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Artículo de método

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

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DOI:

10.3791/60697

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3 de febrero de 2020

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1Shanghai Key Laboratory of Plant Molecular Sciences, College of Life Sciences, Shanghai Normal University, 2College of Agriculture, Yangtze University, 3Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guizhou Institute of Tobacco Science

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.

Resumen

El silenciamiento del ARN es un mecanismo de regulación genética evolutivamente conservado y específico de la secuencia en eucariotas. Varios patógenos vegetales han evolucionado proteínas con la capacidad de inhibir la vía de silenciamiento de ARN de la planta huésped. A diferencia de las proteínas efectoras del virus, sólo varias proteínas efectoras secretas han demostrado la capacidad de suprimir el silenciamiento de ARN en patógenos bacterianos, oomicécetos y fúngicos, y las funciones moleculares de la mayoría de los efectores siguen siendo en gran medida desconocidas. Aquí, describimos en detalle una versión ligeramente modificada del ensayo de coinfiltración que podría servir como un método general para observar el silenciamiento del ARN y para caracterizar las proteínas efectoras secretadas por patógenos vegetales. Los pasos clave del enfoque son elegir las hojas sanas y completamente desarrolladas, ajustar el cultivo de bacterias a la densidad óptica (OD) adecuada a 600 nm, y observar la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) en el momento óptimo en el infiltrado hojas con el fin de evitar la omisión de efectos con una actividad de supresión débil. Este protocolo mejorado contribuirá a un cribado rápido, preciso y extenso de los supresores de silenciamiento de ARN y servirá como un excelente punto de partida para investigar las funciones moleculares de estas proteínas.

Introducción

En las últimas dos décadas, la aceleración en la secuenciación del genoma de microorganismos que causan enfermedades vegetales ha dado lugar a una brecha de conocimiento cada vez mayor entre la información de secuencia y las funciones biológicas de las proteínas codificadas1. Entre las moléculas reveladas por proyectos de secuenciación se encuentran moléculas efectoras que suprimen la inmunidad innata y facilitan la colonización del huésped; estos factores son secretados por patógenos vegetales destructivos, incluyendo bacterias, nematodos y microbios filamentosos. Para responder a estas amenazas, las plantas anfitrionas han desarrollado nuevos receptores que reconocen a estos efectores, permitiendo la restauración de la respuesta inmune. Por lo tanto, los efectores están sujetos a diversas presiones selectivas, lo que conduce a la diversificación de los repertorios de efectores entre los linajes de patógenos2. En los últimos años, se ha demostrado que los efectores putativos de patógenos vegetales de patógenos vegetales interrumpen la inmunidad innata de las plantas al impedir los procesos celulares del huésped para beneficiar a los microbios de diversas maneras, incluyendo la desregulación de las vías de señalización, transcripción, transporte intracelular, estabilidad del citoesqueleto, tráfico de vesículas y silenciamiento de ARN3,4,5. Sin embargo, la gran mayoría de los efectores patógenos, particularmente los de patógenos filamentosos, han permanecido enigmáticos.

El silenciamiento de ARN es una maquinaria de inactivación genética mediada por homología que se conserva entre los eucariotas. El proceso se desencadena por el ARN de doble cadena (dsRNA) y se dirige al ARN homólogo de una sola cadena (ssRNA) de una manera específica de la secuencia, y manipula una amplia gama de procesos biológicos, incluida la defensa antiviral6. Para superar las respuestas inmunitarias innatas del huésped, algunos virus han evolucionado para compensar el silenciamiento del ARN, incluida la capacidad de replicarse dentro de compartimentos intracelulares o escapar de la señal reorganizada de silenciamiento. Sin embargo, la estrategia más general mediante la cual los virus protegen sus genomas contra la pérdida dependiente del ARN dependiente del silenciamiento de la función génica es codificar proteínas específicas que suprimen el silenciamiento del ARN7,8. Se han establecido varios enfoques mecanicistas diferentes para examinar y caracterizar los supresores virales del silenciamiento de ARN (VSR), incluyendo la coinfiltración de cultivos de Agrobacterium tumefaciens, plantas transgénicas que expresan supresores putativos, injertos y cultivo celular9,10,11,12,13.

