Artículo de método

Sistema de cocultura multidimensional para modelar la progresión del carcinoma escamoso pulmonar

DOI:

10.3791/60644

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17 de marzo de 2020

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1Oncology R&D group, Pfizer Worldwide Research and Development

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se desarrolló un sistema modelo in vitro para capturar los cambios arquitectónicos del tejido durante la progresión del carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) en un cocultivo tridimensional (3D) con fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Este sistema organoide proporciona una plataforma única para investigar las funciones de diversos cambios tumorales-intrínsecos y extrínsecos que modulan el fenotipo tumoral.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las interacciones tumor-stroma desempeñan un papel crítico en el desarrollo de carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). Sin embargo, entender cómo estas interacciones dinámicas contribuyen a los cambios arquitectónicos de tejido observados durante la tumorigenesis sigue siendo difícil debido a la falta de modelos apropiados. En este protocolo, se describe la generación de un modelo de cocultivo 3D mediante un cultivo de células primarias LUSC conocido como TUM622. Las células TUM622 se establecieron a partir de un xenoinjerto derivado del paciente LUSC (PDX) y tienen la propiedad única para formar estructuras similares a los acinares cuando se sembran en una matriz de membrana del sótano. Demostramos que TUM622 acini en la cocultura 3D recapitulan las características clave de la arquitectura de tejidos durante la progresión del LUSC, así como las interacciones dinámicas entre las células LUSC y los componentes del microambiente tumoral (TME), incluyendo el extracelular (ECM) y fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Adaptamos además nuestro protocolo principal de cultivo 3D para demostrar cómo se podría utilizar este sistema para diversos análisis posteriores. En general, este modelo organoide crea una plataforma biológicamente rica y adaptable que permite obtener información sobre los mecanismos celulares intrínsecos y extrínsecos que promueven la interrupción de las arquitecturas epiteliales durante la progresión del carcinoma y ayudarán a la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y marcadores de diagnóstico.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. El carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que es el segundo tipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y representa aproximadamente el 30% de todo el cáncer de pulmón, a menudo se diagnostica en etapas avanzadas y tiene un mal pronóstico1. Las opciones de tratamiento para los pacientes con LUSC son una necesidad importante no satisfecha que puede mejorarse mediante una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes que impulsan la tumorigenesis de LUSC.

Al igual que con la mayoría de los cánceres humanos, la patogénesis de LUSC se caracteriza por la interrupción de la arquitectura intacta y bien ordenada del tejido epitelial2. Durante este proceso, se pierden los contactos adecuados de polaridad celular apical-basal, célula salcelular y matriz celular, lo que permite un crecimiento incontrolado y un comportamiento invasivo de las células tumorales. Ahora se aprecia ampliamente que las características malignas de las células cancerosas no pueden manifestarse sin una interacción importante entre las células cancerosas y su microambiente tumoral local (TME)3. Componentes clave en el TME, incluyendo la matriz extracelular (ECM), fibroblastos asociados al cáncer (CAP), así como células endoteliales e infiltración de células inmunitarias dan forma activa al TME y controla la tumorigenesis4. Sin embargo, nuestra comprensión actual de cómo las células tumorales y estos componentes clave en el TME interactúan para impulsar los cambios arquitectónicos de tejido durante la progresión de LUSC es muy limitada.

El cultivo tridimensional (3D) es una herramienta importante para estudiar las actividades biológicas de los cambios celulares-intrínsecos y extrínsecos en la regulación de los cambios arquitectónicos de tejidos en los tejidos normales y enfermos5. Las culturas 3D proporcionan el contexto estructural y funcional adecuado que generalmente falta en las culturas bidimensionales tradicionales (2D). Las dimensiones añadidas de estos sistemas imitan más de cerca el tejido in vivo en muchos aspectos de la fisiología celular y los comportamientos celulares, incluyendo la proliferación, diferenciación, migración, expresión de proteínas y respuesta al tratamiento farmacológico. En los últimos años, los esfuerzos de varios laboratorios han llevado al desarrollo de modelos 3D in vitro tanto para el pulmón normal como para NSCLC6,7,8. Sin embargo, no estaba disponible un modelo para el carcinoma escamoso pulmonar que puede recapitular tanto los cambios arquitectónicos de tejido dinámico durante la tumorigenesis como incorporar componentes estromales clave.

