Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

Los ratones han servido como el organismo modelo clásico para el estudio de enfermedades humanas, incluyendo la neoplasia maligna. Como mamíferos, comparten muchas similitudes con los humanos. Su alto grado de similitud genética ha permitido la manipulación transgénica del genoma del ratón para proporcionar una enorme visión del control genético de las enfermedades humanas¹. La amplia experiencia en el manejo y la experimentación con ratones ha dado lugar a que sean el modelo de elección para la investigación biomédica. Sin embargo, además de las preocupaciones éticas y científicas con respecto a los modelos murinos, también pueden ser bastante costosos y llevar mucho tiempo^2,3. El desarrollo de tumores puede tomar semanas o incluso meses. La vivienda en una institución típica por sí sola puede correr en cientos a miles de dólares mientras se desarrollan los tumores. El cáncer de ovario es un ejemplo de este inconveniente porque su crecimiento en modelos murinos puede tomar fácilmente meses. Los retrasos en los progresos de la investigación pueden afectar a la tasa de supervivencia persistentemente baja de 5 años de los pacientes con cáncer de ovario, de sólo el 47% (es decir, un aumento de la supervivencia de sólo el 10% en 30 años)⁴. Del mismo modo, los cánceres urológicos (cáncer de riñón, próstata y vejiga) constituyen el 19% de todos los casos de cáncer en los Estados Unidos y el 11% de las muertes relacionadas con el cáncer⁴. Por lo tanto, un enfoque in vivo novedoso para estudiar los cánceres ginecológicos y urológicos podría ahorrar a un laboratorio tiempo considerable, trabajo y dinero, incluso si este modelo sólo se aplica a los experimentos de cribado iniciales. Además, la aceleración resultante de los resultados de la investigación podría afectar significativamente a las 177.000 personas diagnosticadas con estos tipos de cáncer anualmente.

El modelo CAM de pollo ofrece muchas ventajas que abordan los problemas antes mencionados. Un modelo popular para estudiar la angiogénesis^5,6, la invasión de células tumorales^7,8, y la metástasis^7,9, el modelo CAM embrionario pollito ya se ha utilizado para estudiar muchas formas de cáncer, incluyendo glioma^10,11,12, cabeza y cuello carcinoma de células escamosas^13,14, leucemia^15,16, cáncer de páncreas^17,y cáncer colorrectal¹⁸. Además, se han generado modelos CAM para neuroblastoma^19,linfoma Burkitt^20,melanoma²¹y fibrosarcoma felino^22. Estudios previos también han presentado injerto de cáncer de vejiga²³ y líneas celulares de cáncer de próstata^24,pero con detalles de protocolo limitados. No sólo los huevos son mucho más baratos que los ratones, sino que también producen resultados altamente reproducibles^25,26. Muestran un rápido desarrollo de la vasculatura, y el injerto tumoral puede ocurrir en tan solo unos días y visualizarse longitudinalmente a través de la ventana abierta. Con el plazo de 21 días entre la fertilización de óvulos y la eclosión, los experimentos se pueden completar en pocas semanas. Además, el bajo costo, las necesidades limitadas de vivienda y el pequeño tamaño permiten fácilmente experimentos a gran escala que serían prohibitivos para los estudios con ratones.

Por lo tanto, buscamos optimizar el modelo CAM para el injerto de cánceres ginecológicos y urológicos. Debido al estado inmunocomprometido del embrión de pollo temprano^27,tanto el ratón como las células humanas se pueden implantar fácilmente. Como tal, hemos injertado con éxito cánceres de ovario, riñón, próstata y vejiga. Para cada uno de estos tipos de tumores, el CAM acepta fácilmente las líneas celulares tumorales establecidas y/o humanas. Es importante destacar que los tejidos tumorales humanos primarios recién cosechados también pueden injertar de células digeridas o trozos de tejido sólido con altas tasas de éxito. Cada uno de estos tipos de cáncer y fuentes celulares requiere optimización, que compartimos aquí.

Todos los experimentos presentados aquí fueron revisados y aprobados por los comités éticos apropiados de la Universidad de California, Los Angeles (UCLA). El uso de tumores humanos primarios desidentificados ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UCLA (números de protocolo 17-000037, 17-001169 y 11-001363). En UCLA, no es necesario revisar el Comité de Investigación Animal para experimentos con embriones de pollo; la aprobación del protocolo sólo es necesaria cuando los huevos serán eclosionados. Sin embargo, las mejores prácticas, como las Directrices de AVMA para la Eutanasia de los Animales, se utilizaron para manejar los embriones de pollo de manera ética y evitar el dolor tanto como sea posible. Se insta a los investigadores a verificar los requisitos de supervisión en su institución antes de iniciar estudios utilizando modelos CAM.

