fuerte correlación entre las citoquinas extracelulares e intracelulares^26. La estimulación de las células T con PMA y ionomicina también aumenta el tráfico de lisosoma a la membrana celular y por lo tanto CD107a se integra transitoriamente en la superficie celular antes de ser reciclado en la célula. Al incluir un anticuerpo anti-CD107a durante la estimulación, es posible utilizarlo como un marcador de la actividad de desgranulación²⁵.

Este método digiere rápidamente los tumores para proporcionar una suspensión de una sola célula. En este punto, las poblaciones individuales pueden ser teñidas directamente para la citometría de flujo o purificadas por métodos aguas abajo: clasificación de células asistidas por flujo o separación de perlas magnéticas. La preparación de una suspensión de una sola célula para el análisis de citometría de flujo permite el análisis de alto rendimiento de múltiples poblaciones de células inmunitarias y sus marcadores fenotípicos, proporcionando una cuantificación precisa del número de células inmunitarias y el fenotipo.

Por último, el protocolo de digestión descrito aquí previene la pérdida de marcadores de superficie celular y mantiene la viabilidad de las células inmunitarias, permitiendo que las células inmunitarias se sometan a más pasos de purificación celular y cultivo según sea necesario. Sin embargo, este método no ha sido probado para derivar células epiteliales de esta digestión.

Los tumores pancreáticos ortotópicos se generaron como se describió anteriormente¹⁰ de conformidad con la Ley de Procedimientos Animales y Científicos de la Oficina del Hogar del Reino Unido de 1986 y la Directiva Europea 2010/63/UE. Todos los ratones fueron monitoreados perioperatoriamente en busca de signos de dolor o sufrimiento, incluyendo pero no limitado a la pérdida de peso (> 15 % en 72 h o 20 % en un período dado), piloecimiento, estrechamiento de los ojos, marcha elevada, apariencia encorvada, así como de signos de infección de la herida incluyendo sangrado, enrojecimiento y ulceración. El crecimiento del tumor fue monitoreado por palpación, y también se monitorizaron signos clínicos adicionales como respiración laboriosa, ictericia y extremidades frías para evaluar si se habían alcanzado signos de punto final. Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en condiciones estériles. Todos los reactivos utilizados antes de la tinción de citometría de flujo deben prepararse en condiciones estériles.