Cada uno de estos ensayos tiene ventajas y desventajas, e identifica vsR de su propia manera distinta. Uno de los enfoques más comunes se basa en la co-infiltración de cultivos individuales de A. tmuefaciens que albergan la proteína viral potencial y un gen reportero (típicamente proteína fluorescente verde [GFP]) en las plantas de Nicotiana benthamiana 16c que constituyen la expresión de GFP bajo el control del virus de mosaico de coliflor 35S promotor. En ausencia de un supresor de silenciamiento viral activo, GFP es identificado como exógeno por las células huésped y se silencia dentro de los 3 días después de la infiltración (dpi). Por el contrario, si la proteína viral posee actividad de supresión, el nivel de expresión de GFP se mantiene estable más allá de 3 a 9 ppp9. Este ensayo de co-infiltración es simple y rápido; sin embargo, no es altamente estable ni sensible. No obstante, el ensayo ha identificado numerosos VSR con diversas secuencias y estructuras proteicas en muchos virus de ARN7,8.

Recientemente, varias proteínas efectoras que pueden inhibir la actividad de silenciamiento del ARN celular se han caracterizado por patógenos de plantas bacterianas, oomycete y hongos14,15,16. Estos hallazgos implican que la supresión del silenciamiento del ARN es una estrategia común para facilitar la infección que es utilizada por patógenos en la mayoría de los reinos. En teoría, muchos, si no todos, de los efectores podrían codificar los supresores de silenciamiento de ARN (RSS); hasta la fecha, sin embargo, sólo unos pocos han sido identificados, principalmente debido a la escasez de la estrategia de cribado fiable y general. Además, no se han investigado supresores de silenciamiento de ARN en la gran mayoría de los patógenos vegetales17.

En este informe, presentamos un protocolo optimizado y general para identificar los efectores de patógenos vegetales que pueden suprimir el silenciamiento de ARN local y sistémico utilizando el ensayo de infiltración agroindustrial. El objetivo principal de este estudio fue enfatizar los aspectos clave del protocolo y describir los pasos en detalle, proporcionando así un ensayo de cribado que es adecuado para casi todos los efectores de patógenos vegetales.

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Protocolo

NOTA: Todos los pasos del procedimiento deben realizarse a temperatura ambiente (RT).

ADVERTENCIA: Depositar todos los medios que contengan microbios patógenos, así como las plantas y el tejido vegetal utilizados en el ensayo, en los contenedores de residuos y autoclave apropiados antes de desechar.

1. Preparación de construcciones de plásmidos que contengan efectos putativos

  1. Seleccione los efectores secretos putativos que están altamente expresados durante la infección, según lo determinado por la secuenciación de ARN (RNA-Seq), y más por la técnica cuantitativa de PCR en tiempo real (qRT-PCR).
  2. Determinar el sitio de escisión del péptido de señal de cada efector utilizando una herramienta de software como SignalP18.
  3. Diseñar imprimaciones y realizar PCR para amplificar el gen que codifica el efector de interés utilizando polimerasa de ADN de alta fidelidad. Realice la electroforesis de gel de agarosa para comprobar el producto PCR, luego clone el amplificador en el vector de entrada Gateway pQBV3 utilizando el kit de clonación libre de ligaduras (Tabla de materiales), y posteriormente en el vector de expresión de destino pEG100 utilizando la reacción de recombinación LR19.
  4. Transformar 3 x 5 l de mezcla de reacción LR en 100 l de células competentes de E. coli (p. ej., TOP10, DH5, esparcir las células bacterianas transformadas en el medio de agar Luria-Bertani (LB) complementado con canamicina de 50 g/ml e incubar a 37 oC durante 16 x 20 h.
    NOTA: Los transformadores positivos pueden ser identificados por la colonia PCR20 y analizados más por mini-preparación y secuenciación plásmidos.
  5. Introducir 50 a 100 ng de plásmidos recombinantes que transportan proteína efector en 100 ml de células A. tumefaciens químicamente competentes (p. ej., GV3101 o C58C1), mezclar suavemente y luego congelar en nitrógeno líquido durante 1 min. Descongelar las células en un baño de agua de 37 oC durante 5 min.
  6. Añadir 500 éL de caldo lb e incubar a 30 oC durante 4 x 6 h con un suave temblor, y luego transferir y esparcir todas las células agrobacterianas en el medio de agar LB complementado con kanamicina de 50 g/ml y rifampicina de 50 g/ml a 30 oC durante 2 días.
    NOTA: Los clones positivos pueden ser verificados por la PCR de colonia.
  7. Utilice una sola colonia transformada para experimentos de agroinfiltración a menos que se indique lo contrario.
    NOTA: En la presente investigación, ninguno de los genes efectores probados contenía intrones predichas; cada uno de los genes se amplificó directamente a partir del ADN genómico de un aislado de Phytophthora sojae. Se recomienda un vector de expresión de planta gateway sin ninguna etiqueta, pero no es necesario.

