Análisis De La Población Lateral En Líneas Celulares De Tumores Sólidos

Resumen

Un método conveniente, rápido, y rentable de medir la proporción de células de población laterales en variedades de células sólidas del tumor se presenta.

Resumen

Las células madre cancerosas (CSCs) son una causa importante del crecimiento del tumor, de la metástasis, y de la repetición. El aislamiento y la identificación de CSCs son de gran importancia para la investigación del tumor. Actualmente, varias técnicas se utilizan para la identificación y purificación de CSCs de tejidos del tumor y de variedades de células del tumor. La separación y el análisis de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos de uso general. Los métodos se basan en la capacidad de los CSCs para expulsar rápidamente los tintes fluorescentes, como Hoechst 33342. La emanación del tinte se asocia con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC) y puede ser inhibida por inhibidores del transportador ABC. Los métodos para la coloración de las células cultivadas del tumor con Hoechst 33342 y para analizar la proporción de sus células del SP por cytometry de flujo se describen. Este ensayo es conveniente, rápido y rentable. Los datos generados en este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión del efecto de los genes u otras señales extracelulares e intracelulares sobre las propiedades de stemness de las células tumorales.

Introducción

Las células madre cancerosas (CSCs) son subconjuntos de células con capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación múltiple, que desempeñan un papel vital en el crecimiento tumoral, la metástasis y la recurrencia^1,2. Actualmente, CSCs se han identificado para existir en una variedad de tumores malos, incluyendo pulmón, cerebro, páncreas, próstata, pecho, y cánceres del hígado^3,4,5,6,7,8,

Protocolo

1. Preparación celular

1. Digestión celular y neutralización
   1. Sembrar células tumorales (como las células MDA-MB-231) en una placa de 6 pozos, y cultivarlas en una incubadora de 37 °C suministrada con 5% de CO_2.
   2. Cosechar células cuando su densidad alcanza alrededor del 90%. Aspirar bien el medio de cultivo y lavar las células 2x con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Para examinar los efectos de los inhibidores de la vía de señalización (por ejemplo, inhibidor de FRA1), o activadores (por ejemplo, activador STAT3) sobre las características de stemness de las células tumorales, las células tumorales se siem....

Resultados

Cuatro análisis experimentales del SP fueron realizados según este método. En el primero, detectamos la proporción de células SP en MDA-MB-231, que es una triple negativa de la línea celular humana del cáncer de seno, en condiciones normales. Después del recuento celular, Hoechst 33342 se añadió en un tubo que contenía 1 x 10⁶ células a una concentración final de 3 μg/mL. Reserpina y Hoechst 33342 se añadieron a otro tubo a concentraciones finales de 40 μM y 3 μg/mL, respectivamente. El PI fue agregado a ambos.......

Discusión

Hay varios puntos clave a tener en cuenta para el ensayo SP. La primera es la selección de un bloqueador adecuado, como verapamilo o reserpina, para cada línea celular, porque la ubicación de la "puerta" de las células SP se determina de acuerdo con la posición en la que un gran número de células SP desaparecen después de la adición del bloqueador. Para la línea celular MDA-MB-231, Reserpine funciona bien. Sin embargo, para otras líneas celulares, diferentes bloqueadores podrían funcionar mejor.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
placa de cultivo celular de 6 pocillos	CORNING	3516	9,5 cm2 (aprox.)
Colivelin	MCE	HY-P1061A	Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Suero fetal bovino (FBS)	Industrias Biológicas (BIOIND)	04-001-1ACS
flujo	BD Biosciences		BD LSRFortessa
Citómetro de flujo software	BD Biosciences		FACSDiva
Citómetro de flujo software de análisis	BD Biosciences		FlowJo
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	bisBenzimide H 33342 triclorhidrato
Poliestireno tubo de ensayo de fondo redondo	CORNING	352054	12 x 75 mm, 5 mL
Propidium yoduro (PI)	Sigma-Aldrich	P4170	3,8-Diamino-5-[3-(dietilmetilamimonio)propil]-6-fenilfenantridinanio diyoduro Reserpina
	Sigma-Aldrich	83580	(3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimetoxi-18-[(3,4,5-trimetoxibenzoil)oxi]éster metílico del ácido yohimban-16-carboxílico
SKLB816	proporcionado por el Dr. Shengyong Yang, Universidad
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	Gibco	25200072
clorhidrato de verapamilo	Sigma-Aldrich	V4629	5-[N-(3,4-dimetoxifeniletil)metilamina] Clorhidrato de -2-(3,4-dimetoxifenil)-2-isopropilvaleronitrilo

Citómetro de de Sichuan