1. Preparación de células tumorales para inyección

1. Tomar una alícuota de membrana de sótano a partir de -20 oC y colocar sobre hielo a 4 oC durante la noche.
   NOTA: La concentración de la membrana del sótano puede variar de un lote a otro; por lo tanto, los lotes de membranas de sótano específicos del lote deben probarse in vivo para garantizar la reproducibilidad. Un nuevo lote de membrana del sótano se descongela sobre hielo a 4 oC durante la noche y luego se alicot en alícuotas definidas por el usuario, sobre hielo, y luego se almacena en -20 oC hasta que sea necesario. Esto minimiza el pipeteo y la congelación-descongelación cuando se utiliza la membrana del sótano.
   1. Colocar el PBS estéril a 4 oC durante la noche para enfriar.
   2. Colocar las puntas de pipeta estériles de 200 oC y 1000 oC a -20 oC durante la noche para enfriar.
2. Utilizar células tumorales libres de micoplasma, cultivadas para al menos 2-10 pasajes después de la descongelación y en fase log de crecimiento antes de la cosecha. Este protocolo utiliza la línea celular derivada de la urtua femenina C57BL/6 KPC: TB32048 proporcionado como un regalo generoso por el laboratorio de David Tuveson.
   1. Cuando se requieran células tumorales para la cosecha, retire el medio del matraz y las células de lavado dos veces en PBS (precalentadas a 37 oC).
   2. Añadir 2x trippsina (precalentada a 37oC) al matraz durante 10 min a 37oC (a un matraz T175, añadir 5 ml).
   3. Después de 10 min, añadir un volumen igual de medio completo (10% FBS, 1x penicilina, 1x estreptomicina en DMEM) al matraz y disociar las células tocando suavemente el matraz y resuspendiendo bien en medio.
   4. Transfiera las células a un tubo y centrífuga durante 5 min a 300 x g y a temperatura ambiente (RT).
   5. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en un medio completo para el conteo celular.
   6. Células centrífugas de nuevo durante 5 min a 300 x g y RT, y retire el sobrenadante.
   7. Resuspender las células en PBS preenfriado para lograr una concentración de 1x10⁶ células/ml.
      NOTA: Esta concentración de stock está preparada para alcanzar una concentración final de inyección de 1000 células en 5 l. Encontramos la inyección de un menor número de células en un bajo volumen de inyección minimizando la fuga celular y por lo tanto mayor reproducibilidad sin embargo, el crecimiento tumoral puede depender de la línea celular por lo tanto los usuarios deben optimizar cada línea celular.
3. Junto a esto, coloque una alícuota de membrana de sótano pre-aliquoted, en hielo, en la capucha.
   1. La relación entre la solución final de la membrana del sótano, PBS y células tumorales en PBS preparadas para inyección es de 5:3:2. Por lo tanto, a una alícuota de 500 ol de membrana de sótano añadir 300 s de PBS preenfriado utilizando una punta de pipeta pre-enfriada de 1000 l.
   2. Agregue el PBS directamente a la alícuota de membrana del sótano para minimizar el pipeteo.
   3. Mantener el p1000 ajustado a 300 l y resuspender el PBS y la membrana del sótano, asegurándose de mantener el tubo en hielo para preservar la membrana del sótano en estado líquido.
   4. Cuando haya terminado de expulsar toda la membrana del sótano de la punta p1000, deje la punta en el tubo para permitir que cualquier membrana del sótano / PBS baje por la punta de la pipeta.
   5. Después de 5-10 min, expulse más membrana del sótano de la punta p1000 de nuevo en el tubo y deje que el tubo se sofoque en el hielo.
4. Tomar 200 l de células tumorales resuspendidas en PBS y añadir directamente a la membrana del sótano utilizando una punta de pipeta pre-enfriada de 200 l.
   1. Tome una punta de pipeta p1000 preenfriada fresca, ajuste la pipeta a 300 ol y resuspenda 30-40 veces. Una punta de pipeta más grande, establecida en un volumen bajo, es preferible ya que la membrana del sótano puede viajar por la punta y tocar el filtro de la punta de la pipeta durante la resuspensión.
   2. Las células tumorales están listas para la inyección. Mantenga la membrana de la célula tumoral/sótano en hielo durante la cirugía.