Aquí, describimos los métodos para establecer un nuevo sistema de cocultura tridimensional (3D) utilizando células LUSC derivadas de PDX primarias (llamadas TUM622) y CAFs9,10. Tanto TUM622 como CAFs se derivan de un paciente NSCLC con tumores mal diferenciados10. Cuando se incrustan como células individuales en ECM, una subpoblación rara de células TUM622 tiene la capacidad de formar organoides con estructuras similares a los acinares que muestran la polaridad celular apical-basal adecuada. Estas estructuras similares a los acinares son hiperplásticas, muestran una expresión heterogénea de marcadores similares a los tallos y diferenciación similares al tumor original, sin dejar de ser invasivos, y por lo tanto imitan la etapa más temprana del desarrollo de LUSC. Es importante destacar que mostramos que la arquitectura tisular de las estructuras similares a los acinares podría ser alterada por la inhibición de las vías de señalización intrínsecas celulares con inhibidores de moléculas pequeñas o la adición de componentes clave en el ECM como los CIF, el último de los cuales mejora la formación de acini y provoca aún más que el acini se vuelva invasivo cuando está cerca. En conjunto, estos datos sugieren que este sistema de cocultivo 3D de organoides LUSC proporciona una plataforma valiosa para la investigación de la reciprocidad dinámica entre las células LUSC y el TME y podría adaptarse para monitorear la respuesta de las células LUSC al tratamiento farmacológico11.

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Protocolo

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1. Pasar y cultivar células TUM622 y CAFs en cultivos 2D

  1. Pasar y cultivar células TUM622
    1. Reactivos cálidos de disociación de células y medios de cultivo 3D (ver Tabla de Materiales)para células TUM622 a 37oC.
    2. Pasaje de las células TUM622 al 80% de confluencia en matraces 2D. Por lo general, esto ocurre 1 semana después del passaging.
    3. Deseche el medio viejo de un matraz T75 y lave una vez con 6 ml de tampón HEPES. Evite pipetear directamente sobre las células.
    4. Aspirar el búfer HEPES. Añadir 4 ml de tripsina/EDTA (0,25 mg/ml, ver Tabla de materiales)para un enjuague rápido y desechar la trippsina/EDTA.
    5. Añadir 2 ml de trippsina/EDTA e incubar a 37oC durante 5 min. Retire los matraces de la incubadora y toque los matraces para aflojar las células sin crear burbujas de aire y devolver los matraces a la incubadora durante 5 minutos adicionales.
      NOTA: La exposición prolongada a la trippsina dañará irreversiblemente las células y alterará su fenotipo, por lo que se recomienda limitar el tiempo que las células están expuestas a la trippsina.
    6. Confirme que las células se han desprendido y disociado bajo un microscopio de luz (4x o 10x). Añadir 4 ml de búfer de neutralización (tampón TNS) (consulte la información del reactivo de subcultivos en la Tabla de materiales) seguido de 10 ml de medio de cultivo 3D (consulte Tabla de materiales).
    7. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para disociar aún más las células utilizando una pipeta de 10 ml. Transfiera la suspensión a través de un colador de células de 40 m en un tubo cónico de 50 ml.
    8. Cuente los números de celda usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
    9. Semilla 0,8 x 106 células/t75 matraz en 20 ml de medio de cultivo 3D (ver Tabla de materiales).
    10. Alimente las células cada dos días reemplazando la mitad del medio gastado por un medio fresco.
  2. Paseado y cultivo de LOS FED
    1. Pasaje DE los ARCHIVOS convierten cuando las células alcanzan la confluencia. Por lo general, esto ocurre después de 5 días de cultivo de una división 1:2.
    2. Prepare el medio CAF utilizando un medio basal RPMI con un 20% de suero bovino fetal inactivado por calor, un 1% de L-glutamina y un 1% de penicilina/estreptomicina. Calentar el medio a 37oC.
    3. En un matraz T75, enjuague los COF con solución salina con fosfato (PBS) una vez y luego agregue 2 ml de trippsina/EDTA e incubaa a 37oC durante 5 min.
    4. Observar bajo un microscopio de luz para asegurarse de que las células se han disociado en el matraz (4x o 10x). Si no es así, extienda la incubación durante otros 2-3 min.
    5. Una vez que las células se hayan separado y disociado, agregue 10 ml de medio de cultivo 3D para neutralizar la trippsina/EDTA y la pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar aún más los CAC.
    6. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml y gire hacia abajo a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de medio de cultivo 3D (ver Tabla de Materiales)y pasarlo a dos nuevos matraces T75.

