Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

Summary

Presentamos el modelo de membrana corioalantoica de pollo como un modelo alternativo, trasplantable, in vivo para el injerto de líneas celulares de cáncer ginecológico y urológico y tumores derivados del paciente.

Abstract

Los modelos de ratón son las pruebas de referencia para los estudios de cáncer in vivo. Sin embargo, el costo, el tiempo y las consideraciones éticas han llevado a llamadas a modelos alternativos de cáncer in vivo. El modelo de membrana corioalantoica de pollo (CAM) proporciona una alternativa rápida y económica que permite la visualización directa del desarrollo tumoral y es adecuado para la toma de imágenes in vivo. Como tal, buscamos desarrollar un protocolo optimizado para injertar tumores ginecológicos y urológicos en este modelo, que presentamos aquí. Aproximadamente 7 días después de la fertilización, la célula de aire se mueve al lado vascularizado del óvulo, donde se crea una abertura en la cáscara. Los tumores de las líneas celulares murinas y humanas y los tejidos primarios pueden ser injertados. Estos son típicamente sembrados en una mezcla de matriz extracelular y medio para evitar la dispersión celular y proporcionar apoyo nutritivo hasta que las células reclutan un suministro vascular. Los tumores pueden crecer hasta 14 días más antes de la eclosión de los huevos. Mediante el implante de células transducidas establemente con luciferasa luciérnaga, la imagen de bioluminiscencia se puede utilizar para la detección sensible del crecimiento tumoral en la membrana y la célula cancerosa diseminado por todo el embrión. Este modelo se puede utilizar potencialmente para estudiar la tumorigeniidad, invasión, metástasis, y eficacia terapéutica. El modelo CAM de pollo requiere significativamente menos tiempo y recursos financieros en comparación con los modelos murinos tradicionales. Debido a que los óvulos son inmunocomprometidos e inmunes tolerantes, los tejidos de cualquier organismo pueden implantarse potencialmente sin animales transgénicos costosos (por ejemplo, ratones) necesarios para la implantación de tejidos humanos. Sin embargo, muchas de las ventajas de este modelo podrían ser potencialmente también limitaciones, incluyendo el corto tiempo de generación de tumores y el estado inmunocomprometido/inmune tolerante. Además, aunque todos los tipos de tumores presentados aquí se injertan en el modelo de membrana corioalantoica de pollo, lo hacen con diferentes grados de crecimiento tumoral.

Introduction

Los ratones han servido como el organismo modelo clásico para el estudio de enfermedades humanas, incluyendo la neoplasia maligna. Como mamíferos, comparten muchas similitudes con los humanos. Su alto grado de similitud genética ha permitido la manipulación transgénica del genoma del ratón para proporcionar una enorme visión del control genético de las enfermedades humanas¹. La amplia experiencia en el manejo y la experimentación con ratones ha dado lugar a que sean el modelo de elección para la investigación biomédica. Sin embargo, además de las preocupaciones éticas y científicas con respecto a los modelos murinos, también pueden ser bastante....

Protocol

Todos los experimentos presentados aquí fueron revisados y aprobados por los comités éticos apropiados de la Universidad de California, Los Angeles (UCLA). El uso de tumores humanos primarios desidentificados ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UCLA (números de protocolo 17-000037, 17-001169 y 11-001363). En UCLA, no es necesario revisar el Comité de Investigación Animal para experimentos con embriones de pollo; la aprobación del protocolo sólo es necesaria cuando los huevos serán eclosionados. Sin embargo, las mejores prácticas, como las Directrices de AVMA para la Eutanasia de los Animales, se utilizaron para manejar los embriones de pollo de ....

Results

Hasta ahora, hemos encontrado que este método de implantación es exitoso para los cánceres de ovario, riñón, próstata y vejiga. Cada uno fue optimizado para identificar condiciones específicas para la implantación, aunque puede haber flexibilidad. De los tipos de tumores analizados, el crecimiento del cáncer de ovario fue mucho menos pronunciado y normalmente no visible sin la ayuda de imágenes de bioluminiscencia(Figura 1). Sin embargo, un endurecimiento de .......

