Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos

Aline de Oliveira Lima Pacheco; Marcelo  Pires Amaral; Ingrid  Sancho de Farias; Luiza  Zainotti Miguel Fahur Bottino; Karina  Ramalho Bortoluci

doi:10.3791/60680

Artículo de método

Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos

DOI:

10.3791/60680

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18 de marzo de 2020

Aline de Oliveira Lima Pacheco^*¹ , Marcelo Pires Amaral^*¹ , Ingrid Sancho de Farias¹ , Luiza Zainotti Miguel Fahur Bottino¹ , Karina Ramalho Bortoluci²

¹Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), ²Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El objetivo general de este protocolo es instruir cómo extraer, mantener y disociar las células de astrocitos murinoy y microglia del sistema nervioso central, seguida de una infección con parásitos protozoos.

Resumen

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Los astrocitos y la microglia son las células gliales más abundantes. Son responsables del apoyo fisiológico y el mantenimiento de la homeostasis en el sistema nervioso central (SNC). Las crecientes evidencias de su participación en el control de enfermedades infecciosas justifican el interés emergente en la mejora de metodologías para aislar los astrocitos primarios y la microglia con el fin de evaluar sus respuestas a las infecciones que afectan al SNC. Teniendo en cuenta el impacto de la infección Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y Toxoplasma gondii (T. gondii) en el SNC, aquí proporcionamos un método para extraer, mantener, disociar e infectar astrocitos murinos y células microglia con parásitos protozoos. Las células extraídas de cortices recién nacidos se mantienen in vitro durante 14 días con reemplazo diferencial periódico de medios. Los astrocitos y la microglia se obtienen del mismo protocolo de extracción por disociación mecánica. Después de fenotiar por citometría de flujo, las células se infectan con parásitos protozoos. La tasa de infección se determina mediante microscopía de fluorescencia en diferentes momentos, lo que permite la evaluación de la capacidad diferencial de las células gliales para controlar la invasión y replicación protozoaria. Estas técnicas representan métodos simples, baratos y eficientes para estudiar las respuestas de los astrocitos y la microglia a las infecciones, abriendo el campo para un análisis de neuroinmunología.

Introducción

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El SNC se compone principalmente de neuronas y células gliales¹^,²^,³. La microglia y los astrocitos son las células glias más abundantes del SNC. Microglia, el macrófago residente, es el inmunocompetente y la célula glia fagocítica en el SNC³^,⁴, mientras que los astrocitos son responsables de mantener la homeostasis y ejercer funciones de apoyo⁵.

A pesar de que las células gliales son clásicamente conocidos por ser responsables del apoyo y la protección de las neurona....

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales relacionados con ratones fueron llevados a cabo de acuerdo con la Ley Nacional de Brasil (11.794/2008) y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP).

1. Extracción, Mantenimiento y Disociación de Células Glial

NOTA: El número de ratones utilizados para la extracción de células gliales depende de la cantidad de células necesarias para realizar los experimentos deseados. En este protocolo, se obtuvieron un total de 2,7 x 10⁷ astrocitos y 4 x 10⁶ microglia de seis ratones C57BL/6....

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Resultados

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En el^día 14, el cultivo de células gliales(Figura 1A)sufrió disociación mecánica. Las poblaciones de células aisladas fueron analizadas por citometría de flujo según los marcadores CD11b, CD45 y GFAP. Podríamos observar una pureza del 89,5% para la población de astrocitos y del 96,6% para la población de microglia(Figura 1B). Después del aislamiento, las células fueron chapadas en una placa plana de 96 pocillos y desp.......