1. Preparación de los huevos

1. Antes de recibir los huevos, ensamble y equilibre la incubadora de huevos a 37,8 oC (100 oF) con un 60-70% de humedad siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Para minimizar los riesgos de contaminación, se puede utilizar agua autoclave para controlar la humedad.
2. Al recibir huevos de pollo rojos fertilizados, Rhode Island de un proveedor certificado de huevos de laboratorio, seque la superficie de las conchas con toallas de papel. Se puede utilizar una toalla de papel ligeramente humedecida para eliminar el material adherido. Secar inmediatamente.
   NOTA: Humedecer la cáscara con líquido por debajo de 43,3 oC puede introducir bacterias en el huevo. Si se opta por lavar o desinfectar los huevos, la temperatura del líquido debe estar entre 43,3-48,9 oC. Las temperaturas más altas pueden hervir los huevos. La elección del desinfectante debe hacerse en función de los microorganismos que causan preocupación.
3. Use un lápiz o marcador para etiquetar la fecha en el huevo. Esto se considera día de desarrollo 0.
4. Colocar los huevos en la incubadora de óvulos e incubar durante al menos 7 días con rotación para permitir el desarrollo de CAM. Se puede utilizar un rotador automático, o los huevos pueden girarse 180o 2-3 veces al día.

2. Abrir los huevos

NOTA: La apertura de los huevos debe hacerse cuando el CAM se haya desarrollado completamente. Esto es típicamente en el día de desarrollo 7 u 8.

