Artículo de método

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

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DOI:

10.3791/60718

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6 de marzo de 2020

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1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2Department of Pharmacology, Second Military Medical University

En este artículo

Resumen

Para ver y cuantificar las características internas de las biopelículas de Candida albicans, preparamos especímenes fijos intactos que se clarifican mediante la coincidencia del índice de refracción. A continuación, la microscopía de seccionamiento óptico se puede utilizar para obtener datos de imagen tridimensionales a través del espesor completo de la biopelícula.

Resumen

El hongo microbiano Candida albicans puede experimentar un cambio de la colonización commensal a la virulencia que está fuertemente correlacionada con su capacidad para cambiar del crecimiento de la forma de levadura al crecimiento hiphal. Las células que inician este proceso se vuelven adherentes a las superficies, así como entre sí, con el desarrollo resultante de una colonia de biopelículas. Esto ocurre comúnmente no sólo en las superficies del tejido mucoso en las infecciones por hongos, sino también en implantes médicos como catéteres. Es bien sabido que las células de biopelícula son resistentes a los medicamentos antifúngicos, y que las células que se desprenden de la biopelícula pueden conducir a infecciones sistémicas peligrosas. Las biopelículas varían de muy translúcidas a opacas debido a la heterogeneidad refractiva. Por lo tanto, las biopelículas fúngicas son difíciles de estudiar mediante microscopía óptica. Para visualizar las características estructurales internas, celulares y subcelulares, aclaramos las biopelículas intactas fijas mediante el intercambio escalonado de disolventes hasta un punto de coincidencia óptima del índice de refracción. En el caso de las biopelículas de C. albicans, se logra una aclaración suficiente con salicilato de metilo (n a 1.537) para permitir la microscopía confocal desde el ápice hasta la base en biopelículas de 600 m con poca atenuación. En este protocolo de visualización delineamos la refractometría de contraste de fase, el crecimiento de biopelículas de laboratorio, la fijación, la tinción, el intercambio de disolventes, la configuración de la microscopía de fluorescencia confocal y los resultados representativos.

Introducción

Candida albicans es un hongo microbiano que es típicamente commensal en los seres humanos. Es de interés fundamental para los biólogos porque el organismo tiene múltiples morfologías. Por ejemplo, en respuesta a ciertas señales ambientales o estresores, las células en ciernes en forma de levadura cambiarán al crecimiento filamentoso como cadenas septantes de células altamente alargadas conocidas como hifas. La transición es importante como ejemplo de expresión fenotípica de un cambio entre un programa de expresión génica unicelular y multicelular. Del mismo modo, C. albicans es de interés biomédico porque el organismo es un patógeno oportunista bien conocido. Es responsable de infecciones por hongos mucosos como el zorzal (candidiasis oral), infecciones genitourinarias y una causa de infecciones invasivas o sistémicas peligrosas en pacientes inmunológicamente debilitados.

El potencial de virulencia de este organismo está estrechamente relacionado con sus múltiples morfotipos y otros aspectos de su versatilidad genética1,2,3,4. La extensión del tubo germinal, la primera etapa visible de la transición al crecimiento hiphal, se produce con suficiente rapidez para permitir que las células Binacanas engullidas salgan de los fagocitos y así escapar de una fase temprana de la respuesta inmune celular del huésped5. Además, la filamentación va precedida y acompañada de un gran aumento de la adherencia de célula a célula y célula a superficie que se debe a la expresión regulada de varias clases de proteínas de pared celular conocidas como adhesinas6,7,8,9. En una amplia variedad de condiciones, la combinación de adherencia y filamentación resulta en un cambio dramático del crecimiento plancónico, unicelular al crecimiento colonial asociado a la superficie que forma una biopelícula. C. biofilms albicans pueden desarrollarse en dispositivos médicos implantados comunes como catéteres venosos. Las infecciones diseminadas pueden resultar cuando tales biopelículas comienzan a brotar de las células de forma de levadura y arrojarlas a la sangre circulante. Múltiples estudios han demostrado que las células biopelículas son más resistentes a los medicamentos antifúngicos que las células planctónicas10,11, que pueden deberse en parte a la reducción del metabolismo12. Además, la alta adherencia general de una biopelícula puede proporcionar el anclaje necesario para el crecimiento invasivo eficiente de hifas en el tejido huésped1.

