Artículo de método

Análisis De La Población Lateral En Líneas Celulares De Tumores Sólidos

DOI:

10.3791/60658

⸱

23 de febrero de 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un método conveniente, rápido, y rentable de medir la proporción de células de población laterales en variedades de células sólidas del tumor se presenta.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre cancerosas (CSCs) son una causa importante del crecimiento del tumor, de la metástasis, y de la repetición. El aislamiento y la identificación de CSCs son de gran importancia para la investigación del tumor. Actualmente, varias técnicas se utilizan para la identificación y purificación de CSCs de tejidos del tumor y de variedades de células del tumor. La separación y el análisis de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos de uso general. Los métodos se basan en la capacidad de los CSCs para expulsar rápidamente los tintes fluorescentes, como Hoechst 33342. La emanación del tinte se asocia con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC) y puede ser inhibida por inhibidores del transportador ABC. Los métodos para la coloración de las células cultivadas del tumor con Hoechst 33342 y para analizar la proporción de sus células del SP por cytometry de flujo se describen. Este ensayo es conveniente, rápido y rentable. Los datos generados en este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión del efecto de los genes u otras señales extracelulares e intracelulares sobre las propiedades de stemness de las células tumorales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre cancerosas (CSCs) son subconjuntos de células con capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación múltiple, que desempeñan un papel vital en el crecimiento tumoral, la metástasis y la recurrencia1,2. Actualmente, CSCs se han identificado para existir en una variedad de tumores malos, incluyendo pulmón, cerebro, páncreas, próstata, pecho, y cánceres del hígado3,4,5,6,7,8,9. La identificación de CSCs en estos tumores se basa principalmente en la presencia de proteínas superficiales del marcador, tales como expresión alta y/o baja de CD44, de CD24, de CD133, y deSca-1 9,10,pero un marcador único que pueda distinguir CSCs de no-CSCs no se ha divulgado hasta ahora. Actualmente, varias técnicas se utilizan para identificar y purificar CSCs en tejido del tumor o variedades de células del tumor. Estas técnicas están diseñadas en base a las propiedades específicas de los CSCs. Entre ellos, los ensayos y la clasificación de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos comúnmente utilizados.

Las células SP fueron descubiertas originalmente por Goodell et al.11,cuando caracterizaron células madre hematopoyéticas en células de médula ósea de ratón. Cuando las células de la médula del ratón fueron etiquetadas con el tinte fluorescente Hoechst 33342, un pequeño grupo de células Tenue-manchadas Hoechst 33342 apareció en el diagrama de dos dimensiones del punto de un análisis cytometry de flujo. Hoechst 33342 es un colorante de unión al ADN y tiene al menos dos modos de unión que conducen a diferentes características espectrales. Al ver la emisión de fluorescencia a dos longitudes de onda al mismo tiempo, se pueden revelar múltiples poblaciones12. En su ensayo, el Hoechst 33342 se excitó a 350 nm y la fluorescencia se midió utilizando el filtro de paso de banda (BP) de 450/20 nm y el filtro de borde de 675 nm de paso largo (EFLP)11. En comparación con toda la población de células de médula ósea, este grupo de células se enriqueció con células madre hematopoyéticas llamadas células SP11. Las células SP son capaces de expulsar rápidamente Hoechst 33342. La emanación de este tinte está relacionada con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC)13,que pueden ser inhibidos por algunos agentes como fumitremorgina C14,verapamilo y reserpina15,16. Después de eso, se detectaron diferentes proporciones de células SP en una variedad de tejidos, órganos, tejidos tumorales y líneas celularestumorales 17,18,19. Estas células SP tienen muchas características de las células madre17,19.