1. Desinfectar un armario de bioseguridad con 70% de etanol. Del mismo modo desinfectar y colocar en el gabinete de bioseguridad un estante de huevo, vela de huevo, marcador, herramienta rotativa inalámbrica con una piedra de molienda de carburo de silicio y rueda de corte circular, aguja de 18 G, controlador de pipetas con tubo de vacío de un cuarto de pulgada, cinta de embalaje, oficina tijeras, tijeras curvas, fórceps Semken (o similares), bolas de algodón y apósito de película transparente de 6 x 7 cm. Siempre que sea posible, utilice herramientas estériles, desechables o autoclavedas.
2. Apague el rotador de huevos. Coloque aproximadamente 1-3 huevos en el gabinete de bioseguridad en el estante de huevos. Mientras esté en la oscuridad, coloque la vela de huevo contra la cáscara de huevo para identificar la célula de aire. Marque la ubicación de la celda de aire.
   NOTA: La intensidad de la iluminación de la vela de huevo es crucial para visualizar el interior del huevo. Si la célula de aire o la vasculatura es constantemente difícil de ver, intente reemplazar las baterías de velas de huevo.
3. Mueva la vela de huevo sobre la cáscara para encontrar una gran red de vasos sanguíneos. Gire el huevo si es necesario. Una vasculatura ideal se ramificará cerca del centro del huevo. Utilice un marcador para dibujar sobre la vasculatura que se utilizará para la implantación.
4. Encienda la luz en el capó. Usando una herramienta rotativa inalámbrica equipada con una piedra de molienda de carburo de silicio, taladre un pequeño agujero en la cáscara directamente sobre el centro de la celda de aire. Taladre hasta que se haya eliminado la mayor parte de la cáscara, pero la membrana interna blanca está intacta.
   NOTA: La perforación sobre la célula de aire antes de apuntar a la vasculatura permite determinar el grosor de esa cáscara de huevo en particular sobre la celda de aire en lugar de sobre el CAM y la vasculatura. Si el CAM o vasculatura se interrumpe, entonces el óvulo no es útil para la implantación.
5. Taladre y abra otro pequeño agujero donde se abrirá la ventana vascular como se hizo para la célula de aire (paso 2.4).
6. Con una aguja de 18 G, perforar suavemente la membrana interna blanca sobre la célula de aire y la vasculatura. Si no puede penetrar la cáscara, entonces taladre cuidadosamente un poco más. Asegúrese de que la membrana blanca interna (pero no la CAM) se interrumpa a lo largo de toda la zona perforada. No es necesario retirar la pieza de membrana.
   NOTA: Si el CAM o la vasculatura se interrumpe durante este paso, deseche el huevo. El daño es evidente si hay sangre o albúmina goteando de un agujero perforado.
7. Apague la luz del capó. Usando la vela de huevo, verifique que la célula de aire fue transferida desde el extremo del huevo a la zona sobre la vasculatura. Si es necesario, coloque el tubo de vacío insertado en un controlador de pipeta alrededor del orificio sobre la celda de aire original y aplique suavemente la succión en ráfagas cortas para mover la celda de aire.
8. Utilice un marcador para delinear la nueva ubicación de la célula de aire aproximadamente 0,5 cm dentro del límite de aire-CAM. Fije un pedazo de cinta adhesiva justo sobre la nueva célula de aire. Si es necesario, utilice tijeras de oficina estándar para recortar la cinta a un tamaño adecuado.
   NOTA: La cinta puede interrumpir el flujo de aire a través de la carcasa y no debe ser mayor de lo necesario para cubrir completamente la célula de aire.
9. Devuelva los huevos a la incubadora para calentarlos sin rotación con la nueva célula de aire hacia arriba. Repita los pasos 2.2-2.9 para que se abran los huevos restantes.
   NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí. Si no está seguro de la calidad del desarrollo de CAM, un pequeño número de huevos debe proceder a través del paso 2.16 antes de abrir los huevos restantes.
10. Coloque aproximadamente 1-3 huevos con células de aire reubicadas en el estante de huevos en el gabinete de bioseguridad.
    NOTA: Se debe tener cuidado de no introducir contaminación en el óvulo abierto. Por lo tanto, siempre abra los huevos dentro de un gabinete de bioseguridad, y utilice herramientas y equipos estériles siempre que sea posible.
11. Usando una herramienta rotativa inalámbrica equipada con una rueda de corte circular, corte una pequeña línea sobre el límite de la celda de aire dibujada en el paso 2.8. Asegúrese de que esto esté aproximadamente 0,5 cm dentro del límite real aire-CAM para evitar interrumpir el CAM o la vasculatura. Cortar completamente a través de la cáscara, pero tenga cuidado de no penetrar profundamente lo suficiente como para interrumpir el CAM o vasculatura.
12. Usando tijeras curvas, corte alrededor de la celda de aire restante para crear una ventana en el vaciado.
    NOTA: Si hay sangre o membrana en la cáscara extraída, entonces el óvulo no es adecuado para la implantación. Si una alta proporción de los huevos no se abren limpiamente, considere esperar al menos 1 día adicional para abrir los huevos restantes para permitir una mejor formación de CAM. Si las cáscaras de los huevos restantes no han sido perforadas, se debe reanudar la rotación de los huevos dentro de la incubadora.
13. Verificar la viabilidad del embrión. Los embriones viables mostrarán una vasculatura extensa, albúmina clara, movimiento embrionario o latidos visibles.
14. Usando fórceps De semken, saque pequeños trozos de algodón de una bola de algodón estéril. Suelte suavemente la superficie CAM para eliminar el polvo y los desechos de la cáscara.
    NOTA: La retirada de escombros debe realizarse el mismo día en que se abren los huevos.
15. Cubra la abertura de la cáscara con una pieza de un cuarto de apósito de película transparente de 6 x 7 cm.
16. Devuelva los huevos a la incubadora. Asegúrese de que el huevo se siente firmemente con la ventana abierta hacia arriba y el CAM no toque el apósito de película transparente. Utilice un pedazo de estante de huevo, el borde del rotador de huevos u otro artículo adecuado para apuntalar cualquier huevo que siga rodando.
17. Repita los pasos 2.10-2.16 para que se abran todos los huevos restantes.
    NOTA: La apertura de los óvulos no necesita ser completada el mismo día de la implantación. Esperar al menos 1 día puede ayudar a eliminar los huevos cuya viabilidad se vio comprometida abriendo la cáscara.

3. Preparación de la suspensión de células cancerosas para el trasplante (opción 1)

NOTA: Esto debe completarse justo antes de la implantación, que idealmente debe tener lugar entre los días 7 y 10. Consulte las notas al principio de los pasos 5 o 6 para obtener más información sobre la fecha de implantación. Este enfoque se utilizó para todas las líneas celulares y digericiones tumorales de cáncer de riñón cultivadas.