La aclaración óptica de las biopelículas de C. albicans mediante la coincidencia de índices refractivos ha tenido un impacto importante en nuestra capacidad para visualizar la estructura de esta comunidad microbiana y descubrir relaciones entre la expresión génica y el fenotipo. Las biopelículas cultivadas en el laboratorio en superficies de ensayo bajo medio de cultivo líquido durante 48 h aparecen como un recubrimiento blanquecino que es lo suficientemente denso y lo suficientemente grueso como para ser opaco(Figura 1). Por lo tanto, muchas características fenotípicas interesantes de la biopelícula se ocultan a la vista. Las biopelículas de 24 h de tipo silvestre cultivadas en YPD, RPMI-1640, o medio araña a un rango de 37 oC de hasta 300 m de espesor, con biopelículas de 48 h que a menudo alcanzan los 500 m. La opacidad se debe a la dispersión de la luz, que surge de la heterogeneidad refractiva: la pared celular del hongo es más refractiva que el medio circundante, y el citoplasma ligeramente más refractivo que la pared celular. La alta densidad óptica resultante de una biopelícula nativa oscurece todas las estructuras de más de 30 m de profundidad cuando se ve con un microscopio convencional o incluso un escáner confocal(Figura 2). Sin embargo, se puede lograr un gran grado de aclaración infiltrando biopelículas fijas con un líquido de alto índice de refracción que coincide aproximadamente con la refracción de los principales componentes celulares. Después de la clarificación, las imágenes a resolución submicrones se pueden llevar a cabo mediante microscopía confocal a través de todo el espesor de casi cualquier biopelícula C. albicans 13. En especímenes de tipo silvestre, es fácil ver que las biopelículas consisten en hifas largas enredadas, racimos de células de forma de levadura en ciernes o células pseudohyphal, espacios vacíos y cierta cantidad de matriz extracelular. Además, las biopelículas generalmente se estratifican, mostrando diferencias morfológicas espacialmente variables en el tipo de célula, la densidad celular y la presencia de células en ciernes o ramificadas. Muchas variaciones en una o más de estas características se han observado en biopelículas desarrolladas por cepas mutantes14,15. Además, las cepas de reporteromuestran diferencias espaciales in situ en la expresión génica16,9,13. El sorprendente grado de aclaración que se puede obtener con este enfoque relativamente simple y económico también permite ver que muchas biopelículas incluyen hifas apicales e hifas invasivas basales que se extienden a distancias milimétricas.

En este protocolo de visualización, demostramos la fijación, etiquetado, aclaración e imagen de un biofilm de C. albicans utilizando un simple marcador de pared celular como mancha. El origen de la presente versión del protocolo es la claridad mejorada que observamos cuando las biopelículas fijas con formaldehído fueron infiltradas con metacrilato de glicol (GMA) al 97%, que luego fue polimerizado para incrustar la biopelícula en un plástico duro con un índice de refracción moderadamente alto (n.o 1,49). A continuación, utilizamos la microscopía de contraste de fase convencional y una serie de líquidos de referencia de índice de refracción para determinar con mayor precisión el punto de inversión de contraste (transparencia máxima) del biofilm(Figura 3). En el número de biopelículas de C. albicans, esto se produjo cerca de n x 1.530, lo que fue sorprendentemente alto dado que una estructura proteica densa como la queratina capilar es sólo ligeramente más refractiva (1,54–1,55). Aunque se encuentra en el extremo superior del rango óptimo en la Figura 3,adoptamos el salicilato de metilo (aceite de verde invernal, n a 1.537) en el protocolo actual porque durante mucho tiempo se ha utilizado como agente clarificador para la microscopía en embriología e histología, tiene baja toxicidad y baja presión de vapor, y dio excelentes resultados en nuestros ensayos utilizando la óptica de inmersión de aceite moderado-NA.

Aquí deben hacerse cuatro puntos:

(1) Con pocas excepciones, la situación ideal en microscopía es que el índice de refracción de la muestra debe ser igual al índice de refracción del fluido de inmersión objetivo de la lente17,18,13. Para estudios de imágenes tridimensionales (3D) donde el enfoque profundo es necesario, esto siempre es importante.

(2) Nuestro resultado experimental para una limpieza óptima (n .525–1.535) es ligeramente superior a los aceites de inmersión estándar (n a 1.515, 1.518) y, por lo tanto, infringe el punto (1), y por lo tanto introduce una fuente de aberración esférica cuando se utiliza la óptica de inmersión de aceite estándar. Una solución a este problema es el uso de un objetivo diseñado para un índice de inmersión en el rango superior. Debido a un resurgimiento del interés en las muestras limpiadas por imágenes, los objetivos especiales con la corrección necesaria están llegando a estar disponibles. La otra solución es ajustar el índice del medio clarificador hasta 1.515 o 1.518 mediante la adición de una pequeña cantidad de butanol (n a 1.399) para un rendimiento óptimo de inmersión en aceite, y aceptar la claridad ligeramente degradada.

(3) La microscopía de biopelículas intactas (y otros especímenes en esta escala) requiere una distancia de trabajo significativa para acomodar el espesor de la muestra. Esta es una consideración práctica importante. Una larga distancia de trabajo limita la óptica a una apertura numérica moderada (NA - 0.6–1.25), lo que limita la resolución, pero también limita la gravedad de la aberración esférica.

(4) El índice óptimo de refracción para la clarificación puede ser diferente para otros tipos de muestras fijas. Los especímenes deben probarse en consecuencia utilizando contraste de fase y una serie de líquidos de referencia de índice de refracción, como se muestra en la Figura 3.

Protocolo

1. Crecimiento de las culturas de biopelículas

ADVERTENCIA: Candida albicans es un patógeno humano. En algunas instituciones, el cultivo de este organismo requiere contención BSL-2.