Este manuscrito describe el etiquetado y la coloración de Hoechst 33342 de las células cultivadas del tumor y el análisis de las células del SP por cytometry de flujo. Por otra parte, la optimización de la concentración de Hoechst 33342 y la selección apropiada del molde para una variedades de células específica del tumor usando este acercamiento se muestran. Finalmente, se demuestran los efectos de las señales de promoción o inhibición del stemness sobre la proporción de SP en las células tumorales. Los ejemplos experimentales demuestran que el análisis del SP se puede utilizar para explorar los efectos de varias señales, tales como expresión génica, pequeños inhibidores, activadores, cytokines, y chemokines, sobre stemness del tumor. En comparación con otros métodos para el aislamiento y la purificación de CSCs, tales como clasificación de CD44+/ CD24– población, análisis de aldehído deshidrogenasa (ALDH) y ensayos de formación de esfera tumoral, este método es más fácil de manipular y es rentable.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación celular

  1. Digestión celular y neutralización
    1. Sembrar células tumorales (como las células MDA-MB-231) en una placa de 6 pozos, y cultivarlas en una incubadora de 37 °C suministrada con 5% de CO2.
    2. Cosechar células cuando su densidad alcanza alrededor del 90%. Aspirar bien el medio de cultivo y lavar las células 2x con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Para examinar los efectos de los inhibidores de la vía de señalización (por ejemplo, inhibidor de FRA1), o activadores (por ejemplo, activador STAT3) sobre las características de stemness de las células tumorales, las células tumorales se siembran en una placa de 6 pozos y se pretratan con inhibidores o activadores durante un cierto período de tiempo antes de la cosecha.
    3. Agregue 500 μL de tripsina-EDTA al 0,25% a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, coloque el plato en una incubadora a 37 °C durante 1-3 minutos (min) y toque suavemente el plato para separar las células.
      NOTA: La digestión prolongada afectará el perfil del SP debido a los cambios en viabilidad de la célula.
    4. Agregue 3 mL de PBS suplementado con suero bovino fetal al 2% (FBS) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos para terminar la digestión y pipetear suavemente las células hacia arriba y hacia abajo 3-5x para dispersar los grupos celulares.
    5. Agregue 0.5 mL de suspensión celular a un pozo de una nueva placa de 6 pozos y examínese bajo un microscopio. Si se observan grupos celulares, pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μM.
      Nota : se trata de un paso opcional.
    6. Transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 mL. Centrífuga de células a 200 x g durante 5 min a células de pellets. Retirar el sobrenadante y resuspend en 3 mL de PBS suplementado con 2% de FBS. Pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 3-5x para mezclar a fondo.
  2. Recuentos de celdas
    1. Añadir 50 μL de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mezclarlo con una solución de 50 μL de tripano azul. Pipetee 10 μL de la mezcla para contar el número de células vivas utilizando un método estándar, como un hemocitómetro.
    2. Diluya las células en PBS complementado con FBS del 2% a una concentración final de 1 x 106 cells/mL. Añadir 1 mL de la suspensión celular a un tubo de ensayo redondo de poliestireno de 5 mL y preparar dos tubos de muestra.