2. Inyección ortotópica de células tumorales

1. Aclimatar a los ratones en las instalaciones de animales durante 7 días.
   1. Alrededor de las 2 horas antes de la cirugía, afeitar el lado izquierdo del abdomen y la espalda, luego administrar el analgésico preoperatorio por vía subcutánea bajo el escracia del cuello (Buprenorfina a 50-100 g/kg).
   2. Prepare el campo quirúrgico, con una estera de calor para poner el ratón y las cortinas para el equipo circundante y sobre el ratón. Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas; preparar suficientes conjuntos de herramientas para cada ratón.
   3. Coloque el ratón en un 5% de isoflurano con cámara O₂ hasta que quede inconsciente.
   4. Transfiera el ratón, acostado boca abajo, en una estera de calor y mantenga la anestesia usando una máscara, generalmente en un isoflurano más bajo del 2-3%.
   5. Confirmar anestesia profunda; como se identifica por la pérdida del reflejo de retirada del pedal cuando la pata trasera es pellizcada y la frecuencia de respiración del monitor permanece constante.
   6. Cubra el cuerpo con cortina, con sólo la porción arasda expuesta. Asegúrese de que el ratón esté firmemente en la máscara de anestesia.
   7. Usando un bastoncillo de algodón estéril, agregue la solución de yodo en un movimiento circular sobre el área arasda: comenzando desde el centro y dando vueltas hacia el borde. Repita el proceso de nuevo con el bastoncillo de algodón fresco y el yodo.
2. Use el bisturí para hacer una incisión de 1 cm directamente por encima de la ubicación del páncreas/bazo (cuadrante superior izquierdo). Las tijeras estériles también se pueden utilizar para hacer la incisión, si se prefiere.
   1. Tire de la piel con fórceps. Con nuevos fórceps, localice la pared peritoneal y use tijeras para hacer otra incisión de 1 cm a través de la pared peritoneal.
   2. Extraiga el páncreas, que puede venir con el bazo, del cuerpo usando el segundo par de fórceps.
   3. Invierta suavemente el vial de células tumorales/membrana de sótano varias veces para mezclar.
   4. Prepare la jeringa de vidrio con 5 sL que contiene 1.000 células tumorales en la membrana del sótano y colóquela en la estera de calor durante unos segundos para permitir que se caliente.
      NOTA: El breve calentamiento de la jeringa permitirá que la membrana del sótano comience a solidificarse, con el fin de facilitar la inyección sin fugas. Sin embargo, esto debe mantenerse breve, si se deja demasiado tiempo la membrana del sótano se solidifique por completo y no se inyectará. El uso de una jeringa de vidrio permite inyectar con precisión un volumen bajo.
   5. Sostenga el páncreas en la cola para extenderlo e inserte la aguja directamente en el centro del páncreas, paralela al propio páncreas con un esfuerzo para evitar vasos sanguíneos visibles.
      NOTA: El centro del páncreas tiene un área grande y es más fácil de inyectar. Sin embargo, la cabeza o la cola del páncreas también se pueden inyectar específicamente si se prefiere.
   6. Inyectar lentamente 5 ml de membrana del sótano en el páncreas y mantener la aguja estable en el páncreas durante al menos 30 s después de la inyección para permitir que la membrana del sótano se solidifique y evite fugas. La membrana del sótano debe ser visible como una pequeña burbuja clara se habrá formado; sin embargo, puede que no sea visible.
      NOTA: Se pueden inyectar volúmenes más grandes de células tumorales/membrana de sótano; sin embargo, el volumen exacto debe ser probado para asegurar que no se produzcan fugas.
   7. Retire la aguja del páncreas y espere a confirmar que no se ha producido ningún sangrado. Inserte suavemente el páncreas de nuevo en la cavidad abdominal, teniendo cuidado de no tocar la burbuja de membrana del sótano.
   8. Tire de la pared peritoneal y realice una sola sutura, o dos suturas interrumpidas si es necesario.
   9. Tire de los dos lados de la incisión de la piel juntos y realice múltiples suturas interrumpidas según sea necesario o inserte dos clips quirúrgicos.
3. Administrar otra inyección subcutánea de buprenorfina en el escraco.
   1. Transfiera el ratón a una jaula calentada de 37 oC durante al menos 30 minutos después de la cirugía para mantener la temperatura corporal antes de transferirde de nuevo a una jaula nueva.
   2. Preparar una dieta de puré disponible en la jaula, para asegurar la rehidratación y el peso corporal.
   3. Vuelva a administrar la analgesia postoperatoria según lo recomendado y observe atentamente los signos de apertura de la herida, dolor o infección y pérdida de peso. Si se utilizan clips quirúrgicos, estos se pueden quitar 7-10 días después con un removedor de clip.
   4. Después de alrededor de 14 días el tejido cicatricial habrá sanado lo suficiente para comenzar a palpar el abdomen. Monitoree el tamaño del tumor de cerca a través de la palpación hasta que los ratones alcancen el punto final.
   5. En el punto final, el ratón se sacrifica mediante dislocación cervical seguida de decapitación. La piel y la cavidad peritoneal se abren con tijeras y el tumor del páncreas se extirpa con fórceps para sujetar el tumor, y tijeras para eliminar el tejido circundante.

