Method Article

KRAS4b recombinante totalmente procesado: Aislamiento y caracterización de la proteína farnesilada y metilada

DOI:

10.3791/60703

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January 16th, 2020

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1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

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La prenilación es una modificación importante en las proteínas de unión de membrana periférica. Las células de insectos se pueden manipular para producir KRAS4b farnesilado y carboximetilado en cantidades que permiten mediciones biofísicas de interacciones proteína-proteína y proteína-lípidos

Abstract

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La prenilación proteica es una modificación clave que es responsable de dirigir las proteínas a las membranas intracelulares. KRAS4b, que está mutado en el 22% de los cánceres humanos, es procesado por farnesylation y carboximetilación debido a la presencia de un motivo de caja 'CAAX' en la terminal C. Se utilizó un sistema de baculovirus diseñado para expresar KRAS4b farnesylated y carboxymethylated en células de insectos y se ha descrito anteriormente. Aquí, describimos la purificación detallada y práctica y la caracterización bioquímica de la proteína. Específicamente, la afinidad y la cromatografía de intercambio iónico se utilizaron para purificar la proteína a la homogeneidad. Se utilizó espectrometría de masas intacta y nativa para validar la correcta modificación de KRAS4b y para verificar la unión de nucleótidos. Finalmente, la asociación de membranas de KRAS4b farnesylated y carboximetilado a liposomas se midió utilizando espectroscopía de resonancia plasmórica superficial.

Introduction

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Las modificaciones posttranslacionales desempeñan un papel clave en la definición de la actividad funcional de las proteínas. Modificaciones como la fosforilación y la glicosilación están bien establecidas. Sin embargo, las modificaciones de lípidos están menos bien caracterizadas. Se estima que hasta el 0,5% de todas las proteínas celulares pueden ser preniladas1. La prenilación es la transferencia de una farnesil de 15 carbonoos o una cadena de lípidos de geranylgeranilo de 20 carbono a una proteína de recepción que contiene el motivo CAAX2. Las proteínas preniladas se han implicado en la progresión de varias enfermeda....

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Protocol

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1. Purificación de proteínas

  1. Prepare los buffers A–H, como se ve en la Tabla 1.
Solución de búferAgente de almacenamiento en búfer (todos 20 mM) pH NaCl (mM)imidazol (mM)MgCl2 TCEP
UnHEPES7.3300-5
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Results

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Una de las variables más grandes en el protocolo es la cantidad de proteína diana expresada (His6-MBP-tev-KRAS4b). Este protocolo fue desarrollado utilizando un aislado de una línea celular Trichoplusia ni, Tni-FNL17,adaptada para el crecimiento de la suspensión y destetado del suero. Dada la amplia gama de resultados reportados a través de las diversas líneas celulares de insectos con el sistema de expresión de baculovirus, es aconsejable que Tni-FNL se utilice, al menos inicialmente, pa.......

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Discussion

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Como se indica en la sección Resultados representativos, el paso más crítico durante la purificación es el manejo de la muestra durante el tiempo que se encuentra en sal más baja. Limitar el tiempo que la muestra está expuesta a menos de 200 mM NaCl ayudará a reducir la precipitación y aumentar el rendimiento de la muestra. La interpretación de los resultados del CEX puede ser difícil si el perfil no coincide con las expectativas (véase la figura 2). Hasta que el protocolo se haya convertido.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Reconocemos la clonación y el apoyo a la expresión de Carissa Grose, Jen Melhalko y Matt Drew en el Laboratorio de Expresión de Proteínas, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Este proyecto ha sido financiado total o parcialmente con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica la aprobación por parte del Gobierno de los Estados Unidos

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos Safe-Lock de 1,8 mL,Eppendorf22363204
11 mm Cl SS Inserto con enclavamiento Viales de muestreadorautomático Thermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC)AVANTI POLAR LIPIDScomprar como existencias líquidas en cloroformo
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS)AVANTI LÍPIDOS POLARES840034comprar como existencias líquidas en cloroformo
5427R CentrífugaEppendorf
Acetonitrilo, Grado HPLCFisher ChemicalA998-1 1L
Acetato de amonioSigma-Aldrich09689-250g
Gas argónAirgasARUP
Placa de ensayo 384CORNING3544
Instrumento Biacore T200GE Healthcare
Sellos Snap-It Azules, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Baño ultrasónicoThermo Fisher15-336-1000
Columna de cromatografía de intercambio catiónico (CEX)GE Healthcare Ciencias de la Vida29018183HiPrep SP Sepharose
CHAPSSigmade alto rendimientoC3023
Lector de placas Dyna ProWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Espectrómetro de masasÁcido
Sigma-AldrichF0507-500MlUso Reactivo Grado o mejor
Viales Gilson 7x14 mm Tubos GEHealthcareBR-1002-12
Viales de rosca de tornillo de vidrio con revestimientos de espuma dePTFEScientific SpecialitiesB69302
Centrífuga de alta velocidad/de sobremesaThermo Fischer Scientific05-112-114Dcapaz de hasta 4.000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) proteasaAddgene92414Purificado según Raran-Kurussi et al. (2017) Eliminación de etiquetas de afinidad con TEV Proteasa. En: Burgess-Brown N. (eds) Expresión génica heteróloga en E. coli. Métodos en Biología Molecular, vol 1586. Humana Press, Nueva York, NY
Cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) columnaGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Suministro de agua interno, Arium AdvanceSartorius StedimResistividad de 18 MΩ
Juego de extrusoras de lípidosAVANTI POLAR LIPIDS
Nitrógeno líquidoAirgasNI-DEWAR
M110-EH MicrofluidicMicrofluidics
MabPac RP Columna UHPLC, 4 mmm, 3,0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Columna, 5 mmm, 300 Å, 2,1 x 150 mmThermo Scientific088790
Software MagTranMetanol Thermo Scientific
, grado HPLC Productosquímicos VWRBDH20864.400
Sistema de cromatografía NGCBioRad78880002NGC QuestTM 100 Sistema de cromatografía
Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA u otros quelantesMillipore SigmaP8849
Tapones de goma tipo 3GE HealthcareBR-1005-02
Serie S Chip sensor L1
Thermo Fischer Scientific13-400-519Absorbace a 280nm
Ultra-15 Unidades de filtro centrífugo, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008MEMBRANA PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Filtros de centrífugaAmiconUFC501024
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima - L80Kcon capacidad de 100.000 xg
Vanquish UHPLC (bomba, corazón de columna y sistema LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Water, HPLC GradeSigma-Aldrich270733-1LPuede utilizar una fuente de agua interna (ver más abajo)
Jeringa Whatman GD/XP PES de 0,45 mm filtroGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificsoftware de proteómica
Natural 850457 fórmico termocientífico de 0 cm con soporte 610023 GE Healthcare Espectrofotómetro 29104993

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

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KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

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