2. Placado de células TUM622 en la matriz extracelular para el cultivo 3D

  1. El día antes del experimento, descongelar los viales de matriz de membrana del sótano en un refrigerador de 4 oC durante la noche. Pipetas de plástico de enfriamiento (2 ml) y puntas a -20 oC durante la noche.
    NOTA: No todos los lotes de matriz de membrana del sótano tienen la misma capacidad para apoyar el crecimiento 3D de las células TUM622. Por lo tanto, es necesario adquirir y probar múltiples lotes de matriz de membrana sótano para identificar aquellos que apoyan la formación robusta de acini. Por lo general, esto requiere una mayor concentración de proteínas (16-18 mg/ml) en la matriz.
  2. El día del experimento, medio de cultivo 3D cálido, tampón HEPES, trippsin/EDTA y tampón de neutralización de trippsina (TNS) en un baño de agua de 37 oC. Inmediatamente antes de configurar el cultivo, saque la matriz de membrana del sótano descongelada de la nevera y coloque el vial en hielo.
  3. Refresque las placas de cultivo de tejido en un enfriador de plataforma metálica colocado en hielo. Coloque los tubos de centrífuga en un estante de enfriamiento de metal sobre hielo.
  4. Usando las células TUM622 obtenidas del paso 1.1.7, calcule el número deseado de celdas necesarias para el chapado. Típicamente, 15,000-30,0000 células son necesarias por pozo de una placa de 24 pocillos. La densidad más baja es más adecuada para la toma de imágenes y la cuantificación, mientras que se prefiere una mayor densidad al recolectar células para la extracción de ARN o la hincha occidental.
  5. Transfiera la suspensión celular en un tubo centrífugo refrigerado (cada tubo que contiene células para chapado triplicado) y gire hacia abajo a 300 x g en una centrífuga de cubo colgante a 4 oC durante 5 min.
  6. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta aspirante unida a una punta sin filtrar (20 l), dejando aproximadamente 100 l del medio en el tubo (utilice las marcas en el tubo como guía).
  7. Toque suavemente en el lado del tubo para desalojar y disociar el pellet antes de devolverlo al bastidor de refrigeración.
  8. Con las pipetas preenfriadas de 2 ml, mezcle suavemente la matriz pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces mientras mantiene el vial en contacto con el hielo. Pipetear a una velocidad uniforme y moderada para que no se introduzcan burbujas en la matriz durante este procedimiento.
  9. Transfiera el volumen adecuado de la matriz a cada tubo centrífugo. Para triplicados de chapado en una placa de 24 pocillos, agregue 1,1 ml de matriz de membrana de sótano a cada tubo.
  10. Usando puntas preenfriadas, pipetee la matriz en cada tubo hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces para hacer una suspensión celular uniforme.
  11. Transfiera 310 l de suspensión de celda/matriz a cada pocal de una placa de 24 pocillos preenfriada. La pipeta se coloca en un ángulo de 90o con respecto a la superficie de la placa y la suspensión se añade al centro del pozo. La suspensión debe extenderse y cubrir todo el pozo sin necesidad de inclinar la placa.
  12. Para facilitar el análisis de inmunofluorescencia aguas abajo, placa relte la suspensión celular/matriz en paralelo en diapositivas de cámara de 2 pocillos. Transfiera 100 l de suspensión de celda/matriz al centro de un pozo de diapositivas de cámara de 2 pozos (ver Tabla de Materiales). Esto permite que la matriz forme una estructura similar a una cúpula con un volumen mucho más pequeño.
  13. Devolver la placa y la cámara a deslizarse de nuevo en una incubadora de cultivo de tejidoe e incubar durante 30 minutos para permitir que la matriz se solidifique. Examine la placa/deslizamiento bajo un microscopio de luz para asegurarse de que las células individuales se distribuyen uniformemente dentro de la matriz (4x o 10x).
  14. Añadir 1 ml de cultivo 3D precalentado medio completo en cada pocata y 1,5 ml de medio de cultivo 3D a cada pocal de la corredera de la cámara y luego devolverlos a la incubadora.