3. Digestión de tumores pancreáticos

1. Coloque el tumor pancreático diseccionado, los tumores metastásicos del sitio o el tejido pancreático sano en PBS helado y guárdelo en hielo.
   1. Usa fórceps para transferir el tumor a un plato de Petri.
   2. Añadir 5,0 ml de medio de digestión (2 mg/ml de colatasa, 0,025 mg/ml de DNase RPMI) en un tubo de 50 ml; almacenar en hielo para evitar que la actividad enzimática se alemee.
      NOTA: Este protocolo utiliza la colagenasa tipo V, que tiene una actividad de 1 unidad/mg de FALGPA y > 125 unidades de digestión de colágeno (CDU)/mg sólidas. Las alícuotas de colagenasa y DNase se pueden almacenar a -20 oC y descongelarse sobre hielo antes de su uso. Cuando ambos están completamente solubilizados en RPMI estéril, se pueden pasar a través de un filtro de 0,2 m para eliminar contaminantes. La colagenasa debe estar completamente solubilizada antes de filtrar para evitar la pérdida de material.
   3. Tome una pequeña alícuota de esta solución para cubrir el tumor en el plato de Petri.
   4. Use bisturí estéril y fórceps para cortar el tumor en trozos pequeños, aproximadamente menos de 3 mm de longitud.
   5. Raspa las piezas tumorales en el tubo e invierte suavemente el tubo hasta que todas las piezas estén sumergidas en los medios de digestión. Almacenar en hielo si es necesario preparar otras muestras de tumores en un lote.
   6. Pasar a un dispositivo de agitación durante 20 minutos a 37 oC. Asegúrese de que todos los pedazos de tumor estén sumergidos y no pegados al borde del tubo. Si el temblor no es posible, entonces vórtice la muestra cada 5 minutos para ayudar a la digestión.

4. Preparación de la suspensión de una sola célula del tumor digerido

1. Inmediatamente después del paso de digestión, coloque el tubo en hielo para ralentizar la actividad enzimática.
   1. Añadir EDTA para lograr una concentración final de 20 mM y brevemente muestra de vórtice para mezclar. Esto ralentizará aún más la actividad enzimática.
   2. Abra el tubo y enjuague cualquier tumor digerir de la tapa del tubo con un medio RPMI fresco.
   3. Preparar un colador de 70 m (el tamaño del colador se puede modificar como desee) en un tubo abierto de 50 ml, en hielo.
   4. Humedezca previamente el filtro con un medio.
   5. Resuspenda las células digeridas y lave los lados del tubo con una stripette de 25 ml, o más grande. La abertura más ancha de la stripette es importante para permitir que el digerido grueso pase fácilmente.
   6. Transfiera todo el resumen, utilizando la stripette de 25 ml, al colador.
   7. Machaque el tumor en la parte superior del filtro con un émbolo de jeringa de 1 ml. Machaque solo directamente hacia arriba y hacia abajo para minimizar el estrés de cizallamiento a las células.
   8. Lave continuamente las células a través del colador con RPMI. Asegúrese de lavar con suficiente fuerza para empujar las células a través.
   9. Si todavía hay material que triturar, pero el RPMI deja de enjuagar a través, el colador se saturará. Por lo tanto, transfiera la muestra a un nuevo filtro y continúe.
      NOTA: Eventualmente sólo los componentes de la matriz extracelular permanecerán en el filtro, todas las celdas individuales deberían haber pasado a través.
2. Centrifugar el tubo durante 5 min a 300 x g y 4oC.
   1. Resuspenda cuidadosamente el pellet celular en RPMI completo y pase directamente a través de otro filtro para eliminar cualquier matriz extracelular o grumos de células grandes que no puedan ser resuspende adecuadamente.
   2. En este punto, si no se requiere estimulación, manseín inmediatamente las células aisladas para el análisis de citometría de flujo saltando al paso 6.1. Alternativamente, resuspenderlos en medio de congelación (10% DMSO en FBS) y almacenar a -80 oC seguido de almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido.
      NOTA: El paso de congelación puede permitir la purificación de las células inmunitarias en una fecha posterior; sin embargo, la cuantificación de subconjuntos de células inmunitarias puede requerir optimización para confirmar que los números de células y el fenotipo no se ven afectados por el proceso de congelación/descongelación. La estimulación de células T ex vivo se realiza mejor en muestras de tumores frescos. En este punto, la muestra puede purificarse aún más mediante la extirpación de células muertas a base de perlas o ensayos de enriquecimiento de células inmunitarias si es necesario.