1. Descongelar la solución de matriz extracelular en hielo.
2. Usando digestión mecánica y/o enzimática, obtenga una suspensión de una sola célula utilizando un método apropiado para el tipo de célula que se está implantando.
3. Resuspender el número total de células a implantar en un medio adecuado para la implantación. Los implantes de 1-2 x 10⁶ células por huevo son típicos.
   NOTA: El medio utilizado para la implantación de las líneas celulares es típicamente el medio completo utilizado para el cultivo de las células, que contiene FBS o reemplazo sérico. La implantación de los digeridos tumorales normalmente utiliza el medio completo utilizado para cultivar líneas celulares del mismo tipo de cáncer. Sin embargo, se pueden realizar ajustes en la formulación media si es necesario experimentalmente. Los efectos sobre el desarrollo y el crecimiento del tumor tendrían que determinarse empíricamente.
4. Peletizar las células utilizando una velocidad de centrífuga y el tiempo apropiado para las células que se utilizan. Las velocidades típicas son 250-300 x g,y los tiempos son 5-10 min.
5. Retire el sobrenadante de las células peletadas pipeteando. Resuspenda mecánicamente las células en el medio residual mediante parpadeo o pipeteo. Colocar sobre hielo para enfriar. Mida el volumen de las celdas y el medio utilizando una tubería de tamaño adecuado.
6. Calcular los volúmenes de implantación de tal manera que 1-2 x 10⁶ células se implantan en un volumen de 20-100 l por huevo con una concentración final de matriz extracelular de 2,7-4 mg/ml de proteína. Añadir medio, cualquier factor de crecimiento deseado o aditivos, y solución de matriz extracelular de acuerdo con este cálculo. Mantener en hielo hasta que esté listo para el implante.
   NOTA: Para los cálculos de los pasos 3.3 y 3.6, se debe incorporar un volumen adicional de al menos la mitad de implante de huevo para garantizar un volumen adecuado para todos los huevos del grupo. Para la implantación de las líneas celulares de cáncer de ovario (es decir, SKOV3 e ID8), se implantaron 10⁶ células por óvulo. Para la implantación de la línea de células del carcinoma de células renales RENCA, células cultivadas derivadas del carcinoma de células renales humanas primarias digeridas, líneas celulares de cáncer de próstata (es decir, CWR, C4-2 y MyC-CaP), y líneas celulares de cáncer de vejiga (es decir, HT-1376 y T24), se implantaron 2 x 10⁶ células.

4. Preparación de las piezas tumorales para su implantación (opción 2)

NOTA: Esto debe completarse justo antes de la implantación, lo que idealmente debe tener lugar entre los días 7 y 10. Consulte las notas al principio de los pasos 5 o 6 para obtener más información sobre la fecha de implantación. Los cánceres primarios de ovario y vejiga se implantaron como piezas tumorales.

1. Descongelar la solución de matriz extracelular en hielo. Diluir a una concentración final de proteína de 2,7-4 mg/ml en un medio adecuado que contenga los factores de crecimiento o aditivos deseados. Manténgase en hielo.
   NOTA: La implantación de piezas tumorales normalmente utiliza el medio completo utilizado para el cultivo de líneas celulares del mismo tipo de cáncer. Sin embargo, los ajustes en la formulación media se pueden hacer si es necesario experimentalmente. Los efectos sobre el injerto y el crecimiento tumoral tendrían que determinarse empíricamente.
2. Con un bisturí o tijeras, expulsa las piezas del tumor fresco. Los tamaños ideales varían de 2-5 mm en cada lado. Mantenga los tejidos sumergidos en el medio hasta que estén listos para el implante.

5. Implantación mediante un anillo antiadherente (opción 1)

NOTA: Las células se pueden implantar a partir del día de desarrollo 7 si el CAM está completamente desarrollado. La implantación puede ocurrir en cualquier momento antes de la eclosión que permita un tiempo adecuado para el desarrollo del tumor y el experimento deseado, pero tenga en cuenta que las células inmunitarias del embrión comienzan a estar presentes alrededor del día 10 después de la fertilización^27. La tasa de crecimiento del tumor varía considerablemente según el tipo de célula y debe determinarse empíricamente para el tipo de interés celular. El cáncer de ovario y las células del cáncer de próstata se implantaron utilizando el método de anillo antiadherente. Tenga en cuenta que cuando un anillo antiadherente no está disponible, una punta de pipeta se puede cortar a un tamaño similar y utilizarse.