2. Preparación de plantas de N. benthamiana 16c

  1. Preparar mezclas de tierra de maceta que consisten en (por volumen) 50% musgo de turba, 30% perlita, y 20% vermiculita, y autoclave a 120 oC durante 20 min.
  2. Remoje las mezclas de suelo autoclavedas con la solución de fertilizante vegetal (1 g/L) y subempaquetelas en macetas más pequeñas (80 mm x 80 mm x 75 mm) almacenadas en una bandeja más grande (540 mm x 285 mm x 60 mm).
  3. Sembrar una o dos semillas de N. benthamiana 16c sobre la superficie del suelo de cada maceta. Cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen.
  4. Coloque la bandeja bajo cámaras de crecimiento de luz y temperatura controlada con una temperatura de 23 a 25 oC, una humedad relativa del 50 a 60 % y un fotoperiodo de día largo (14 h de luz/10 h de oscuridad, con iluminación de 130 a 150 oC-2s-1).
  5. Quítese la cúpula de plástico después de que las semillas germinen (3 x 4 días) y permita que las plántulas crezcan en las mismas condiciones utilizadas para el paso de germinación.
  6. Añadir una cantidad adecuada de agua, manteniendo el suelo húmedo pero no empapado, cada 2 x 3 días; añadir fertilizante cada 10 días para promover un mayor crecimiento. Mantener las plantas de N. benthamiana 16c en condiciones normales hasta que estén listas para su uso; en esta etapa la planta debe tener al menos cinco hojas verdaderas completamente desarrolladas y no visible axilar o brotes de flores, y las hojas deben tener un aspecto verde saludable).
  7. Utilice hojas de 3 a 4 semanas de n. benthamiana 16c para ensayos locales de silenciamiento de ARN, y plantas jóvenes de N. benthamiana 16c (10-14 días de edad) para ensayos sistémicos de silenciamiento de ARN.
    NOTA: Las condiciones e instalaciones de crecimiento de las plantas varían según los laboratorios; elegir hojas sanas, bien desarrolladas y completamente expandidas para la infiltración.

3. Preparación del cultivo de Agrobacterium para la infiltración

  1. Escoge una colonia positiva de la placa LB e inocula las células en un tubo de vidrio que contiene 5 ml de medio LB complementado con kanamicina de 50 g/ml y rifampicina de 50 g/ml. Cultivar las células a 30 oC con agitación a 200 rpm durante 24 x 48 h.
  2. Transferir 100 l de cultivo a 5 ml de medio de LB suplementado con los mismos antibióticos, 10 mM 2-(N-morpholino) ácido etanosulfónico (MES; pH 5.6) y 20 m acetosyringone (AS). Cultivar bacterias a 30 oC con agitación a 200 rpm durante 16 x 20 h.
  3. Células centrífugas a 4.000 x g durante 10 min. Vierta el sobrenadante y resuspenda el pellet en 2 ml de tampón MgCl2 de 10 mM.
  4. Repita el paso 3.3 para asegurar la eliminación completa de antibióticos.
  5. Determinar la densidad del cultivo de Agrobacterium midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600). Ajustar a un OD600 de 1.5 x 2.0 con 10 mM MgCl2 tampón.
  6. Añadir 10 mM MES (pH 5.6) y 150 m AS a los cultivos de suspensión final e incubar las células a RT durante al menos 3 horas sin agitar.
    NOTA: No deje los cultivos de suspensión final durante la noche.

4. Co-infiltración N. hojas de benthamiana

  1. Mezclar volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contiene 35S-GFP con un cultivo de Agrobacterium que contiene 35S- supresor de virus de mosaico de pepino 2b (CMV2b), efector putativo, o vector vacío (EV).
  2. Infíldese cuidadosamente y lentamente las suspensiones mixtas de agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de N. benthamiana 16c utilizando una jeringa sin aguja de 1 ml.
  3. Retire la suspensión bacteriana restante de las hojas con limpiaparabrisas de tejido blando y circule los márgenes de los parches infiltrados con una pluma de fabricante.
  4. Deje las plantas infiltradas en la cámara de crecimiento en las mismas condiciones de crecimiento.
    NOTA: Por razones de seguridad y salud, se deben usar gafas protectoras y una máscara durante la infiltración. Para evitar la contaminación cruzada, los guantes deben cambiarse o esterilizarse con etanol entre infiltraciones. Normalmente se necesita al menos 1 ml de suspensiones de agrobacterium por hoja para la infiltración. Para el silenciamiento sistémico, se requerirán al menos dos hojas para la infiltración.