5. Preparación de células para la estimulación ex vivo

1. Contar las células para alcanzar una concentración de 2 x 10⁶/ 100 l en medio completo (RPMI 10 % FBS, 1X penicilina y 1X estreptomicina).
   NOTA: El alto número de celdas totales chapadas asegura que habrá células T adecuadas dentro de esta muestra para analizar. Sin embargo, el número se puede escalar hacia arriba o hacia abajo dependiendo de la disponibilidad de la muestra y la rara naturaleza de los subconjuntos de células T de interés.
   1. Placa de 100 ml de células en una placa de 96 pocillos con fondo en U.
   2. Añadir 100 ml de medio completo que contenga una preparación 2x de PMA/ionomicina (para lograr una concentración final de 0,081 m y 1,34 m, respectivamente, según lo recomendado por el fabricante).
      NOTA: Si mide la desgranación/exocitosis, incluya aquí un CD107a antiratón conjugado fluorescentemente en el soporte. También se debe realizar una muestra de control que no contenga CD107a.
   3. Colocar en una incubadora de 37oC con 5% de_CO2 durante 1 h.
   4. Añadir 20 oL de una preparación 10x de brefeldina A y monensina (para lograr una concentración final de 1,06 m y 2,0 oM, respectivamente (según lo recomendado por el fabricante) en soportecompleto.
      NOTA: La brefeldina A y la monensina son inhibidores del transporte de proteínas y, por lo tanto, bloquean la liberación extracelular de citoquinas, etc. permitiendo su detección por citometría de flujo. Si se mide la liberación de citoquinas en el sobrenadante por ELISA o métodos similares – entonces este paso se puede omitir.
   5. Colocar la placa en una incubadora de 37oC con 5% de_CO2 durante 4 h más.