3. Cocultura 3D de células y CAF TUM622 en la matriz extracelular

  1. Preparar suspensiones celulares de TUM622 y CAF según la sección 2.
  2. Cuente la densidad celular de CAF tomando 10 s de suspensión celular y mezclándola con 10 s de color azul trypan.
  3. Añadir 10 l de la mezcla a cada una de las dos cámaras en un hemacitómetro para contar y calcular la densidad celular.
    NOTA: Los CAC tienen formas irregulares y es posible que no se cuenten con precisión en un contador de celdas automático.
  4. Co-incorporando células TUM622 y CAFs en la matriz de membrana del sótano
    1. En función de la información de densidad de celdas, calcule el número deseado de celdas utilizadas para el chapado. Los COF se sembran en una proporción de 2:1 de células TUM622. Por ejemplo, para 30.000 células TUM622 sembradas, 60.000 CRI se co-integran.
    2. Transfiera el volumen adecuado de TUM622, así como la suspensión celular de los COF en el mismo tubo de centrífuga y siga los pasos 2.5-2.11 para el chapado en placas de 24 pocillos. Para la inmunofluorescencia, transfiera 60 ml de mezcla de TUM622/CAP a portaobjetos de cámara como se describe en el paso 2.12).
  5. Coculturándose TUM622 con CAFs superpuestos en matriz de membrana de sótano (ver Tabla de Materiales)
    1. Configure el monocultivo TUM622 según los pasos 2.5-2.13.
    2. Transfiera el doble de la suspensión de CAF (en comparación con el número de células TUM622 sembradas) en un tubo de centrífuga y gire hacia abajo a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    3. Aspirar el sobrenadante y resuspender los COF en 1 mL de medio de cultivo 3D.
    4. Transfiera la suspensión de 1 ml de CAF al pozo que contiene las células TUM622 integradas.

4. Cosecha de TUM622 Acini para la extracción de ARN/proteína y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

  1. Preparar el tampón de lavado y el tampón de cosecha celular de acuerdo con el protocolo del kit de cosecha de células 3D el día anterior y enfriar durante la noche a 4 oC.
  2. Mantenga las placas en un enfriador de placas y otros reactivos en hielo antes de iniciar el proceso de extracción.
  3. Aspirar los medios de los pozos de cultivo 3D sin tocar la matriz y lavar suavemente el pozo 3 veces con 1 ml de tampón de lavado.
  4. Aspirar el lavado final y añadir 1 ml de tampón de cosecha celular a cada poca.
  5. Utilice una punta de pipeta p1000 para raspar la matriz de cada poca.
  6. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar aún más la matriz.
  7. Transfiera 1 ml de la mezcla a un tubo cónico pre-enfriado de 15 ml. Añadir otro 1 ml de tampón de cosecha al mismo pozo.
  8. Repita los pasos 4.5-4.7 y transfiera toda la mezcla del mismo pozo en un tubo cónico de 15 ml.
  9. Tapar los tubos y la roca a 4oC durante 30 min.
  10. Llene cada tubo con PBS helado de hasta 10 ml y luego centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4 oC.
  11. Aspirar al sobrenadante sin tocar el pellet. El sobrenadante debe contener fragmentos de matriz, pero todos los esferoides deben recogerse en la parte inferior del tubo.
  12. Agregue PBS helado para un segundo lavado. Invierta el tubo varias veces para disociar el pellet. Gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min.
  13. Durante el hilado, prepare el tampón de lisis para la recolección de proteínas y ARN.
  14. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y añadir tampón de lisis para el procesamiento aguas abajo para recoger proteína o ARN. Alternativamente, las celdas podrían ser resuspendidas para el análisis de flujo/clasificación FACS o el passaging serial.