1. Utilice 70% de etanol para desinfectar un gabinete de bioseguridad y todas las herramientas necesarias: un estante de huevo, fórceps de iris curvos, anillos antiadherentes (diámetro interior de 1/4 pulgadas), barra de agitación de vidrio, pipetas y puntas de volumen adecuadas, apósito de película transparente de 6 x 7 cm, tijeras de oficina y marcador o lápiz. Siempre que sea posible, se deben utilizar herramientas estériles, desechables o autoclave.
2. Coloque los huevos que se van a implantar en una rejilla de huevos en un gabinete de bioseguridad. Seleccione un número manejable de huevos. Hasta seis es típico. Evite dejar que los huevos se enfríen sustancialmente mientras trabaja con ellos.
3. Retire el apósito de película transparente de la cáscara rodando los bordes hacia la ventana abierta para evitar tirar de trozos de cáscara. Compruebe que los huevos son viables y saludables. Los huevos ideales tendrán un gran recipiente en el centro de la zona abierta con vasos más pequeños que se ramifican desde ella.
4. Usando fórceps de iris curvo, coloque un anillo estéril antiadherente sobre el CAM sobre el recipiente, idealmente sobre un punto de bifurcación. Utilice una varilla de agitación de vidrio estéril para abrasar suavemente el CAM.
5. Pipet la suspensión celular del paso 3.6 en el centro del anillo antiadherente. Alternativamente, utilice fórceps para colocar una pieza tumoral del paso 4.2 en el centro del anillo antiadherente y cubra con 20-50 l de la solución de matriz extracelular generada en el paso 4.1.
6. Selle la abertura con una pieza de un cuarto de apósito de película transparente de 6 x 7 cm. Etiquete los óvulos con una designación de implante adecuada.
   NOTA: La numeración de los huevos dentro de un grupo facilita las observaciones longitudinales.
7. Devuelva el huevo a la incubadora. Asegúrese de que la abertura de la cáscara se sienta erguida y que el huevo esté seguro.
   NOTA: Los huevos se pueden devolver a una incubadora de huevos sin rotación. Alternativamente, se puede obtener una alta viabilidad postimplante utilizando una incubadora de células de 37-38 oC con el CO₂ desactivado y un higrómetro para controlar la humedad, que debe ser 50%-80%.

6. Implantación sin anillo antiadherente (opción 2)

NOTA: Las células se pueden implantar a partir del día de desarrollo 7 si el CAM está completamente desarrollado. La implantación puede ocurrir en cualquier momento antes de la eclosión que permita un tiempo adecuado para el desarrollo del tumor y el experimento deseado, pero tenga en cuenta que las células inmunitarias del embrión comienzan a estar presentes alrededor del día 10 después de la fertilización^27. Este método se utilizó para implantar las células del carcinoma de células renales y las células cancerosas de la vejiga.

1. Utilice 70% etanol para desinfectar un gabinete de bioseguridad y todas las herramientas necesarias: pipetas y puntas de volumen apropiadas, platos estériles de cultivo de tejido de 10 cm, estante de huevo, apósito de película transparente de 6 x 7 cm, tijeras de oficina y marcador.
2. Aspirar un volumen de inoculación de la suspensión celular generada en el paso 3.6 en una punta de pipeta de tamaño adecuado (200 l es típico). Mientras sostiene la parte superior de la punta, expulse cuidadosamente la punta de la pipeta y colóquela horizontalmente en un plato estéril de cultivo de tejido de 10 cm.
3. Repita el paso 6.2 para todas las muestras dentro de un grupo con un plato para cada grupo.
4. Coloque las puntas en una incubadora de 37 oC durante 15-30 min para permitir que la matriz extracelular se polimerice parcialmente.
5. Después de 15 minutos de incubación, comience a comprobar la polimerización. Una pequeña cantidad de líquido normalmente se filtra fuera de la punta cuando se coloca en el plato. La polimerización de este líquido se puede utilizar para estimar el grado de polimerización del líquido dentro de la punta.
6. Coloque los huevos que se van a implantar en una rejilla de huevos en un gabinete de bioseguridad. Seleccione un número manejable de huevos. Hasta seis es típico. Evite dejar que los huevos se enfríen sustancialmente mientras trabaja con ellos.
7. Retire el apósito de película transparente de la cáscara rodando los bordes hacia la ventana abierta. Esto evita tirar de pedazos de concha.
8. Compruebe que los huevos son viables y saludables. Los huevos ideales tendrán un gran recipiente en el centro de la zona abierta con vasos más pequeños que se ramifican desde ella.
9. Coloque una punta de pipeta en una tubería de tamaño adecuado. Presione el émbolo para forzar la suspensión de la célula parcialmente polimerizada sobre el CAM sobre un recipiente grande y bien desarrollado, idealmente sobre un punto de bifurcación.
10. Selle la abertura con una pieza de un cuarto de apósito de película transparente de 6 x 7 cm.
11. Etiquete el óvulo con una designación de implante adecuada.
    NOTA: La numeración de los huevos dentro de un grupo facilita las observaciones longitudinales.
12. Devuelva el huevo a la incubadora. Asegúrese de que la abertura de la cáscara se sienta erguida y que el huevo esté seguro.
    NOTA: Los huevos se pueden devolver a una incubadora de huevos dedicada sin rotación. Alternativamente, se puede obtener una alta viabilidad postimplante utilizando una incubadora de células de 37-38 oC con el CO₂ desactivado y un higrómetro para controlar la humedad, que debe ser 50%-80%.