6. Tinción extracelular e intracelular para citometría de flujo

1. Retire la placa y resuspenda cada pocal para transferir todo el material a una placa con fondo en V, colocada sobre hielo.
   NOTA: Las células epiteliales, los macrófagos y otras células adherentes pueden no recuperarse completamente por resustitución. Sin embargo como el análisis descendente está solamente en las células T, esto no es un problema.
   1. 6.1.1 Centrifugar la placa durante 5 min a 300 x g y 4 oC (utilice estas condiciones para pasos posteriores a menos que se indique).
   2. Retire el sobrenadante moviendo la placa boca abajo en un movimiento nítido.
2. Resuspender en 50 l de un tinte de viabilidad fijable, preparado en PBS helado. Cuando vuelvaa a cargar, ajuste la pipeta a un volumen más bajo para evitar hacer burbujas.
   1. Incubar durante 20 min a 4oC, en la oscuridad.
   2. Paso de lavado: Agregue 100 l de tampón FACS, centrífuga y retire el sobrenadante.
3. Resuspenda cada pozo con 50 l de anti-CD16/CD32 (2,5 g/ml) en el búfer FACS (0,5 % BSA, 2,0 mM de EDTA en PBS) para bloquear la unión no específica de anticuerpos de detección a receptores Fc.
   1. Incubar durante 15 min a 4oC, en la oscuridad.
4. Agregue directamente a cada pozo una mezcla de 2 x mastermix de cd45, CD3, CD4 y CD8 conjugados con fluorocromo (se pueden agregar más marcadores extracelulares como se desee) en el búfer FACS.
   1. Incubar durante 30 min a 4oC, en la oscuridad.
   2. Paso de lavado: Agregue 100 l de tampón FACS, centrífuga y retire el sobrenadante.
5. Añadir 100 l de 1 búfer de fijación intracelular (IC) e incubar durante 30 minutos a RT, en la oscuridad.
   1. Preparen la centrífuga en RT.
6. Añadir 100 l de tampón FACS, centrífuga durante 5 min a 300 x g y RT y retirar el sobrenadante. Repetir con 1x tampón de permeabilización y centrífuga durante 5 min a 300 x g; a continuación, retire el sobrenadante.
7. Añadir 50 s de 1x mastermix de fluorocromo-conjugado anti-ratón IFN, TNF, y otros marcadores intracelulares preparados en 1x búfer de permeabilización.
   1. Incubar durante 1 h a RT, en la oscuridad.
   2. Añadir 100 l de tampón de permeabilización para lavar. A continuación, centrífuga durante 5 min a 300 x g y RT y quitar el sobrenadante.
   3. Añadir 100 l de tampón FACS para lavar, centrifugar durante 5 min a 300 x g y RT y retirar el sobrenadante.
8. Después de esta centrifugación final, resuspenda las celdas en un volumen compatible para el catómetro de flujo. Puede variar dependiendo del tamaño de los tubos FACS.
   1. Transfiera este volumen a tubos FACS apropiados para su adquisición.
   2. Cubrir de la luz y almacenar en la nevera y adquirir las muestras dentro de las 24 h.

Después de inyectar 1000 células TB32048 en el páncreas, los tumores ortotópicos tardan aproximadamente 30 días en desarrollarse(Figura 1A,B). La fuga de membrana del sótano durante la cirugía puede hacer que se formen tumores grandes directamente en la pared peritoneal, que son prominentemente visibles a través de la piel(Figura 1C). Eliminaríamos estos ratones del estudio. Sin embargo, con buenas habilidades quirúrgicas se minimiza la incidencia de fugas. Los tumores ortotópicos cosechados en la variable pueden crecer a un tamaño sustancial en ratones de tipo salvaje C57BL/6 (Figura 1D). Los tumores ortotópicos cosechados requieren digestión en colagenasa/DNase durante 20 min para lograr una suspensión de una sola célula(Figura 2). En este punto, las células derivadas del tumor se pueden placar en una placa con fondo en U a 2 x 106 células/bien. El número de células chapadas puede alterarse dependiendo de la prevalencia de células T dentro de la muestra; el número de celda se puede reducir si las células T están en una alta densidad. Las muestras de bazo de control o de ganglios linfáticos también se pueden placar en este punto para la estimulación. Cada pozo se estimula con PMA y ionomicina durante 5 h y después de 1 h de incubación, se añaden brefeldina A y monensina con el fin de bloquear la liberación extracelular de citoquinas(Figura 2). Después de la incubación, las muestras se tiñen para los epítopos extracelulares y las citoquinas intracelulares para su análisis por citometría de flujo(Figura 2).

Se analizaron muestras de bazo y tumores de ratones portadores de tumores ortotópicos mediante citometría de flujo. La estrategia de gating utilizada en el análisis de citometría de flujo para los tumores del bazo y ortotópicos excluye los desechos que utilizan FSC-A, SSC-A, dobletes por FSC-A/FSC-H y SSC-A/SSC-W, luego células muertas o apoptóticas como positivas para el tinte de viabilidad fijable(Figura 3A). Las celdas inmunes se anegan como CD45+, y las células T se asantan aún más como CD3+ de las cuales se definen CD4+ y CD8+ subconjuntos(Figura 3A). Se realiza una fluorescencia menos uno (FMO) para determinar la fluorescencia de fondo para el gating y se realiza un control de brefeldina Sólo A/monensina para determinar la producción basal de citoquinas(Figura 3B-D).