5. Análisis de imágenes GFP

  1. Detectar visualmente la fluorescencia GFP en hojas recién cultivadas de plantas enteras 2 semanas después de la infiltración (para el silenciamiento sistémico del ARN) o parches infiltrados de hojas de 3 x 4 ppp utilizando una lámpara ultravioleta de onda larga (UV) sin colección de hojas.
  2. Fotografía recogida plantas y / o hojas separadas con una cámara digital equipada con filtros UV y amarillos.
    NOTA: Para los ensayos de supresión de silenciamiento local, investigue parches infiltrados de hojas de N. benthamiana 16c, mientras que para la actividad de supresión de silenciamiento sistémico, investigue las hojas recién cultivadas. La actividad de supresión del silenciamiento del ARN puede variar según los efectores individuales. Por lo tanto, observe los parches o hojas durante unos días a partir de 3 dpi. Utilice CMV2b y EV como controles positivos y negativos, respectivamente.

6. Análisis de la mancha del norte de los niveles de ARNm de la PFP en las hojas infiltradas

  1. Aislamiento del ARN total del tejido de la hoja utilizando el reactivo de aislamiento de ARN(Tabla de materiales)
    1. Recoger los tejidos de las hojas de parches infiltrados de N. benthamiana 16c a 4 x 7 dpi, pulverizar en nitrógeno líquido a un polvo fino, y transferir el polvo a un tubo estéril de 2 ml.
    2. Añadir el reactivo de aislamiento de ARN (1 ml/100 mg de tejido) inmediatamente al tubo muestreado en una campana, agitar vigorosamente para homogeneizar e incubar a RT durante 5 min.
    3. Añadir cloroformo (reactivo de aislamiento de ARN de 200 L/1 ml) a cada tubo de una campana, agitar vigorosamente durante 15 s e incubar a RT durante 5 min. Centrifuge el homogeneato a 12.000 x g durante 15 min a 4 oC.
    4. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNase y deseche el pellet. Añadir 0,7 volumen de isopropanol al sobrenadante, invertir suavemente varias veces e incubar la mezcla a RT durante 10 min.
    5. Precipitar el pellet de ARN por centrifugación a 12.000 x g durante 15 min a 4oC.
    6. Deseche el sobrenadante, lave el pellet con 70% de etanol y seque al aire el pellet en una campana. Disolver el ARN en agua tratada con piropenato (DEPC) incubando en un baño de agua de 65 oC durante 10 a 20 min.
  2. Análisis de la mancha del norte del nivel de ARNm de la FPG en las hojas infiltradas
    1. Preparar un gel de agarosa desnaturalante de formaldehdehida del 1,2% en 1 búfer de carrera MOPS.
    2. Mezclar el ARN 1:1 con el tinte de carga de ARN y la desnaturalidad por incubación a 65 oC durante 10 min, enfriar inmediatamente las muestras desnaturalizadas sobre hielo durante 1 min.
    3. Cargue las muestras en el gel y electroforrese a 100 V durante 50 minutos hasta que el ARN esté bien separado.
    4. Enjuague el gel en 20x tampón de citrato salino-sódico (SSC) para eliminar el formaldehído y transferir el gel a la membrana de nylon por transferencia capilar en 20x tampón SSC durante la noche. Sumerja la membrana en 2x SSC y fije el ARN a la membrana exponiendo la membrana húmeda a la unión uv..
    5. Añadir la cantidad adecuada de tampón de hibridación (10 ml por membrana de 100 cm2; Tabla de Materiales) en un tubo de hibridación y agitar a 60 oC en un horno de hibridación.
    6. Poner la membrana en el tubo de hibridación e incubar durante 60 min a 60oC. Diluir una sonda de ADN con etiqueta 5'DIG (concentración final, 50 ng/ml) en la solución de hibridación que contiene un búfer de hibridación precalentado.
    7. Deseche el búfer de prehibridación y sustitúyalo inmediatamente por una solución de hibridación precalentada que contenga la sonda con la etiqueta DIG. Incubar la mancha con sonda a 60oC durante la noche, con una agitación suave.
    8. Después de la hibridación, lavar la membrana dos veces en tampones de creciente rigente a 60 oC durante 20 minutos cada uno. Limpie suavemente la membrana para eliminar el tampón de lavado adicional y añadir los reactivos como se sugiere en el kit de hibridación y detección quimioluminiscente(Tabla de materiales).
    9. Detectar señales hibridadas por reacción quimioluminiscente combinada con el sistema de imágenes.