7. Imágenes de bioluminiscencia de la luciérnaga luciferasa marcado tumores

NOTA: Si las células implantadas fueron transducidas de forma estable con el gen que codifica la luciferasa de luciérnaga u otros factores de imagen, los tumores resultantes pueden visualizarse mediante imágenes de bioluminiscencia. Las imágenes por fluorescencia no se recomiendan en los huevos intactos debido al fondo alto de la cáscara de huevo. Este es el análisis de punto final, ya que la apertura de la cáscara reduce drásticamente la supervivencia. Los tumores se pueden tomar imágenes en cualquier momento que sea apropiado para las necesidades experimentales y la velocidad de crecimiento del tumor. Sin embargo, en promedio, los huevos eclosionan 21 días después de la fertilización. Por lo tanto, el día 18 de desarrollo es un punto final adecuado para evitar el sombreado no deseado.

1. Si es necesario, transporte los huevos al centro de imágenes. Tape los huevos en los platos de cultivo de tejido de 10 cm. Devuélvelos a una incubadora de huevos de 37,8oC (100 oF) con el mecanismo de rotación eliminado o desactivado. La humedad no es crucial para el transporte y la toma de imágenes.
2. Usando fórceps de iris curvos, empuje suavemente el CAM lejos de la cáscara hasta que el CAM esté al ras con la albúmina y el embrión. Usando fórceps de muestras de punta ancha, rompa pedazos de la cáscara para expandir la abertura de la cáscara adecuadamente para la visualización del tumor.
3. Inyectar un mínimo de 50 l de 30 mg/ml de D-luciferina en la albúmina de huevo. Un volumen similar de D-luciferina también se puede pipetear en el anillo antiadherente o en la superficie del CAM en el área que contiene las células implantadas. Esto garantiza una bioluminiscencia óptima en ausencia de un suministro vascular ideal. Incubar durante 8 min.
4. Inyectar 20-50 l de isoflurano en la albúmina del huevo para anestesiar el óvulo. Incubar durante 2 minutos adicionales Alternativamente, el huevo puede colocarse en una cámara de inducción que contenga 2-2.5% de isoflurano vaporizado. Se obtiene una profundidad de anestesia adecuada cuando cesa el movimiento embrionario.
   NOTA: Se pueden utilizar volúmenes más grandes de isoflurano (100 l) para eutanasiar el huevo.
5. Coloque los huevos en un dispositivo de imágenes de bioluminiscencia y la imagen utilizando los ajustes adecuados según lo determinen las instrucciones del fabricante. Para este estudio, se utilizó un tiempo de exposición de 1 min.
6. Para imaginar el CAM y el embrión restantes, abra el óvulo en un plato de cultivo de tejido de 10 cm.
   1. Agarre el huevo con los dedos de ambas manos en la parte inferior del huevo cerca del centro del huevo y los pulgares a cada lado de la abertura de la cáscara.
   2. Desmonta suavemente las dos mitades del huevo con los pulgares mientras presionas suavemente el huevo con los dedos.
   3. Cuando la cáscara está aproximadamente medio separada del CAM y el embrión, voltee el óvulo al revés sobre un plato de cultivo de tejido de 10 cm.
   4. Continúe separando las mitades del vaciado. Si el CAM se pega al interior de la cáscara, utilice suavemente los dedos para empujar el CAM lejos de la cáscara.
   5. El embrión puede ser volteado en otro plato si se desea.
   6. Si es necesario, se puede administrar isoflurano adicional como se encuentra en el paso 7.4.

8. Cosecha de tumores

NOTA: Los tumores pueden ser cosechados en cualquier momento que sea apropiado para las necesidades experimentales y la velocidad de crecimiento del tumor. Sin embargo, en promedio, los huevos eclosionan 21 días después de la fertilización. Por lo tanto, el día 18 de desarrollo es un punto final adecuado para evitar el sombreado no deseado.

1. Agarre el tumor con fórceps. Usando tijeras (las tijeras de iris de primavera funcionan bien) o un bisturí, expolva cuidadosamente el tumor de CAM.
2. Si el tumor ha sido transducido con el gen de la luciferasa luciérnaga, se puede realizar una reimagen para verificar la extirpación exitosa de tumores difíciles de visualizar.
   NOTA: Los tumores extirpados pueden ser analizados por cualquier método apropiado para un experimento en particular. Los tumores también se pueden reimplantar en CAM o ratones. Para confirmar la identidad del tumor, los tumores pueden ser fijos, incrustados de parafina y examinados con hematoxilina y eosina o tinción inmunohistoquímica.