2. Tinción celular con Hoechst 33342

  1. Añadir Hoechst 33342 a un tubo para alcanzar una concentración final adecuada.
    NOTA: Por ejemplo, la concentración apropiada de Hoechst 33342 es de 3 μg/mL para las células MDA-MB-231.
  2. Añadir un bloqueador (por ejemplo, Fumitremorgin C, Verapamil o Reserpina) a otro tubo a una concentración final adecuada e incubar el tubo a 37 °C durante 30 min antes de añadir la misma concentración de Hoechst 33342 como se describe en el paso 2.1.
    NOTA: Para las células MDA-MB-231, el bloqueador apropiado es la reserpina (40 μM). La reserpina se utiliza como control de bloqueo para verificar la ausencia de células en el área cerrada del SP.
  3. Prepare varios tubos que contengan células y agregue Hoechst 33342 a diferentes gradientes de concentración. Después de un ensayo de citometría de flujo, elija la concentración adecuada de acuerdo con el perfil y la proporción de SP.
    Nota : éste es un paso opcional utilizado para definir la concentración adecuada de Hoechst 33342.
  4. Prepare varios tubos que contengan células, agregue el bloqueador a diferentes gradientes de concentración, incube los tubos a 37 °C durante 30 min, luego agregue Hoechst 33342 a una concentración adecuada. Después del ensayo de citometría de flujo, elija la concentración adecuada de acuerdo con la ausencia de células en el área del SP cerrada.
    NOTA: Este es un paso opcional utilizado para definir la concentración adecuada de bloqueador.
  5. Coloque los tubos en una incubadora de 37 °C e incubarlos durante 60 min, agitando los tubos cada 10 min.
    NOTA: Agitar los tubos a fondo es importante para la tinción, ya que asegura el contacto completo entre las células y el tinte para obtener mejores resultados de tinción.
  6. Después de la incubación, centrifugar las células a 200 x g,4 °C durante 5 min, y aspirar el sobrenadante con cuidado, porque las células forman pellets muy sueltos e inestables.
  7. Resuspend las células de cada tubo en 1 mL de PBS helado complementado con FBS al 2% y pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 3-5x para mezclar a fondo. Añadir 1 μL de 1 mg/mL de yoduro de propidio (PI) a la suspensión de cada tubo para identificar las células muertas.
    NOTA: Todos los procedimientos en este paso deben realizarse a 4 °C para inhibir la emanación de Hoechst 33342 de las células tumorales. Los tubos deben estar protegidos de la exposición directa a la luz.

3. Análisis por citometría de flujo

NOTA: Las instrucciones para el uso del software del citómetro de flujo (ver Tabla de Materiales)se describen en esta sección y en las Figuras Suplementarias 1–10.