  1. Saca la cepa seleccionada en una placa de agar extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) y crece 48 h a 30oC.
  2. Seleccione colonias individuales de la placa para inocular 5 ml de medio YPD en tubos de cultivo de 15 ml para el crecimiento aeróbico nocturno (rotador de carrusel, 52-55 rpm) a 30 oC.
  3. Determine la densidad celular utilizando una dilución de 40 a 50 veces del cultivo nocturno. Calcular el factor de dilución necesario para llevar la densidad celular a 3 x 106 celdas/ml para sustratos de silicona, o 0.6–1.2 x 106 células/ml para superficies de vidrio de cubierta tratadas con concanavalina-A (ConA) o aglutinina de trigo-germina (WGA) (ver discusión).
  4. Para el crecimiento de biopelículas en una placa de 12 pocillos(Figura 1),dispensar 2,0 ml de medio de filamentación estéril en cada poca, y calentar la placa a 37 oC en una incubadora humidificada. Una variedad de medios inducirá la filamentación, más fuertemente a una temperatura elevada (37 oC) y con suero añadido. Se recomienda el suero bovino fetal (FBS). Los medios recomendados son YPD, Spider-Mannitol o RPMI-1640.
  5. Con pinzas estériles, coloque un sustrato preparado en cada pocil en la placa calentada y desaloje las burbujas. Agregue el inóculo del cultivo nocturno para alcanzar la densidad celular recomendada en el paso 1.3 en cada pozo. Un pozo sin inóculo sirve como blanco visual y control contra la contaminación.
  6. Coloque la placa en un mezclador orbital de 60 rpm en una incubadora de aire humidificada de 37 oC durante 90 minutos para permitir tiempo de adhesión celular. Después de 90 minutos, retire las células medianas y no conectadas, lave con solución salina estéril mediana o tamponada de fosfato (PBS) y coloque los sustratos inoculados en platos de cultivo u otra placa multipozo que contenga un medio de filamentación precalentado. Con placas multipocillos, es muy conveniente utilizar una segunda placa para el paso de lavado y una tercera placa con 2,0 ml de medio precalentado por pocilla para recibir los sustratos inoculados lavados. Esterilice las pinzas antes de cada transferencia.
  7. Devolver la placa a la incubadora de aire ambiente humidificado de 37oC y hacer crecer las biopelículas hasta 48 h con una mezcla orbital de 60 rpm para la aireación. Debe haber poco crecimiento planctónico en cada cultivo a menos que el biofilm en desarrollo esté derramando células de forma de levadura. En la Figura 1se muestra una biopelícula cultivada de esta manera.

2. Procesamiento de muestras para imágenes

PRECAUCION: Los fijadores de aldehído son volátiles y peligrosos. Preparar diluciones fijativas en una campana de humo, no en un gabinete de bioseguridad. No coloque fijadores en incubadoras utilizadas para células vivas. Trabaje con fijadores diluidos en platos cubiertos en una campana de humos o una zona de sobremesa bien ventilada. Deseche los fijadores y las soluciones de lavado post-fijación como residuos peligrosos.

  1. Preparar un fijador fresco, 4% de formaldehído o paraformaldehído en PBS, opcionalmente con hasta un 2% de glutaraldehído. La formalina diluida al 4% se puede utilizar para el trabajo de rutina.
    NOTA: Glutaraldehído en particular aumentará la autofluorescencia de banda ancha y puede atenuar la fluorescencia de etiquetas expresibles como dTomato.
  2. Retire el medio de cultivo de la muestra y reemplácelo con PBS para diluir las proteínas séricas, o transfiera la biopelícula en su sustrato a PBS, durante varios minutos.
  3. Transfiera la muestra a un fijador, y ajuste la placa cubierta en un mezclador orbital lento durante 20 minutos. Extender el período de tiempo al procesar muestras más gruesas (ver Discusión). Se debe añadir un volumen fijador suficiente a cada plato para sumergir todo el crecimiento del biofilm, incluyendo cualquier en los lados internos del plato.
  4. Retire el fijador y rellene el plato con PBS para lavar el fijador residual. Deseche el fijador como residuo peligroso. Repita varios lavados a corto plazo y, a continuación, lavados más largos para dar tiempo a que el fijador residual se difunda fuera del bloque de biopelícula o agar. El período de lavado depende del tiempo permitido para la fijación (ver Discusión).
  5. La cantidad necesaria de manchas dependerá de la masa del biofilm. Retire toda la biopelícula de las áreas no específicadas del plato de cultivo antes de la tinción, o transfiera el espécimen fijo a un plato nuevo antes de la tinción. No permita que la biopelícula se drene o se quede.  Manténgalo sumergido en PBS.
  6. Agregue la mancha al plato (ver Discusión) y ponga el plato cubierto en un mezclador orbital lento durante la noche (ver Discusión). Proteger de la luz.
  7. Por la mañana, retire la solución de tinción y rellene el plato con PBS para diluir la mancha sin atarla. Ponga los platos en el mezclador orbital lento a destain durante varias horas.