Hasta ahora, hemos encontrado que este método de implantación es exitoso para los cánceres de ovario, riñón, próstata y vejiga. Cada uno fue optimizado para identificar condiciones específicas para la implantación, aunque puede haber flexibilidad. De los tipos de tumores analizados, el crecimiento del cáncer de ovario fue mucho menos pronunciado y normalmente no visible sin la ayuda de imágenes de bioluminiscencia(Figura 1). Sin embargo, un endurecimiento de la CAM se podía sentir con fórceps en el área de implantación. Esto puede ayudar a identificar un posible crecimiento tumoral en ausencia de imágenes de bioluminiscencia, aunque se requeriría una validación adicional a través de histología u otro método adecuado. Logramos un injerto exitoso de líneas celulares humanas y murinas que muestran morfologías consistentes con las vistas en otros modelos in vivo(Figura 1A y 1B). Además, la implantación de piezas tumorales fue posible(Figura 1C,flecha azul indica tumor). El tumor implantado en este caso provino de un paciente con carcinoma seroso de alto grado, metastásico y ovárico. Los tumores resultantes se asemejaban morfológicamente a sus tumores de origen y expresaban proteínas específicas para el ser humano, como la citoqueratina 8/18, que permiten fácilmente su diferenciación de los tejidos embrionarios de pollo y CAM.

Al optimizar el injerto tumoral y el crecimiento, se pueden agregar factores de crecimiento u hormonas adecuados en el momento de la implantación. Por ejemplo, se observó un aumento sutil y no significativo en el tamaño del tumor (medido por el flujo de resplandor total) en las células ID8 cuando se complementó con tres unidades (U) de hormona estimulante del folículo humano (FSH) en el momento de la implantación(Figura 1D). La selección de fSH para el crecimiento del cáncer de ovario se derivó de la expresión del receptor FSH en células ID8 y los altos niveles de FSH que se encuentran típicamente en mujeres posmenopáusicas, que constituyen la mayoría de los casos de cáncer de ovario. Se pueden adoptar enfoques similares para otros tipos de cáncer difíciles de cultivar para mejorar la utilidad del modelo CAM. Además, la FSH sólo se añadió en el momento de la implantación celular. Reponer el factor de crecimiento u hormona podría lograrse mediante la pipeteo de una cantidad adecuada del aditivo en el medio en el anillo antiadherente a intervalos adecuados, lo que podría mejorar el efecto.

Para el cáncer de riñón, también se puede utilizar la implantación de 2 x 106 células de carcinoma de células renales claras a partir de líneas celulares establecidas, como RENCA, que produjo una formación de tumores rápida y robusta, aunque también se pueden utilizar dosis de células más bajas(Figura 2A,10 días después de la implantación). Los tumores resultantes se asemejaban morfológicamente a los obtenidos a través de los modelos estándar de ratón in vivo28. La implantación de células RENCA marcadas con luciferasa de luciérnaga permitió imágenes de bioluminiscencia. Los tumores humanos primarios también se pueden implantar. Las piezas del tumor persistieron y reclutaron vasculatura sin mostrar un crecimiento significativo. La implantación de células digeridas originarias de un carcinoma primario de células renales de células claras que se expandieron in vitro, sin embargo, creció de manera similar a las líneas celulares establecidas(Figura 2B). Las células del carcinoma de células renales se pueden sembrar utilizando el método de anillo antiadherente o el método sin el anillo antiadherente.

Se analizaron múltiples líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino para el injerto CAM(Figura 3). Cada una creció bien cuando se implantaron 2 x 106 células usando el anillo antiadherente. La evaluación histológica de los tumores resultantes fue consistente con las expectativas para cada línea celular. Además, la implantación de células marcadamente marcadas con luciferasa de luciérnaga permitió la identificación tumoral con imágenes de bioluminiscencia(Figura 3A).

El cáncer de vejiga se estableció en el modelo CAM a partir de líneas celulares establecidas y piezas de tejido humano primario(Figura 4). Las líneas celulares crecieron bien cuando se implantaron con 2 x 106 células sin el anillo antiadherente(Figura 4A y 4B),aunque la implantación con el anillo fue exitosa. El tumor humano primario puede implantarse a partir de trozos de tejido(Figura 4C). El caso presentado se originó a partir de un paciente con carcinoma urotelial de alto grado, no invasivo muscular. La implantación de células digeridas aún no se ha intentado debido a la optimización continua de la digestión tumoral. Las células cancerosas de los tumores CAM resultantes conservaron la morfología del tumor original, pero con un componente estromal alterado. El crecimiento tumoral fue menor que para el carcinoma de células renales y el cáncer de próstata, aunque todavía fácilmente visible.