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Discusión

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La importancia de estudiar las funciones aisladas de las células gliales en contextos biológicos distintos se ha ido ampliando en las últimas dos décadas. Comprender el SNC más allá de las neuronas sigue siendo un campo creciente en la biología celular, especialmente en infecciones o condiciones inflamatorias⁸^,⁹^,²⁴. Las células gliales son cruciales no sólo para el soporte físico de las neuronas (como se conocía anteriormente), .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría dar las gracias al profesor Dr. Renato A. Mortara, de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP), por mAb 2C2 anti-Ssp-4. Esta obra fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvención 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B., Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Vacinas (INCTV/CNPq) y Coordena-o de Aperfei-oamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código De Finanzas 001). M.P.A. recibe beca de CNPq, A.L.O.P. recibe beca de CAPES, e I.S.F y L.Z.M.F.B. reciben beca de FAPESP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
70% Etanol	Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea	Cat: 2231	Esterilizar
75 cm² Matraz	Corning	Cat: 430720U	Material plástico
Placa de cultivo celular de 96 pocillos	Greiner Cellstar	Cat: 655090	Cultivo celular
Cloruro de amonio (NH₄Cl)	Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea	Cat: C10337.01.AH
anticuerpo anti-GFAP	Abcam	Cat.: ab49874	Inmunofluorescencia antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μ mm CA	Corning	Cat: 430513	Filtro de medio de cultivo
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	Gato: A7906	FACS Preparación de tampón
CD11b (FITC)	BD Pharmigen	Cat.: 553310	Anticuerpo de citometría de flujo
CD45 (PE)	Invitrogen	Cat.: 12-0451-83	Centrífuga de anticuerpos contra citometría
de	Eppendorf	Cat: 5810R
Centrífuga centrífuga	Eppendorf	5415R	Centrifugación
Clase II cabina de bioseguridad	Pachane	Cat: 200	Cabina de bioseguridad para procedimientos estériles
CO₂ Incubadora	ThermoScientific	Modelo: 3110	Mantenimiento de células primarias
Tubos cónicos 15 mL	Corning	Cat: 430766	Material plástico
Tubos cónicos 50 mL	Corning	Cat: 352070	Material plástico
Contador de células automatizado Countess	Invitrogen	Cat: C10281	Contador de células
DAPI	Invitrogen	Cat.: D1306	Inmunofluorescencia antidoby
Cámara de microscopio digital	Nikon	Cat: DS-RI1 Captura de	imágenes en el microscopio
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	Cat: 12800-058	Medio de cultivo celular
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma Aldrich	Gato: E9884	FACS Preparación tampón
F12 Mezcla de nutrientes	Gibco	Cat: 21700-026	Medio de cultivo celular
FACS Canto II	BD Biosciences	Citómetro de flujo no disponible	Suero
fetal bovino (FBS)	LGC Biotechnology	Cat: 10-bio500-1	Suplemento de medio de cultivo celular
Flow Jo (software)	Flow Jo	Versión: Flow Jo_9.9.4	Análisis de datos
Fluorescencia intensa	Nikon	Cat: C-HGFI	Fuente de fluorescencia
GFAP (APC)	Invitrogen	Cat.: 50-9892-82	Anticuerpo de citometría
Cabra - anti-ratón IgG (FITC)	Kirkeegood& Perry Lab (KPL)	Cat.: 172-1806	Inmunofluorescencia antidoby
HBSS - Solución salina equilibrada de Hank	Gibco	Cat: 14175079	Medio de cultivo celular
HEPES	Sigma Aldrich	Cat: H4034	Suplemento de medio de cultivo celular
Tampón de fijación IC Invitrogen		Cat: 00-8222-49	Fijación celular para citometría de flujo
Microscopio invertido	Nikon	Modelo: ECLIPSE TS100	Microscopio
Isoflurano	Cristá lia	Cat: 21.2665	Anestésico inhalado
Metanol	Synth Cat	: 01A1085.01.BJ	Fijación para Inmunofluorescencia
Micro espátula	ABC inoxidable	Inservible	Material quirúrgico
Microtubo 1,5 mL	Axygen	Cat: MCT-150-C	Material plástico
Anticuerpo monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4	No comercial	No comercial	Inmunofluorescencia antidoby
Pipeta multicanal (p200)	Corning	Cat: 751630124	Reactivos de pipeta
NIS Elements Software	Nikon	Versión 4.0	Adquisición y análisis de imágenes
Leche descremada	Nestlé	Cat: 9442405	Solución bloqueante para inmunofluorescencia
Incubadora agitadora orbital	ThermoScientific	Modelo: 481 Gato: 11	Disociar la microglía de los astrocitos
Paraformaldehído (PFA)	Sigma Aldrich	Gato: P6148	Fijación para inmunofluorescencia
PBS	comercial	No comercial	Tampón neutro
Penicilina G	Sigma Aldrich	Cat: P-7794	Suplemento de medio de cultivo celular
Tampón de permeabilización (10x)	Invitrogen	Cat: 00-8333-56	Permeabilización celular para citometría de flujo
Placa de Petri 60 mm x 15 mm (Desechable, estéril)	Prolab	Cat: 0303-8	Material plástico
Medidor de pH	Kasvi	K39-1014B	Calibrar solución de pH
RPMI 1640 Medio	Gibco	Gato: 31800-014	Medio de cultivo celular
Tijeras	ABC inoxidable	Cat: LO9-W4	Material quirúrgico
Pipeta serológica 10 mL	Corning	Cat: 4101	Material plástico
Pipeta serológica 5 mL	Corning	Cat: 4051	Material plástico
Pipeta monocanal (p1000)	Gilson Pipetman	Cat: F123602	Reactivos de pipeta
individuales Pipeta de canal (p200)	Gilson Pipetman	Cat: F123601	Reactivos de pipeta
Bicarbonato de sodio	Sigma Aldrich	Cat: S6297	Suplemento de medio de cultivo celular
Sal de sulfato de estreptomicina	Sigma Aldrich	Cat: S9137	Suplemento de medio de cultivo celular
Triton X-100	Sigma Aldrich	Cat: T9284	Permeabilización para inmunofluorescencia
Tripsina	Gibco	Cat: 27250-018	Pinzas de enzima digestiva
	ABC inoxidable	Cat: L28-P4-172	Material quirúrgico
Baño de agua	Novatecnica	Modelo: 09020095	Tejido Digeste a 37 ° C con tripsina

Eliminar el de autofluorescencia flujo de flujo No

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
Herculano-Houzel, S.

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Aislamiento de microglia citometr a de flujo microscop a de fluorescencia disociaci n mec nica cultivo celular tratamiento con tripsina lavados con HBSS medio DMEM F12

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