3. Protocolo de aclaración: Biofilms on Impermeant Substrata

  1. Las biopelículas clarificadas son difíciles de discernir visualmente. Por lo tanto, si lo desea, marque un lado de cada sustrato con un rasguño para designar el lado para la inoculación.
  2. Utilice pipetas Pasteur largas etiquetadas para todos los residuos posteriores y transferencias de disolventes para evitar la contaminación cruzada de los disolventes.
  3. Usando pinzas, transfiera el biofilm fijo de PBS a 5 mL de 50:50 PBS:metanol en un vial de vidrio de 20 ml con la biopelícula hacia arriba. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de 1 min durante 5 min (ver Discusión).
  4. Retire el disolvente a una botella de residuos, siendo cauteloso para evitar el contacto entre la pipeta y el biofilm, o el biofilm y el vial. Rellene suavemente con 3 ml de metanol limpio. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de 1 min durante 3 min.
  5. Retire el disolvente a una botella de residuos e rellene inmediatamente con 5 ml de metanol. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de 1 min durante 5-10 min. Retire el disolvente a la botella de residuos, y rellene inmediatamente con 3 ml de metanol. Las biopelículas a menudo se ven más opacas en este punto que su apariencia inicial.
  6. Retire el disolvente a la botella de residuos y rellene inmediatamente el vial con 5 ml de 50:50 metanol:salicilato de metilo. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de 1 min durante 5-10 min. El biofilm debe ser semitransparente en este disolvente mixto.
  7. Retire el disolvente a una botella de residuos. Rellene suavemente el vial con 3 ml de salicilato de metilo limpio (MS). Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de 1 min durante 3 min.
  8. Retire el disolvente a la botella de residuos, y rellene inmediatamente con 5 ml de EM ordenada. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de 1 min durante 5-10 min. En este punto, el biofilm debe ser transparente. Retire el disolvente a la botella de residuos e rellene inmediatamente el vial con 3 ml de EM limpia. El biofilm procesado es estable en este disolvente.
  9. Para biopelículas en agar (ver Discusión) ampliar todos los períodos de tiempo de intercambio para permitir la difusión de agua y disolventes a través del agar. Los períodos de tiempo necesarios se pueden estimar utilizando un microscopio de disección de baja potencia con iluminación de campo oscuro para ver el avance del disolvente en el agar. El protocolo logra una buena clarificación y no hay efectos de contracción importantes cuando se utiliza el agar 2%, pero el agar clarificado se condensará si se aprieta mientras se manipula con pinzas. Se recomienda el uso de una espátula.

4. Configuración de imágenes para microscopía confocal

  1. Los siguientes pasos son para el uso de un microscopio invertido. Utilice un plato a prueba de disolventes que tenga un fondo de vidrio de cubierta para sujetar la muestra invertida en la etapa del microscopio (ver Discusión).
  2. Prepare los espaciadores para el apoyo de la muestra invertida. Utilice rectángulos pequeños cortados a partir de portaobjetos de microscopio (1.000 mm de espesor), vasos de cubierta (170 m) o anillos de silicona de 13 mm (330 m, véase Tabla de materiales), que pueden apilarse según sea necesario. Remoje previamente los anillos en salicilato de metilo durante 1 h para minimizar la deriva de enfoque debido a la hinchazón.
  3. Para una biopelícula en un cuadrado de silicona de grado médico, invierta el cuadrado (es decir, gire la biopelícula hacia abajo) y póntela en un espaciador en un grupo de salicilato de metilo en el plato(Figura 2). Asegúrese de evitar cualquier burbuja debajo de la muestra.
  4. Monte el plato firmemente en el escenario del microscopio y haga que el aceite se sumerja en contacto con el objetivo (ver Discusión).
  5. Ajuste la cantidad de EP en el plato para que el menisco mantenga la muestra firmemente hacia abajo en el espaciador por tensión superficial. Coloque una gota de MS en la parte superior del sustrato cuadrado invertido para reducir la dispersión de la luz del acabado mate, y cubra el plato con una placa de vidrio para limitar la evaporación. Espere varios minutos hasta que la muestra se asiente en los espaciadores antes de la toma de imágenes.
  6. Utilice la luz transmitida para inspeccionar visualmente el campo de visión y localizar la posición de enfoque actual en relación con las regiones apical y basal del biofilm invertido. Ajuste el condensador que ilumina la apertura numérica (INA) al mínimo (cierre el iris del condensador) para aumentar el contraste, de lo contrario el biofilm clarificado será casi invisible. Cuando haya terminado, apague la fuente de luz transmitida.
  7. Cambie a fluorescencia confocal y establezca los límites inferior y superior de la pila de imágenes de enfoque en serie necesaria para abarcar el biofilm. El paso de accionamiento de enfoque hacia arriba, que se recomienda, primero mostrará las células desalojadas que se han asentado en el vidrio de la cubierta y las hifas apicales muy largas que están descansando en el vidrio. En el extremo superior de la secuencia, las células fundadoras deben ser vistas adheridas al sustrato en la base de la biopelícula. Establezca el diámetro del agujero de pasador, el espaciado de píxeles en el plano de imagen y el incremento del paso de enfoque utilizando los criterios generales descritos en el debate.