5. Inmunofluorescencia de TUM622 Acini

  1. Preparar tampón de inmunofluorescencia (buffer IF: PBS con 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,2% Triton X-100 y 0,05% Tween-20), tampón de bloqueo primario (tampón IF con 10% de suero de cabra), tampón de bloqueo secundario (buffer de bloqueo primario con 20 g/ml de cabra antiratón F(ab')2)
  2. Aspirar el medio de los portaobjetos de la cámara de 2 pocillos, enjuague una vez con PBS y ponga el portaobjetos en el enfriador de placas metálicas sobre hielo. El portaobjetos de la cámara debe permanecer en el enfriador de la placa metálica para el resto del protocolo.
  3. Añadir pre-enfriado 4% PFA para fijar el acini e incubar en hielo durante 20 min.
  4. Retire 4% PFA y lave tres veces con 2 ml de PBS pre-enfriado cada uno durante 5 minutos con un suave balanceo en un balancín.
  5. Aspirar PBS y permeabilizar con 1,5 ml de 0,5% De Tritón X-100 en PBS (pre-enfriado) durante 20 min. Al final de este procedimiento, la estructura de dome se aflojará.
  6. Aspirar suavemente el búfer de permeabilización de la corredera de la cámara para evitar la pérdida de muestras. Esto se logra añadiendo una punta fina (20 l) a la pipeta aspirador y presionando la punta hacia la esquina de la cámara.
  7. Lavar tres veces con 2 ml de PBS pre-enfriado cada uno durante 5 minutos con un suave balanceo en un balancín.
  8. Bloquee la muestra con el búfer de bloqueo primario en hielo durante 1 h.
  9. Quite el búfer de bloqueo primario y agregue el búfer de bloqueo secundario y el bloque durante 30 minutos.
  10. Añadir anticuerpos primarios en el tampón de bloqueo primario e incubar durante la noche a 4 oC.
    NOTA: La concentración de los anticuerpos utilizados aquí debe ser mayor de lo que se utiliza normalmente para la tinción de células en el cultivo 2D. La mayoría de los anticuerpos primarios utilizados en este estudio se diluyen a 1:100 de dilución (ver Tabla de Materiales).
  11. Retire los anticuerpos primarios y lave la muestra 3 veces con 2 ml de tampón IF frío.
    NOTA: Las muestras podrían estar sueltas, tenga mucho cuidado al aspirar.
  12. Incubar las muestras en anticuerpos secundarios diluidos en tampón de bloqueo primario durante 1 h a RT. Los anticuerpos secundarios preferidos deben ser altamente adsorbidos para reducir la tinción de fondo. La mayoría de los anticuerpos secundarios utilizados en este estudio se diluyen a 1:200 de dilución.
  13. Retire los anticuerpos secundarios y lave la muestra 3 veces con 2 ml de tampón IF frío.
    NOTA: Las muestras podrían estar sueltas, tenga mucho cuidado al aspirar.
  14. Añadir PBS con DAPI (1:1,000 dilución) durante el último lavado para manchar el núcleo. Realizar otros 2 lavados en PBS.
  15. Imagen de las muestras en un microscopio confocal en un plazo de 3 días.
    NOTA: Debido al tamaño de los organoides y los límites en la distancia de trabajo del objetivo, las muestras generalmente se crean imágenes a una ampliación de 10x o 20x.

6. Preparación de muestras de cultivo 3D para la inmunohistoquímica

  1. Aspirar el medio de los portaobjetos de la cámara de 2 pozos y enjuaga una vez con PBS.
  2. Arreglar cultivos 3D en 4% PFA a 37 oC durante la noche.
  3. Retirar el 4% de PFA, rodear los cultivos con 2,5 ml de gel de muestra de histología (ver Tabla de Materiales)y colocar la diapositiva a 4oC para solidificar durante al menos 1 h.
  4. Transfiera muestras rodeadas de gel de muestra histológico a casetes de tejido y procesadas en un procesador automatizado de muestras de tejido durante la noche.
  5. Incruste muestras en cera de parafina y prepárese para el seccionamiento12.

7. Ensayo de citotoxicidad 3D para cribado compuesto (ejemplo para una placa de 96 pocillos)

  1. Ponga una placa de 96 pocillos en un enfriador de placas, un depósito de 25 ml en un refrigerador de depósito y un tubo cónico de 15 ml sobre hielo antes de iniciar el experimento.
  2. Preparar suspensiones de matriz celular de células TUM622 en un tubo cónico de polipropileno pre-enfriado de 15 ml añadiendo el volumen adecuado de matriz de membrana de sótano a las células. La densidad deseada para las células TUM622 es de 10.000 células por matriz de membrana de sótano de 70-75 l. Pipetear hacia arriba y hacia abajo un par de veces para permitir incluso la mezcla de células dentro de la matriz.
  3. Mueva la placa con el enfriador de placas y el depósito con un enfriador de depósito lejos del hielo a una superficie seca para evitar el contacto de la matriz de membrana del sótano con hielo durante la transferencia.
  4. Transfiera la mezcla de células de matriz al depósito de enfriamiento sin crear burbujas.
  5. Usando una pipeta mecánica multicanal (10-300 l), transfiera 70-75 l de las células de mezcla a cada poceto apropiado de una placa de 96 pocillos.
  6. Placa de incubación a 37oC y 5% CO2 durante 30 min para que la matriz de membrana del sótano se solidifique.
  7. Añadir 100 s de soporte en todas las filas y devolver la placa a la incubadora.
  8. Comience la dosificación compuesta al día siguiente o más tarde dependiendo del objetivo del experimento.
  9. Los esferoides se pueden volver a alimentar y volver a realizar la dosificación cada 2-3 días durante un máximo de 10 días, eliminando los medios gastados con un colector de vacío de 8 o 12 pozos y reemplazándolo con medios frescos con o sin compuestos deseados.
  10. El número de esferoides TUM622 podría cuantificarse utilizando el imager 3D de acuerdo con el protocolo del fabricante.