En el caso de ifn, la incubación con brefeldina A/ monensina no dio lugar a un aumento de IFN sobre el control de la FMO tanto en muestras de bazo como de tumor. Sin embargo, la adición de PMA e ionomicina aumentó el porcentaje de IFN intracelular detectable en células CD4+ y CD8+ T esplénicas y derivadas de tumores.

Los células esplénicas CD4+ y CD8+ T, utilizadas como control positivo, tienen una producción de IFN relativamente mayor que los subconjuntos de células T que infiltran tumores, con una media de 6,60 a 1,5 % y 12,97 a 3,4 % en comparación con 4,81 a 1,0 % y 4,13 a 1,3 %, lo que indica que la inmunosupresión se produce dentro del tumor(Figura 3B y 4A). Usando la misma estrategia para El TNF, visualizamos que un alto porcentaje de células esplénicas CD4+ T son positivas para el TNF intracelular (65,93 a 2,3%), en comparación con las células CD4+ T que infiltran tumores (22,45 x 5,4%). Los células ESplénicas y tumorales CD8+ T producen niveles similares de TNF (25,15 a 3,7 % y 19,91 a 5,1 %, respectivamente)(Figura 3C, Figura 4B).

Finalmente, CD107a es un marcador endosomal que se expresa transitoriamente en la superficie celular durante la exocitosis de gránulos citotóxicos y citoquinas, como tal, se utiliza como un marcador suplente para la citotoxicidad. El beneficio de la tinción de CD107a durante la estimulación es que todo el CD107a expresado en superficie celular transitoria será capturado por el anticuerpo fluorescente. Los niveles basales de CD107a se muestran en células tratadas con brefeldina A/monensina solamente. Para los células CD8+ T esplénicas, la estimulación con PMA/ionomicina aumenta el nivel de CD107a detectado, con la regulación más fuerte en CD8+ células que fueron 23,95 a 3,5% CD107a+, en comparación con 5,8 a 1,9 % en CD8+ células que infiltran tumores, lo que indica que el CD8+ esplénico tenía una mayor tasa de degranación. Por otro lado, CD4 esplénico e infiltrante tumoral+ expresaron niveles comparables de CD107a 9,37 a 1,5 % y 11,50 a 1,8 %(figura 3D y 4C).

En general, estos resultados resaltan que los tumores ortotópicos se pueden generar a partir de la inyección de un número muy bajo (1.000) de células tumorales en el páncreas. Estos tumores se pueden digerir rápidamente para el aislamiento de las células T para la estimulación ex vivo. La detección de citoquinas intracelulares es posible y pone de relieve el nivel basal de inmunosupresión de los linfocitos T infiltrados, en comparación con las células T en los órganos linfoides secundarios.