Discussion

La expansión e injerto de tumores utilizando el modelo CAM permite un crecimiento tumoral más rápido y directamente observable que los modelos animales in vivo existentes. Además, los costos son significativamente más bajos una vez que se completa la compra inicial de equipos, especialmente en comparación con el costo de los ratones inmunocomprometidos. El estado inicial inmunocomprometido de los embriones de pollo permite fácilmente el injerto de tejido humano y murino. Incluso con estos puntos fuertes, el modelo CAM ti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
-010 Teflón (PTFE) Juntas tóricas Blanco 55 Duro Shore D	The O-Ring Store	TEF010	Anillo antiadherente para siembra de células. 1/4" ID X 3/8" OD X 1/16"CS Politetrafluoroetileno (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Línea celular de cáncer de próstata humano.
Las células CWR22Rv1			CWR fueron el amable regalo del Dr. David Agus (Keck Medicine de la Universidad del Sur de California)
Anticuerpo de citoqueratina 8/18 (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Utilizado en una dilución de 1:100 para el análisis inmunohistoquímico de tumores CAM de ovario humano.
D-Luciferina Luciérnaga, sal de potasio	Goldbio	LUCK-1G
Tijeras de operación delicadas; Curvo; agudo-agudo; Longitud de la hoja de 30 mm; 4-3/4 pulg. Longitud total	Roboz Surgical	RS6703	Esto se proporciona como ejemplo. Cualquier tijera curva similar también funcionaría.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Kit de herramientas	Dremel	8050-N/18	Este kit contiene todas las herramientas necesarias.
Huevos de gallina fertilizados (Rhode Island rojo - marrón, grado de laboratorio)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	Sería necesario identificar un proveedor local de huevos, ya que este proveedor solo realiza entregas a nivel regional.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Línea celular de cáncer de vejiga humana.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubadora	Almacén	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Se pueden utilizar otras incubadoras de huevos, pero sería necesario verificar su fiabilidad. Después de la implantación, también se puede utilizar una incubadora de células con el CO2 desactivado.
ID8			No disponible comercialmente, consulte PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	pueden usar otros candlers; sin embargo, este es el preferido entre los que hemos probado. Esta vela está incluida en el kit de incubadora antes mencionado.
Pinza de iris, 10 cm, curva, dentada, puntas de 0,8 mm	World Precision Instrument	15915	Esto se proporciona como ejemplo. Cualquier pinza curva similar también funcionaría. Se han utilizado múltiples marcas para este método.
Clipper de isoflurano	distribuye	0010250
IVIS Lumina II Sistema de imagen in vivo	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; Corning		354248	Solución de matriz extracelular
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Línea celular murina de cáncer de próstata.
Controlador de pipeta portátil Pipet-Aid XP	Drummond Scientific	4-000-101	Cualquier controlador de pipeta similar sería apropiado.
Agujas hipodérmicas PrecisionGlide	BD 305196		Esto se proporciona como ejemplo. Cualquier aguja de 18G funcionaría de manera similar.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Engineerps	Fine Science Tools	11008-13	Esto se proporciona como ejemplo. Cualquier fórceps similar u otro estilo que se adapte a las preferencias del investigador sería apropiado.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Línea celular de cáncer de ovario humano.
Pinza de muestra	Electrónica Microscopy Sciences	72914	Esto se proporciona como ejemplo. Las pinzas utilizadas para extraer la carcasa para la obtención de imágenes de bioluminiscencia miden aproximadamente 12,8 cm de largo con puntas de 3 mm de ancho.
Bolas de algodón estériles	Fisherbrand	22-456-885	Esto se proporciona como ejemplo. Cualquier bola de algodón estéril sería suficiente.
Varillas de agitación con policía de goma; 5 mm de diámetro, 6 pulgadas de largo	United Scientific Supplies	GRPL06	Esto se proporciona como ejemplo. Cualquier varilla de agitación de vidrio similar también funcionaría.
T24	ATCC	HTB-4	Línea celular de cáncer de vejiga humana.
Tegaderm Apósito Transparente Estilo de Marco Original 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Placas de Cultivo de Tejidos, 10 cm	de diámetro Corning	353803	Esto se proporciona como ejemplo. Se puede utilizar cualquier plato similar estéril de 10 cm. No es necesario el tratamiento de cultivo de tejidos.
Tubo de laboratorio transparente Tygon - 1/4 x 3/8 x 1/16 de pared (50 pies)	Tygon	AACUN017	Esto se proporciona como ejemplo. Cualquier tubo de tamaño similar también funcionaría.