  1. En el software del citómetro de flujo, haga clic en el botón CARPETA. Haga clic en el botón Experimento y, a continuación, haga clic en Nuevo experimento (Figura suplementaria 1A,B).
  2. Haga clic en el botón Aceptar. "Experiment_001" aparecerá en la CARPETA (Figura suplementaria 2A,B).
  3. Haga clic en el botón Experiment_001 para cambiar el nombre de la carpeta a un nombre específico (por ejemplo, "20191118-SP"). Haga clic en Entrar. El nuevo nombre ("20191118-SP") aparecerá en CARPETA (Figura suplementaria 3A,B).
  4. Haga clic en el botón Nuevo espécimen para agregar un espécimen a la nueva carpeta del experimento ("20191118-SP"). Haga clic en el botón Nuevo tubo para añadir un tubo a la muestra. Haga clic en el botón Punta de flecha (Figura suplementaria 4A-C).
  5. Haga clic en el botón Parámetros y configure los parámetros del citómetro de flujo (Figura suplementaria 5).
    1. Utilice un espejo dicroico de 610 nm de paso corto (DMSP) para separar las longitudes de onda de emisión. Utilice un filtro BP de 450/20 nm para recoger la fluorescencia azul y un EFLP de 675 nm para recoger la fluorescencia roja.
      NOTA: Hoechst 33342 se excita con un láser UV a 355 nm y PI se excita a 488 nm.
  6. Ejecute las muestras de células en el citómetro de flujo.
    NOTA: Las células SP se pueden clasificar por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en condiciones estériles. Se debe recolectar un total de 100.000 a 500.000 células para los experimentos de seguimiento.
    1. Ejecutar las células teñidas con Hoechst 33342 en el citómetro de flujo.
      1. Coloque tubos que contengan células teñidas con Hoechst 33342 en el citómetro.
      2. Haga clic en el botón Gráfica de puntos para mostrar la gráfica de puntos, luego haga clic en el eje X y estadámoslo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "PI-A". Muestra la gráfica de puntos del área de pulsos de dispersión directa (FSC-A, eje X establecido en modo lineal) frente a la fluorescencia PI (eje Y establecido en escala logarítmica). Ajuste los voltajes para mostrar las células vivas en el lado derecho y las células no vivas, que están brillantemente manchadas con PI, en la esquina superior izquierda. Luego, establezca una puerta poligonal para excluir celdas muertas y escombros de celdas(Figura 1A)haciendo clic en el botón Puerta poligonal para bloquear el subconjunto P1, también conocido como subconjunto FSC-A, PI-A(Figura suplementaria 6A,B).
      3. Haga clic en el botón Gráfica de puntos para mostrar la gráfica de puntos, haga clic en el eje X y estadámoslo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "FSC-W". Muestra la gráfica de puntos de FSC-A (eje X) versus ancho de pulso de dispersión directa (FSC-W, eje Y). Haga clic con el botón derecho en el trazado de puntos, haga clic en el botón P1 debajo del botón Mostrar poblaciones. Haga clic en el botón Puerta rectangular para crear una puerta rectangular para bloquear el subconjunto P2 (también conocido como subconjunto FSC-A, FSC-W). Esto excluirá las células con grandes volúmenes (Figura suplementaria 7A-C y Figura 1A).
      4. Haga clic en el botón Dot Plot para mostrar el punto plot, haga clic en el eje X y estadámoslo en "SSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "SSC-W". Muestra la gráfica de puntos del área de impulsos de dispersión lateral (SSC-A, eje X) frente al ancho del pulso de dispersión lateral (SSC-W, eje Y). Haga clic con el botón derecho en la gráfica de puntos y haga clic en el botón P2 en el botón Mostrar poblaciones. A continuación, haga clic en el botón Puerta rectangular para crear una puerta rectangular para bloquear el subconjunto P3 (también conocido como subconjunto SSC-A, SSC-W). Para ello se obtendrá una población celular con granularidad uniforme(Figura Suplementaria 8A-C y Figura 1A).
      5. Haga clic en el botón Dot Plot para mostrar el punto plot, haga clic en el eje X y estadázlo en "Hoechst Red-A"; haga clic en el eje Y y estadázlo en "Hoechst Blue-A". Muestra la gráfica de puntos de Hoechst Red-A (eje X) versus Hoechst Blue-A (eje Y). Haga clic con el botón derecho en el trazado de puntos, haga clic en el botón P3 debajo del botón Mostrar poblaciones. Haga clic en el botón Puerta del polígono para crear una puerta poligonal para bloquear el subconjunto P4 (también conocido como subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos y haga clic en el botón Mostrar jerarquía de población para mostrar la jerarquía de población.
        NOTA: La gráfica de puntos mostrará tres poblaciones diferentes: 1) una población de fase G0-G1 cerca del centro de la gráfica; 2) una población de fase S-G2/M cerca de la esquina superior derecha; 3) el SP. A continuación, se realiza un registro del SP para su posterior análisis(Figura suplementaria 9A-D y Figura 1A). Si la gráfica de puntos de Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A no muestra un perfil SP similar al que se muestra en la Figura 1A,los voltajes deben ajustarse hasta que se vea un perfil similar. Mientras tanto, ajuste todas las puertas anteriores en consecuencia.
      6. Después de determinar la región de la puerta de las celdas sp, haga clic en Adquirir datos para recopilar entre 20.000 y 100.000 eventos de cada muestra para analizar el porcentaje de celdas SP ( Figurasuplementaria 10).
    2. Ejecute las células teñidas de Hoechst 33342 tratadas con bloqueador en el citómetro de flujo.
      1. Coloque los tubos que contienen el molde en el citómetro y funcione las células usando los mismos voltajes y puertas para marcar más a fondo si los voltajes y las puertas se seleccionan apropiadamente.
        NOTA: En comparación con la tinción hoechst 33342 sola, sólo una proporción muy pequeña de células, si las hay, debe aparecer en el área cerrada del SP (Figura 1B).
      2. Recopile entre 20.000 y 100.000 eventos de cada muestra para analizar el porcentaje de células SP.

4. Análisis de datos

NOTA: Las instrucciones para el uso del software de análisis de citometría de flujo (ver Tabla de Materiales)se describen en esta sección y en las Figuras Suplementarias 11–16.