Resultados

Las biopelículas como la de la Figura 1 son muy translúcidas a opacas, pero se aclaran e imaginan rutinariamente empleando el protocolo anterior. La Figura 2 muestra la fuerte atenuación de la fluorescencia con profundidad de enfoque en un biofilm fijo en PBS, en comparación con el mismo biofilm después de la coincidencia de índices. Como se muestra en la Figura 3, utilizando disolventes en serie miscibles de índice de refracción creciente, se puede estimar rápidamente el máximo de claridad. Esto se refina mediante la microscopía de contraste de fase convencional para encontrar el punto de contraste mínimo (máxima transparencia). Es evidente que este óptimo no se logra mediante una coincidencia de índice homogénea. Esto se debe a que las estructuras subcelulares difieren ligeramente en el índice de refracción. En este caso, la inversión de contraste se produjo en la pared celular con un índice de disolvente ligeramente inferior al del citoplasma. Para las biopelículas de Candida albicans, el óptimo se produce cerca de n a 1.530. Las biopelículas mutantes de 48 h de tipo salvaje y cak1 DX en la Figura 4A tenían 500 m de espesor, sin embargo, las células de levadura en la base fueron marcadas con la intensidad de las células apicales. Del mismo modo, como se muestra en la Figura 4C,la atenuación de la fluorescencia no estaba fuertemente correlacionada con la profundidad de enfoque. La Figura 5 muestra hifas invasivas en el agar, cientos de micrómetros por debajo de una biopelícula superficial. Las hifas invasivas maduras producen consistentemente levadura en ciernes lateral proximal al septo en la cadena hiplófa, dando lugar a subcolonias de células similares a levaduras a intervalos regulares a lo largo de una hifa invasiva.