Figura 1: Generación de tumores pancreáticos ortotópicos. (A) Lista de experimentos in vivo. (B) La apariencia macroscópica de los tumores ortotópicos dentro de la cavidad abdominal (izquierda) y después de la escisión (derecha) donde el tumor mostrado se ha cortado por la mitad. (C) La evidencia de fuga de membrana del sótano durante la cirugía puede hacer que se desarrollen tumores que son visibles a través de la piel (foto superior) y se forman en la pared peritoneal (foto inferior). (D) Pesos tumorales pancreáticos ortotópicos cosechados de ratones que habían alcanzado la variable (n-22). Cada punto de datos representa un ratón individual, el gráfico de barras muestra la media de SEM. Los datos de esta figura se han modificado a partir de la obra publicada anteriormente10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Esquema del procesamiento de tumores ortotópicos para la estimulación de células T ex vivo. Después de la cosecha, los tumores pancreáticos se digieren rápidamente en colagenasa (2 mg/ml) y DNase (0,025 mg/ml) durante 20 min a 37 oC. Después de esto, las celdas se resuspenden a 2 x 106/mL en medios RPMI completos y se chapan en una placa con fondo en U. Se añade un cóctel de estimulación de PMA e ionomicina durante 5 h, momento en el que también se puede añadir al cultivo el anticuerpo antiratón CD107a. Después de 1 h de incubación se añaden los bloqueadores de transporte intracelular, brefeldina A y monensina. Después de la estimulación ex vivo, las células se transfieren a una placa con fondo en V para la tinción con el tinte de viabilidad fijable (en PBS) durante 20 min 4 oC. Las células se lavan en tampón FACS y se incuban en anti-CD16/32 (bloque FcR) durante 15 minutos (en tampón FACS) y luego se incuban con anticuerpos fluorescentes conjugados extracelulares durante otros 30 minutos (en búfer FACS). Las células se lavan de nuevo en el búfer FACS y se resuspenden en el búfer de fijación intracelular durante 20 min. Después de esto, las células se lavan una vez en el búfer FACS y una vez en 1x búfer de permeabilización. Las células se resuspenden durante 1 h a RT en anticuerpos fluorescentes conjugados intracelulares durante 1 h (en 1 x tampón de permeabilización). Las celdas se lavan una vez en 1x búfer de permeabilización y una vez en el búfer FACS antes de volver a serinminente en el búfer FACS para la adquisición en el citómetro de flujo dentro de 24 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de citometría de flujo de células T estimuladas ex vivo y células T derivadas de tumores. (A) Estrategia de gating de citometría de flujo utilizada para muestras de bazo (control positivo) y tumores ortotópicos. Las células son discriminadas de escombros usando FSC-A/SSC-A y las células individuales se aíslan aún más usando FSC-A/FSC-H y SSC-A/SSC-W. Las células muertas o apoptoticas se excluyen utilizando el tinte de viabilidad fijable -FVD506 y las células inmunitarias están activadas por CD45+. Siguiendo este CD3+ T se definen las celdas CD4+ y CD8+. Los datos fueron adquiridos en un BD Fortessa. (B) La estrategia de gating utilizada para cuantificar las células IFN+ CD4+ y CD8+ T. Se utiliza un control fluorescente menos uno (FMO) en muestras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldina A/monensina) para determinar la fluorescencia de fondo. Un control de brefeldina Sólo A/monensina (sólo B+M) se utiliza para determinar la producción basal de citoquinas. La muestra totalmente estimulada se utiliza para calcular el % de células IFN+ T. (C) La estrategia de gating utilizada para cuantificar las células TNF+ CD4+ y CD8+ T. Se utiliza un control FMO en muestras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldina A/monensina) para determinar la fluorescencia de fondo. Un control de brefeldina Sólo A/monensina (sólo B+M) se utiliza para determinar la producción basal de citoquinas. La muestra totalmente estimulada se utiliza para calcular el % de células TNF+ T. (D) La estrategia de gating utilizada para definir las células CD107a+ CD4+ y CD8+ T. Se utiliza un control FMO en muestras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldina A/monensina) para determinar la fluorescencia de fondo. Un control de brefeldina Sólo A/monensina (sólo B+M) se utiliza para determinar la degranulación basal. La muestra totalmente estimulada se utiliza para calcular el % DE células CD107a+ T. Todos los datos de citometría de flujo se analizaron en FlowJo Versión 10.6.1. Los datos de esta figura se han modificado a partir de la obra publicada anteriormente10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cuantificación de la actividad de células T ex vivo bazo y tumores. La proporción de células CD4+ y CD8+ T positivas para (A) IFN+ (B) TNF+ y (C) CD107a+ se cuantificó en el bazo (n-4) y el tumor (n-7) de los ratones portadores de ortotópicos-tumores. Cada punto de datos representa una media de visualización individual del ratón y de las barras de error : SEM. La significancia estadística se ha probado mediante una prueba t no emparejada en la que * . Todos los datos fueron analizados usando Prism 8. Los datos de esta figura se han modificado a partir de la obra publicada anteriormente10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.