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Resultados

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TUM622 y CAC en la cultura 2D
La Figura 1 presenta la morfología típica de las células TUM622 y los CAC en el cultivo 2D. Las células TUM622 se redondean con núcleos grandes, mientras que los CAC son planos y alargados. Las células TUM622 pueden alcanzar una confluencia del 80%-90% en el cultivo. Una mayor proliferación conduce a más, pero las células más pequeñas agregadas en colonias que no entran en contacto directo. Por el contrario, l...

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Discusión

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Los tumores son tejidos heterogéneos compuestos de células cancerosas que coexisten lado a lado con células estromales como fibroblastos asociados al cáncer, células endoteliales y células inmunitarias dentro del ECM. Juntos, estos diversos componentes hablan cruzadamente e influyen en el microambiente tumoral, desempeñando un papel activo en la conducción de la tumorigenesis, un proceso que implica cambios progresivos en la arquitectura tumoral. Idealmente, un modelo in vitro de desarrollo tumoral debe ser capaz de capt...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores son empleados y accionistas de Pfizer Inc.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Magali Guffroy, John Kreeger y Stephani Bisulco del grupo Detopatología y Biomarcador de Pfizer-Oncología por su apoyo a la patología/histología y a Michael Arensman por la revisión crítica del manuscrito. También agradecemos al Programa Postdoctoral de Pfizer y al grupo de I+D oncológica, específicamente a Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin y Jennifer Tejeda por su apoyo al programa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
medio de crecimiento epitelial bronquialLonzaCC-3170BEGM
Filtro de células 40umThermoFisher352340Para el paso de células TUM622
Anticuerpo Caspasa 3 escindidoTecnología de señalización celular9661 (RRID:AB_2341188)Conejo
CoolRack CFT30BiocisionBCS-138Para cultivo 3D
CoolSink XT96FBiocisionBCS-536Para cultivo 3D
Cultrex Kit de recolección de células 3DBio-Techne3448-020-K
Cultrex (preferido para co-cultivo)Bio-Techne3443-005-01Para cultivo 3D
Anticuerpo CXCR4AbcamAb124824 (RRID:AB_10975635)Conejo
Anticuerpo E-cadherinaBD Biosciences610182 (RRID:AB_397581)Ratón
GelCountOxford OptronixPara recuentos y mediciones de Acini
Anticuerpo GM130BD Biosciences610822 (RRID:AB_398141)Suero
cabrade ratón Vector LabsS1000 (RRID:AB_2336615)Para inmunofluorescencia
FBS inactivado por calorGibco10082-147Para CAFs
Gel de muestras de histologíaRichard Allan ScientificHG-4000-012para inmunofluorescencia
Anticuerpo de integrina alfa 6Millipore SigmaMab1378 (RRID:AB_2128317)
Anticuerpo de involucrinaAbcamAb68 (RRID:AB_305656)
Anticuerpo Ki67AbcamAb15580 (RRID:AB_443209)Rabbit
Lab-Tec II con cámara #1.5 Sistema de cubreobjetos alemánNalge Nunc International155379 (2)Para la cultura 3D
Lab-Tec II con cámara #1.5 Sistema de cubreobjetos alemánNalge Nunc International155409 (8)Para cultivo 3D
L-GlutaminaGibco25030-081Para CAFs
Matrigel (preferido para monocultivo)Corning356231Para cultivo 3D
anticuerpo p63Tecnología de señalización celular13109 (SRRID:AB_2637091)Corral de conejo
EstreptococosGibco15140-122para CAFs
ReagentPack Reactivos de subcultivoLonzaCC-5034Para disociación celular TUM622
RPMIThermoFisher11875-093para CAFs
señalización celularanticuerpos Sox23579 (RRID:AB_2195767)Conejo
TrypLE ExpressGibco12604-021para disociación CAF
Vi-CellBechman CoulterContador automático de células
Anticuerpo de vimentinaAbcamAb92547 (RRID:AB_10562134)Conejo
β-anticuerpo de cateninaTecnología de señalización celular2677s (RRID:AB_1030943)Ratón
de de rata de ratón /Tecnología de de

Referencias

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  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
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