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Figura 1: Cultivos de biofilm antes de la aclaración. Una biopelícula de 24 h cultivada a partir de un aislado de una cepa complementada de efg1 o/o de C. albicans en una placa de 12 pocillos en un cuadrado de silicona en medio líquido RPMI-1640 complementado con 10% FBS. El espacio en blanco estéril está en el pozo C4.  El inset muestra la sección transversal cortada de la biopelícula de tipo salvaje de 96 horas cultivada en una placa de 6 pocillos en una base de agar de 3,75 mm en el mismo medio que muestra hifas invasivas. Ambos paneles están a la misma escala. Barra de escala 2,0 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Mejora de la creación de imágenes profundas mediante la coincidencia de índices. La figura muestra proyecciones de visión lateral de pilas de imágenes confocales a partir de una biopelícula de tipo salvaje de 48 h que se fijó y teñida con ConA-Alexafluor 594. (A) El espécimen fue imageado en PBS utilizando un objetivo de inmersión directa de agua de 63x 1.0 NA. La atenuación fue severa a una profundidad de enfoque de 30 m. (B) Después de la aclaración por los pasos 3.3–3.8 del protocolo, se realizó la misma biopelícula en salicilato de metilo con una atenuación mínima utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40x 0,85 NA. Después de la resta de fondo y la proyección de vista lateral de las pilas de imágenes 3D, los datos 40x se redimensionaban espacialmente para que coincidan con los datos 63x para la comparación. (C) Diagrama esquemático que muestra el montaje invertido de la muestra transparente (de MS) mediante transferencia a la EP en un plato de aluminio anodizado negro con un fondo de vidrio de cubierta cementado (ver Discusión). Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: La refractometría de contraste de fase muestra la inversión de contraste de las características celulares en el rango de coincidencia óptima del índice. Las biopelículas fijas en los anteojos de cubierta se intercambiaron de PBS a metanol y luego a xileno (n.o 1.496). Estas biopelículas se intercambiaron una de xileno en un conjunto de líquidos de referencia de índice de refracción (Serie E, Laboratorios Cargille, véase Tabla de materiales)y se examinaron visualmente en paralelo para determinar el rango de índice dando la mayor transparencia. (panel superior) Imágenes de contraste de fase: Una biopelícula se intercambió en serie entre xileno y un conjunto estrecho de líquidos de referencia en ese rango. Después de cada intercambio, el mismo campo fue reubicado y visto a través de un vidrio de cubierta utilizando un 40x 0.85 NA Ph2 objetivo de contraste de fase de inmersión de aceite y condensador Ph2. Todas las imágenes se grabaron con el mismo ajuste de la lámpara y la exposición de la cámara para mostrar con precisión los cambios. Con el índice creciente, la inversión de contraste se ve por primera vez en n a 1.530 para la pared de la célula, seguida de citoplasma en n a 1.535. Barra de escala a 10 m. (panel inferior) Gráfico que muestra el mínimo en brillo medio de la biopelícula en el punto de máxima transparencia. La fuerte dispersión de la luz dentro de la biopelícula hace que el brillo promedio supere el campo en blanco. Las celdas aisladas aparecen más oscuras que el campo en blanco, hasta la inversión de contraste en el rango 1.530–1.535. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes profundas de biopelículas mutantes y silvestres tipo C. albicans. Una cepa de tipo silvestre (DAY185) y una cepa de expresión disminuyente relacionada con la proteína quinasa relacionada con el ciclo celular(cak1 DX)14 se cultivaron a 37 oC durante 48 h en sustratos de silicona en medio líquido DePD. Las biopelículas fueron fijadas, teñidas con ConA-Alexafluor 594, y clarificadas utilizando el protocolo de intercambio de disolventes en salicilato de metilo. La microscopía confocal 3D mostró que ambas biopelículas tenían un grosor de 500 m. Los datos de imagen se convirtieron a formato de 32 bits en ImageJ o Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ o http://fiji.sc), luego se procesaron utilizando la función Restar fondo con un radio de bola rodante de 50 píxeles, umbral para establecer píxeles negativos a cero, reslicing y utilizando la proyección de intensidad máxima para producir vistas laterales. (A) Proyecciones axiales y de visión lateral: El biofilm de tipo salvaje creció hasta un espesor de 502 m como se ve en la proyección de vista lateral de la pila de imágenes confocales de 558 planos. Barra de escala a 100 m. (paneles de la mano izquierda) Proyecciones axiales de 40 planos desde el ápice (arriba) hasta la base (abajo) muestran la variación en los tipos de celdas en diferentes estratos de la biopelícula. Este ejemplo mostró una estructura de tipo silvestre característica: las células adherentes en la base dan lugar a hifas que ascienden a una zona media densa de células similares a pseudohyphal y levaduras. Por encima de la zona media, las hifas resurgieron y dieron lugar a racimos de levadura en ciernes. Las hifas largas que se ven en la zona apical probablemente se extendieron al medio de cultivo en la biopelícula viva, pero se doblaron sobre la superficie de la biopelícula durante el procesamiento de la muestra. El biofilm de cak1 DX creció hasta un espesor de 500 m como se ve en la proyección de vista lateral de la pila de imágenes de 556 planos. Este mutante, que se sabe que sufre un crecimiento filamentoso en ausencia de estrés induciendo14,produjo una arquitectura dramáticamente diferente. Como se ve tanto en la vista lateral como en las proyecciones axiales (paneles de la mano derecha), muchas células ramificadas dieron lugar a crecimientos radiales. (B) Ejemplos de hifas ramificaciones dentro del biofilm cak1 DX. Barra de escala a 10 m. (C) La atenuación de fluorescencia con profundidad en el biofilm de tipo silvestre aclarado se cuantificó enmascarando los píxeles de fondo y, a continuación, calculando la señal digital promedio para todos los píxeles que no son de fondo en cada plano de imagen. Con la excepción de las hifas apicales que están claramente etiquetadas por la lectina, no hubo una fuerte tendencia de atenuación con profundidad de enfoque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Hifas invasivas en el agar. C. hifas albicans en una biopelícula de superficie penetrará un sustrato de agar a distancias milimétricas (ver Figura 1). Después de la clarificación, las estructuras invasivas se pueden ver hacia abajo a través de la biopelícula, o hacia arriba desde la parte inferior del agar. Este último exige una mayor distancia de trabajo. Alternativamente, después de la fijación, pero antes de la tinción y el intercambio de disolventes, el agar se puede cortar verticalmente con un bisturí o cuchilla de afeitar en losas de 1-2 mm que luego se pueden girar en un lado e imágenes directamente en la vista lateral después de la tinción y la clarificación. Se recomienda este procedimiento. En esta proyección de un campo de visión cuadrado de 213 m, se utilizó una escala de color del arco iris para codificar la posición axial en un rango de 75 m: las entidades azules están cerca y las entidades rojas están más profundas en el plano de la página. Esta vista muestra que las hifas largas se mueven de las células laterales de forma de levadura a intervalos semiregulares que dan lugar a subcolonias. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los avances en la microscopía de fluorescencia en seccionamiento óptico, resolución, velocidad, evitación o compensación de la aberración, la adquisición multicanal y en la potencia informática, han causado un resurgimiento de las muestras intactas por imágenes. En el caso de los especímenes fijos, tanto los métodos de clarificación como de expansión clásicos y novedosos han tenido un impacto importante19,20,21,22,23,24. En este caso, aplicamos un enfoque rápido y sencillo de coincidencia de índices a base de disolventes para estudiar la estructura de las biopelículas fúngicas que son muy translúcidas a opacas.