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Resultados

Arriba, describimos el procedimiento paso a paso para un ensayo de cribado mejorado para evaluar la actividad RSS de los efectores De P. sojae RxLR. En total, el experimento toma de 5 a 6 semanas. Posteriormente, los RSS identificados por el ensayo pueden caracterizarse aún más en términos de función y mecanismo molecular. Como ejemplo de nuestro enfoque, utilizamos el supresor Phytophthora de P. sojae RxLR effecto de silenciamiento de ARN 1 (PSR1), que se secreta y se e...

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Discusión

El silenciamiento de ARN es un mecanismo de defensa clave empleado por las plantas para combatir patógenos virales, bacterianos, oomycete y hongos. A su vez, estos microbios han evolucionado las proteínas supresoras de silenciamiento para contrarrestar el silenciamiento antiviral, y estos RSS interfieren con diferentes pasos de la vía de silenciamiento del ARN22,23. Se han desarrollado varios ensayos de cribado para identificar los RSS10.<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del "Programa Shuguang" de la Fundación para el Desarrollo Educativo de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái, el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China Programa Nacional de I+D Clave de China ( 2018YFD0201500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.o 31571696 y 31660510), el Programa de Mil Talentos para Jóvenes Profesionales de China, y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (18DZ2260500).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES)Biofroxx1086GR500Tampón
2xTaq Master MixVazyme BiotechP112-AAPCR
3-(N-morfolino) ácido propanosulfónico (MOPS)Amresco0264C507-1KGMOPS Tampón
acetosiringona (AS)Sigma-AldrichD134406-5GInducción de
agarAgrobacteriumSigma-AldrichA1296-1KGLB medio
AgarosaBiofroxx1110GR100Electroforesis
Amersham Hybond -N+GE HealthcareRPN303 BNothern blot
Amersham ImagerGE HealthcareAmersham Imager 600Image
Bacto TryptoneBD Biosciences211705LB medio
Bacto Extracciónde levaduraBD Biosciences212750LB
CámaraNikonD5100Fotografía
ChemiDoc MP Sistema de imagenBio-Rad
Módulo de detección quimioluminiscente componente de los kits dafaThermo Fisher Scientific89880Detección de luminiscencia
CloranfenicolAmresco0230-100GAntibióticos
ClonExpress II Kit de clonación en un solo pasoVazyme BiotechC112-01Ligadura
DIG Easy HybSigma-Aldrich11603558001Tampón de hibridación
Easypure Kit de minipreparación de plásmidosTransGen BiotechEM101-02Extracción de plásmidos
EasyPure Kit de extracción rápida de gelTransGen BiotechEG101-02Extracción de gel
EDTA sal disódica dihidratadaAmresco/VWR0105-1KGMOPS Fuente
alimentación de electroforesisLiuYiDYY6DElectroforesis de ácido nucleico.
FastDigest EcoRVThermo Fisher ScientificFD0304Digestión vectorial
Sistema de imagen en gel TanonTanon3500Imagen
GentamicinaAmresco0304-5GAntibióticos
Sulfato de kanamicinaSigma-AldrichK1914Antibióticos
LR Enzima clonasa IIInvitrogen11791020Reacción
LRNitrocelulosa Membrana secante 0.45umGE Healthcare10600002Northern
NORTH2south Kit de etiquetado de ADN de primera calidad aleatorio de biotinaThermo Fisher Scientific17075etiquetado de biotina
TermocicladoresBio-RadT100PCR
TurbaPINDSTRUPOro oscuro + arcillaPlantas
Peters Fertilizante soluble en aguaICEPeter Fertilizante profesional 20-20-20
Phanta Max ADN polimerasa de superfidelidadVazyme BiotechP505-d1Enzima
rifampicinaMP Biomedicals219549005antibióticos
Tinte de carga de gel de ARN (2X)Thermo Fisher ScientificR0641Tinte de carga de gel de ARN
Acetato de sodio TampónAmresco/VWR0530-1KGMOPS
Cloruro de sodioAmresco0241-10KGLB medio
Citrato trisódicoAmresco0101-1KGSSC Tampón
Trizol ReactivoInvitrogen 15596018reactivo de aislamiento de ARN
Analytik JenaUVP B-100APObservación
UVP Horno HybrilinkerAnalytik JenaOV2000Northern
mediana de de tampón PCR de

Referencias

  1. Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
  2. Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
  3. Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
  4. Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
  5. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
  6. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
  7. Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
  8. Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
  9. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
  10. Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
  11. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
  12. Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
  13. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  14. Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
  15. Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
  16. Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
  17. Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
  18. Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
  19. Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
  20. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
  21. Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
  22. Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
  23. Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
  24. Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).

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