Se desarrolló un sistema modelo in vitro para capturar los cambios arquitectónicos del tejido durante la progresión del carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) en un cocultivo tridimensional (3D) con fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Este sistema organoide proporciona una plataforma única para investigar las funciones de diversos cambios tumorales-intrínsecos y extrínsecos que modulan el fenotipo tumoral.
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Artículo de método
Sistema de cocultura multidimensional para modelar la progresión del carcinoma escamoso pulmonar
En este artículo
Resumen
Resumen
Las interacciones tumor-stroma desempeñan un papel crítico en el desarrollo de carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). Sin embargo, entender cómo estas interacciones dinámicas contribuyen a los cambios arquitectónicos de tejido observados durante la tumorigenesis sigue siendo difícil debido a la falta de modelos apropiados. En este protocolo, se describe la generación de un modelo de cocultivo 3D mediante un cultivo de células primarias LUSC conocido como TUM622. Las células TUM622 se establecieron a partir de un xenoinjerto derivado del paciente LUSC (PDX) y tienen la propiedad única para formar estructuras similares a los acinares cuando se sembran en una matriz de membrana del sótano. Demostramos que TUM622 acini en la cocultura 3D recapitulan las características clave de la arquitectura de tejidos durante la progresión del LUSC, así como las interacciones dinámicas entre las células LUSC y los componentes del microambiente tumoral (TME), incluyendo el extracelular (ECM) y fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Adaptamos además nuestro protocolo principal de cultivo 3D para demostrar cómo se podría utilizar este sistema para diversos análisis posteriores. En general, este modelo organoide crea una plataforma biológicamente rica y adaptable que permite obtener información sobre los mecanismos celulares intrínsecos y extrínsecos que promueven la interrupción de las arquitecturas epiteliales durante la progresión del carcinoma y ayudarán a la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y marcadores de diagnóstico.
Introducción
El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. El carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que es el segundo tipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y representa aproximadamente el 30% de todo el cáncer de pulmón, a menudo se diagnostica en etapas avanzadas y tiene un mal pronóstico1. Las opciones de tratamiento para los pacientes con LUSC son una necesidad importante no satisfecha que puede mejorarse mediante una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes que impulsan la tumorigenesis de LUSC.
Al igua....
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Protocolo
1. Pasar y cultivar células TUM622 y CAFs en cultivos 2D
- Pasar y cultivar células TUM622
- Reactivos cálidos de disociación de células y medios de cultivo 3D (ver Tabla de Materiales)para células TUM622 a 37oC.
- Pasaje de las células TUM622 al 80% de confluencia en matraces 2D. Por lo general, esto ocurre 1 semana después del passaging.
- Deseche el medio viejo de un matraz T75 y lave una vez con 6 ml de tampón HEPES. Evite pipetear directamente sobre las células.
- Aspirar el búfer HEPES. Añadir 4 ml de tripsina/EDTA (0,25 mg/ml, ver Tabla de materiales)para un enjuague rápido y desechar la....
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Resultados
TUM622 y CAC en la cultura 2D
La Figura 1 presenta la morfología típica de las células TUM622 y los CAC en el cultivo 2D. Las células TUM622 se redondean con núcleos grandes, mientras que los CAC son planos y alargados. Las células TUM622 pueden alcanzar una confluencia del 80%-90% en el cultivo. Una mayor proliferación conduce a más, pero las células más pequeñas agregadas en colonias que no entran en contacto directo. Por el contrario, l.......
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Discusión
Los tumores son tejidos heterogéneos compuestos de células cancerosas que coexisten lado a lado con células estromales como fibroblastos asociados al cáncer, células endoteliales y células inmunitarias dentro del ECM. Juntos, estos diversos componentes hablan cruzadamente e influyen en el microambiente tumoral, desempeñando un papel activo en la conducción de la tumorigenesis, un proceso que implica cambios progresivos en la arquitectura tumoral. Idealmente, un modelo in vitro de desarrollo tumoral debe ser capaz de capt.......
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Divulgaciones
Los autores son empleados y accionistas de Pfizer Inc.
Agradecimientos
Agradecemos a Magali Guffroy, John Kreeger y Stephani Bisulco del grupo Detopatología y Biomarcador de Pfizer-Oncología por su apoyo a la patología/histología y a Michael Arensman por la revisión crítica del manuscrito. También agradecemos al Programa Postdoctoral de Pfizer y al grupo de I+D oncológica, específicamente a Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin y Jennifer Tejeda por su apoyo al programa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| medio de crecimiento epitelial bronquial | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Filtro de células 40um | ThermoFisher | 352340 | Para el paso de células TUM622 |
| Anticuerpo Caspasa 3 escindido | Tecnología de señalización celular | 9661 (RRID:AB_2341188) | Conejo |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | Para cultivo 3D |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | Para cultivo 3D |
| Cultrex Kit de recolección de células 3D | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferido para co-cultivo) | Bio-Techne | 3443-005-01 | Para cultivo 3D |
| Anticuerpo CXCR4 | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Conejo |
| Anticuerpo E-cadherina | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Ratón |
| GelCount | Oxford Optronix | Para recuentos y mediciones de Acini | |
| Anticuerpo GM130 | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Suero |
| cabra | de ratón Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | Para inmunofluorescencia |
| FBS inactivado por calor | Gibco | 10082-147 | Para CAFs |
| Gel de muestras de histología | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | para inmunofluorescencia |
| Anticuerpo de integrina alfa 6 | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | |
| Anticuerpo de involucrina | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | |
| Anticuerpo Ki67 | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II con cámara #1.5 Sistema de cubreobjetos alemán | Nalge Nunc International | 155379 (2) | Para la cultura 3D |
| Lab-Tec II con cámara #1.5 Sistema de cubreobjetos alemán | Nalge Nunc International | 155409 (8) | Para cultivo 3D |
| L-Glutamina | Gibco | 25030-081 | Para CAFs |
| Matrigel (preferido para monocultivo) | Corning | 356231 | Para cultivo 3D |
| anticuerpo p63 | Tecnología de señalización celular | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Corral de conejo |
| Estreptococos | Gibco | 15140-122 | para CAFs |
| ReagentPack Reactivos de subcultivo | Lonza | CC-5034 | Para disociación celular TUM622 |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | para CAFs |
| señalización celular | anticuerpos Sox2 | 3579 (RRID:AB_2195767) | Conejo |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | para disociación CAF |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Contador automático de células | |
| Anticuerpo de vimentina | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Conejo |
| β-anticuerpo de catenina | Tecnología de señalización celular | 2677s (RRID:AB_1030943) | Ratón |
Referencias
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Ma....
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Reimpresiones y permisos
