Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.
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Artículo de método
Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos
En este artículo
Resumen
Resumen
Describimos una técnica para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en Drosophila. Usamos un tinte lipofílico disuelto con aceite y entregamos una pequeña gota a una preparación de filete embrionario por un microinyector. Cada neurona motora cuya membrana es contactada por la gota puede entonces ser etiquetada rápidamente. Las neuronas motoras individuales se etiquetan continuamente, lo que permite visualizar claramente los detalles estructurales finos. Dado que los colorantes lipofílicos vienen en varios colores, la técnica también proporciona un medio para conseguir neuronas adyacentes etiquetadas en multicolor. Esta técnica de rastreo es por lo tanto útil para el estudio de la morfogénesis neuronal y la conectividad sináptica en el sistema de neuronas motoras de Drosophila.
Introducción
El sistema de neuronas motoras embrionarias de Drosophila ofrece un potente modelo experimental para analizar los mecanismos subyacentes al desarrollo del sistema nervioso central (SNC)1,2,3. El sistema de neuronas motoras es susceptible de técnicas bioquímicas, genéticas, de imágenes y electrofisiológicas. Utilizando las técnicas, las manipulaciones genéticas y los análisis funcionales se pueden llevar a cabo a nivel de neuronas motoras individuales2,4,5,
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Protocolo
1. Equipos y suministros
- Materiales para recoger embriones y entrenar a adultos para poner óvulos
- Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa.
NOTA: Alternativamente, los coladores celulares con poros de 100 m(Tabla de Materiales)se pueden utilizar para el paso de filtración de la recolección de embriones. - Hacer platos de agar con premezcla de agar de uva(Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones enumeradas. Revuelva brevemente 1 ....
- Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa.
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Resultados
Una imagen representativa de las neuronas motoras aCC y RP3 se muestra en la Figura 3C para demostrar el etiquetado multicolor de las neuronas motoras a 15 h AEL. Sus morfologías dendríticas son en gran medida invariables entre embriones. El patrón de tinción obtenido con anticuerpos anti-HRP se muestra en gris. Una pequeña gota de DiO o DiD fue depositada en el NMJ del músculo 1 o 6/7, respectivamente. La Figura 4 demuestra la capacidad de medi.......
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Discusión
El uso del etiquetado de tintes para estudiar la morfología neuronal tiene varias ventajas sobre las técnicas genéticas de etiquetado celular. La técnica de etiquetado de tintes puede minimizar la cantidad de tiempo necesario para etiquetar e tomar imágenes de las morfologías de las neuronas motoras. El proceso de etiquetado del tinte es bastante rápido, ya que toma menos de 2 h y nos permite definir el contorno de las proyecciones neuronales. Como alternativa, se puede visualizar la neurona motora aCC eligiendo una líne.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del Laboratorio Kamiyama por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. y D.K.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lente de objetivo 10x | Nikon | Plan | |
| Lente de inmersión en agua de 40x | Nikon | NIR Apo | |
| Tubo capilar | Frederick Haer& Co | 27-31-1 | |
| Microscopio confocal | Andor | N/A | Dragonfly Unidad confocal de disco giratorio |
| Cubreobjetos | Corning | 22x22 mm Cuadrado #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Microscopio de disección | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Cinta adhesiva de doble cara | Scotch | 665 | |
| Dow Corning Grasa de alto vacío | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Jaula de recolección de huevos | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | descatalogado | FemtoJet 4i (n.º de cat 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Software de procesamiento de imágenes | |
| Micromanipulador | Sutter | MP-225 | |
| Biseladora de micropipetas | Sutter | BV-10-B | |
| Extractor de agujas | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Agar de uva Polvo Paquetes de premezcla | FlyStuff | 47-102 | |
| Filtro de red de nailon | Millipore | ||
| Solución de paraformaldehído al 16%, grado EM | Ciencias de la microscopía electrónica 15710 | Cualquier grado | |
| EM PBS | Roche | 11666789001 | Vendido en sigmaaldrich, solución 10x |
| en caja Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Agente humectante |
| Microscopio de fluorescencia vertical | Nikon | N/A | Eclipse Ci con una fuente de luz LED |
| Cinta aislante de vinilo | Scotch | 6143 | |
| VWR Coladores de celdas VWR | 10199-659 | ||
| Levadura | FlyStuff | 62-103 | Levadura seca activa (RED STAR) |
Referencias
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new te....
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Reimpresiones y permisos