  1. Copie los archivos en formato fcs a una computadora, abra el software de análisis de citometría de flujo y arrastre un archivo de muestra al software(Figura suplementaria 11A,B).
  2. Gate las células y obtener el porcentaje de células SP.
    1. Haga doble clic en este archivo de ejemplo,haga clic en el eje X y estadámoslo en"FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "PI-A". A continuación, cree una puerta poligonal y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto FSC-A, PI-A (Figura suplementaria 12A-E).
    2. Haga doble clic en el archivo de subconjunto FSC-A, PI-A, haga clic en el eje X y estadámoslo en"FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "FSC-W". Luego, cree una puerta rectangular y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto FSC-A, FSC-W (Figura suplementaria 13A-E).
    3. Haga doble clic en el archivo de subconjunto FSC-A, FSC-W, haga clic en el eje X y estadámoslo en"SSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "SSC-W". A continuación, cree una puerta rectangular y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto SSC-A, SSC-W (Figura suplementaria 14A-E).
    4. Haga doble clic en el archivo de subconjunto SSC-A, SSC-W, haga clic en el eje X y estadázlo en "Hoechst Red-A"; haga clic en el eje Y y estadázlo en "Hoechst Blue-A". A continuación, cree una puerta poligonal y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A (Figura suplementaria 15A-E).
    5. Abra el Editor de diseño haciendo clic en el botón Abrir editor de diseño. Arrastre el archivo de subconjunto SSC-A, SSC-W al Editor de diseño y, a continuación, haga clic en el botón Haga clic para guardar la ventana de diseño en archivo para guardar los resultados de la imagen ( Figurasuplementaria 16A-C).
  3. Guarde el espacio de trabajo para conservar la información de acceso al cerrar el software.
  4. Realice análisis de prueba t con software de análisis estadístico para comparar la diferencia entre dos grupos. Un valor de P < 0,05 fue definido como estadístico significativo.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cuatro análisis experimentales del SP fueron realizados según este método. En el primero, detectamos la proporción de células SP en MDA-MB-231, que es una triple negativa de la línea celular humana del cáncer de seno, en condiciones normales. Después del recuento celular, Hoechst 33342 se añadió en un tubo que contenía 1 x 106 células a una concentración final de 3 μg/mL. Reserpina y Hoechst 33342 se añadieron a otro tubo a concentraciones finales de 40 μM y 3 μg/mL, respectivamente. El PI fue agregado a ambos...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hay varios puntos clave a tener en cuenta para el ensayo SP. La primera es la selección de un bloqueador adecuado, como verapamilo o reserpina, para cada línea celular, porque la ubicación de la "puerta" de las células SP se determina de acuerdo con la posición en la que un gran número de células SP desaparecen después de la adición del bloqueador. Para la línea celular MDA-MB-231, Reserpine funciona bien. Sin embargo, para otras líneas celulares, diferentes bloqueadores podrían funcionar mejor.

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de China 81572599, 81773124 y 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundamental Research Funds for the Central Universities, Nankai University 63191153.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
placa de cultivo celular de 6 pocillosCORNING35169,5 cm2 (aprox.)
ColivelinMCEHY-P1061ASer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Suero fetal bovino (FBS)Industrias Biológicas (BIOIND)04-001-1ACS
flujoBD BiosciencesBD LSRFortessa
Citómetro de flujo softwareBD BiosciencesFACSDiva
Citómetro de flujo software de análisisBD BiosciencesFlowJo
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261bisBenzimide H 33342 triclorhidrato
Poliestireno tubo de ensayo de fondo redondoCORNING35205412 x 75 mm, 5 mL
Propidium yoduro (PI)Sigma-AldrichP41703,8-Diamino-5-[3-(dietilmetilamimonio)propil]-6-fenilfenantridinanio diyoduro Reserpina
Sigma-Aldrich83580(3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimetoxi-18-[(3,4,5-trimetoxibenzoil)oxi]éster metílico del ácido yohimban-16-carboxílico
SKLB816proporcionado por el Dr. Shengyong Yang, Universidad
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenolGibco25200072
clorhidrato de verapamiloSigma-AldrichV46295-[N-(3,4-dimetoxifeniletil)metilamina] Clorhidrato de -2-(3,4-dimetoxifenil)-2-isopropilvaleronitrilo
Citómetro de de Sichuan

Referencias

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