Los protocolos anteriores han sido probados con una gama de muestras. En nuestro laboratorio Las biopelículas Candida albicans se cultivan con mayor frecuencia en cuadrados de 14 mm cortados a partir de una lámina de caucho de silicona de grado médico (ver Tabla de Materiales). Este sustrato se utiliza porque el crecimiento de PDMS (polidimetilsiloxano) sumergido en medio de cultivo líquido se ha establecido como un modelo in vitro importante para las infecciones asociadas con los implantes médicos, particularmente los catéteres habitacionales. Las células estresadas que inician la filamentación se adhieren rápidamente a superficies no polares como PDMS. En la práctica, los cuadrados usados que han sido limpiados y resterilizados en un autoclave (ciclo seco) dan las biopelículas más consistentes para cualquier cepa en particular. Las biopelículas también se cultivan comúnmente en vasos de cobertura, en platos de cultivo de fondo de vidrio de cubierta, en platos de poliestireno de grado bacteriológico estándar y en agar. Debido a que las células de C. albicans no se adhieren bien al vidrio, los vasos de cubierta deben tratarse con una lectina que unirá los polisacáridos de la pared celular. Aplicamos 40 sl de 1 mg/ml de ConA o WGA en agua estéril sobre cada superficie de cubreobjetos. Después del secado, los vasos de cubierta se tratan con 40 ml de glúteo al 1% durante 3 minutos para repasar la proteína en una película insoluble. A continuación, se lavan con agua destilada estéril para eliminar el fijador y cualquier lectina soluble y secado al aire. Si es necesario, los vasos o platos de cubierta tratados se resterilizan bajo una lámpara UV germicida durante 10 min.

El espesor del espécimen afectará los períodos de incubación requeridos en los protocolos. La difusión fija en una biopelícula de 300 m requiere varios minutos para equilibrarse. Este período de tiempo aumenta a medida que el cuadrado del espesor de la muestra, y debe extenderse a una hora o más para biopelículas muy gruesas o muestras de bloque de agar que pueden tener 2-3 mm de espesor. El período de tiempo de equilibrio para la tinción también depende del espesor de la muestra como se describe para la fijación y el lavado. Sin embargo, debido a que las lectinas se difunden más lentamente que los fijadores de bajo MW, especialmente dentro de un gel de agar, la tinción debe extenderse durante la noche. Lo mismo debe hacerse para el lavado de exceso de manchas.

Las manchas de varios tipos pueden incorporarse a los protocolos. Utilizamos una mancha de pared celular para imágenes estructurales, más comúnmente Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) o una lectina con etiqueta de tinte como ConA-Alexafluor 594 o WGA-Alexafluor 594. Se debe prestar atención a la valencia de la proteína. El tetrámero ConA puede causar reticulación de hifas altamente flexibles en la región apical de una biopelícula. Esto es menos evidente con el dímero WGA. Las especificidades canónicas de estos marcadores son calcofluor para quitina, ConA para residuos de manona y WGA para residuos de N-acetil-D-glucosamina y ácido siálico.

Debido a que el protocolo de intercambio de disolventes se clasifica a partir de PBS o agua a través del metanol en salicilato de metilo, los envases de muestras deben ser resistentes a los disolventes. El salicilato de metilo (MS) suavizará rápidamente la plasticería de poliestireno y suavizará lentamente otros plásticos. El protocolo se ajusta al uso del metanol limpio se puede llevar a cabo en plástico, pero en ese punto en el protocolo generalmente cambiamos a los viales de centelleo de vidrio estándar de 20 ml con tapas de tornillo resistentes a disolventes. Los viales son convenientes para biopelículas en sustratos cuadrados de silicona, ya que los cuadrados se pueden recoger y transferir utilizando pinzas finas. Además, un vial se puede drenar y rellenar con el cuadrado plano descansando sobre la superficie curva interna para que la biopelícula no entre en contacto con el vidrio. El sustrato debe ser biofilm-up cuando se sumerge en el vial vertical. Los viales son excelentes para el almacenamiento de muestras a largo plazo.

En el protocolo de clarificación, los pasos de intercambio de disolventes más calificados minimizan el riesgo de deformación de la muestra debido a los efectos de mezcla de disolventes. Para la velocidad y la conveniencia en el protocolo básico, hay cuatro pasos: 1) paso 3.3, PBS a 50:50 PBS:metanol; 2) pasos 3.4 y 3.5, PBS:metanol a metanol limpio, 3) paso 3.6, metanol limpio a 50:50 metanol: MS; y 4) los pasos 3.7 y 3.8, metanol:MS a MS. Methanol proporciona la miscibilidad transitoria. Sin embargo, debido a que el agua y la EP son casi inmiscibles, es esencial que toda el agua sea desplazada por el metanol antes de la introducción de cualquier MS. evaporación del metanol residual causará variaciones del índice de refracción dentro de la muestra. Dentro de la secuencia de cuatro pasos, es aconsejable repetir el segundo y el cuarto paso añadiendo otro cambio de disolvente limpio, o incluso un tercer cambio. Para especímenes particularmente frágiles, los cambios de disolvente podrían formularse en pasos porcentuales más pequeños.