Para garantizar un gran número de huevos viables y ensayables en el punto final, se debe tener cuidado al incubar y abrir los huevos. Si las condiciones de la incubadora son subóptimas antes o después de la implantación, entonces la viabilidad del embrión puede verse comprometida. Si se produce una muerte embrionaria significativa, solucione las condiciones de la incubadora de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En nuestra experiencia, la estabilidad de la temperatura y la humedad parece ser más crucial que sus valores exactos. Por lo tanto, encontramos que la incubación de los huevos inoculados en una incubadora de COmodificado, de cultivo celular, logró una viabilidad superior sobre la retención de los huevos en pequeñas incubadoras de huevos dedicadas que requieren una apertura más frecuente para reponer el agua que controla la humedad. Minimizar la frecuencia con la que se extirpan los óvulos inoculados para el examen tumoral también puede mejorar la viabilidad de los embriones.

Una preocupación adicional de la implantación CAM es la integridad del CAM en la inoculación. Si el CAM no está intacto después de abrir la cáscara, entonces el anillo antiadherente y las células implantadas se hundirán en la albúmina del embrión (ver la nota después del paso 2.12). Esto causa dispersión de células cancerosas. Algunos tumores todavía pueden formarse, pero los cánceres que reciben un crecimiento significativo y la señalización de supervivencia de las células cancerosas vecinas, como el cáncer de ovario, no formarán tumores de manera confiable en tales condiciones. Si se utilizan anillos antiadherentes para la implantación, el fallo del CAM se puede identificar por el hundimiento del anillo en la albúmina. Esto debe distinguirse de los casos en los que el anillo y las células implantadas fueron trasladados a la parte inferior del óvulo por movimiento embrionario. En esos casos, el anillo se encontrará entre el CAM y la parte inferior del shell. El movimiento embrionario no se puede controlar. Sin embargo, la colocación del anillo puede dificultar que el embrión interrumpa las células implantadas. Los anillos colocados en los bordes de la bolsa de aire generado en el paso 2.7 son más propensos a ser movidos por el embrión que los colocados en el centro del campo.

Figura 1: Desarrollo representativo del tumor a causa del cáncer de ovario. Las células cancerosas ováricas implantadas con éxito incluyen: (A) la línea celular humana SKOV3, (B) la línea celular de la murino ID8, y (C) tumores primarios. La tinción representativa de hematoxilina y eosina se presenta junto con imágenes de bioluminiscencia, según corresponda. Para el tumor CAM resultante de la implantación de una pieza tumoral primaria (C) se incluyen la tinción de hematoxilina y eosina tanto del tumor CAM como del tumor primario, junto con la tinción de citoqueratina 8/18 (CK 8/18) del tumor CAM resultante. La flecha azul del primer panel indica el tumor. (D) Tamaño del tumor de los implantes ID8 con y sin FSH 3U, calculado como el flujo total resultante de la imagen de bioluminiscencia (n a 3 para los implantes no tratados y n a 4 para FSH complementado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Desarrollo del tumor representativo a partir de carcinoma de células renales claras. Tumores resultantes de la implantación de (A) la línea celular de carcinoma de células renales murinas, RENCA, o (B) células cultivadas derivadas de un tumor primario humano digerido. La escala de medición adyacente al tumor extirpado en (B) muestra marcas de 1 mm. La histología correspondiente en (A) y (B) muestra la tinción de hematoxilina y eosina. En (A), también se muestra la imagen representativa de bioluminiscencia de células RENCA marcadas con luciérnagas-luciferasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Desarrollo representativo del tumor a partir de líneas celulares de cáncer de próstata. Tumores representativos y tinción de hematoxilina y eosina resultante de la implantación de las líneas celulares de cáncer de próstata humano (A) CWR y (B) C4-2 junto con la línea celular murina (C) MyC-CaP. Las imágenes de bioluminiscencia de los tumores resultantes de las células CWR marcadas con luciferasa de luciérnaga se muestran en (A). La escala de medición adyacente a los tumores extirpados muestra marcas de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Desarrollo representativo del tumor a causa del cáncer de vejiga. Tumores representativos resultantes de la implantación de las líneas celulares de cáncer de vejiga humana establecidas (A) HT-1376, (B) T24 y (C) tumor primario de vejiga humana. Se muestran en(C),la tinción de hematoxilina y eosina del tumor CAM resultante y del tumor primario. La escala de medición adyacente a los tumores extirpados muestra marcas de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.