Con las muestras de bloque de agar, los pasos 3.4 y 3.5 (metanol limpio) pueden causar la aparición de cristales de sal dentro del agar debido a la insolubilidad de las sales residuales de PBS en el metanol. Esto se puede evitar mediante el uso de agua destilada (DW) en el primer paso de disolvente mezclado en lugar de PBS para diluir las sales durante el agua: intercambio de metanol. La secuencia de intercambio de disolventes alternativos para biopelículas fijas consiste entonces en estos pasos: 1) paso 3.3, transferir la muestra de PBS a 50:50 DW:metanol (permitir tiempo adicional para la difusión a través del agar); 2) paso 3.4, transferir la muestra de 50:50 DW:metanol en metanol limpio (repetir 2x con metanol como en el paso 3.5); 3) paso 3.6, transferir el espécimen de metanol a 50:50 metanol:salicilato de metilo; y 4) paso 3.7, transferir la muestra de 50:50 metanol: MS a mS ordenada (repetir 2x con EM como en el paso 3.8).

Debido a que el salicilato de metilo suaviza rápidamente la cerámica plástica de poliestireno, utilizamos un plato de aluminio anodizado con un fondo de vidrio de cubierta para sostener la biopelícula clarificada en el escenario de un microscopio invertido. El vidrio de la cubierta se mantiene en su lugar utilizando cemento óptico de curado UV (Norland Optical Adhesive #61, ver Tabla de Materiales). Siempre que la EP se retire al final del día lavando el plato con isopropanol seguido de agua jabonosa y enlizado, el vidrio de la cubierta cementada servirá durante muchos meses.

La selección objetiva de lentes es de vital importancia en las imágenes a gran escala de muestras clarificadas debido a la importancia de minimizar la aberración esférica y la necesidad de una distancia de trabajo suficiente. Tenemos experiencia con tres objetivos en estos estudios. En la configuración del microscopio invertido, utilizamos un aceite objetivo de apertura numérica moderada (NA) de larga distancia de trabajo sumergido debajo del cristal de la cubierta con el biofilm sumergido en salicilato de metilo en el plato por encima del cristal de la cubierta. La mayor parte de nuestro trabajo se ha realizado con un objetivo acromático de la serie Zeiss Universal, tipo 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, utilizado con un adaptador de distancia focal negativo de 160 mm para compatibilidad nominal conconjugada infinita (IC). Este objetivo fue diseñado originalmente para la visualización inmersa en aceite a través de diapositivas de microscopio de 1,5 mm con 0,35 mm de distancia de trabajo25. Cuando se utiliza con un vidrio de cubierta estándar (0,17 mm), la distancia de trabajo es mucho mayor: 1,5 + 0,35–0,17 a 1,68 mm a 1.680 m. También utilizamos un nuevo objetivo de multiinmersión de Zeiss, tipo 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat con una distancia de trabajo superior a 540 m, con la corrección de inmersión establecida en el lado alto de 'aceite'. Este objetivo está muy corregido y produce una imagen excelente. En un soporte de microscopio vertical, hemos utilizado un nuevo objetivo de multiinmersión Nikon, tipo MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat con una distancia de trabajo superior a 5.000 m (5 mm), también con la corrección de inmersión establecida en el lado alto de 'aceite' (n a 1.518). Aunque este objetivo tiene un NA más bajo que los otros, tiene la ventaja de ser directamente dimmersible en salicilato de metilo.

Para optimizar la adquisición de datos en términos de velocidad y resolución, la configuración del microscopio confocal idealmente debe cumplir con las densidades de muestreo de Nyquist transversales y axiales18. Usando criterios convencionales, ajuste el diámetro del agujero confocal nominalmente a 1 unidad ventilada. En coordenadas magnificadas,

dP (m) a 1,22 x aumento x (longitud de onda de emisión en ám) / NA

El muestreo transversal (espaciado de píxeles) no debe exceder (1/2) x el límite de resolución de Abbe. En las coordenadas de espacio de objetos,

(longitud de onda de emisión en nm) / (4 NA)

El muestreo axial (incremento de enfoque) no debe exceder el ancho de banda axial inverso,

(índice de inmersión) x (longitud de onda de emisión en nm) / (NA2)

El sistema óptico confocal amplía el ancho de banda del microscopio y agudiza la resolución transversal y axial en al menos 1 / 2.

Para el objetivo de 40x 0.85 NA que utilizamos con más frecuencia, consulte la Tabla 1 para los resultados de estas fórmulas para una longitud de onda de emisión de 600 nm (Alexa Fluor 594).

Fórmulax 1 / 2conjunto (típico)
dP (m)34,5 m-25 o 50 m
X, y176 nm125 nm161 nm
z'z1200 nm848 nm900 nm

Tabla 1: Diámetro del agujero confocal, muestreo transversal y valores de muestreo axial para una longitud de onda de emisión de 600 nm.

Utilizando un escáner confocal de disco giratorio con estos ajustes y un campo de escaneo de 1.392 x 1.040 píxeles, los datos de las muestras de biopelícula se pueden adquirir con una velocidad y resolución razonables. Las pilas de imágenes 3D de un solo color típicas ejecutan entre 0,35 y 1,55 GB.

Los medios de clarificación en uso amplio abarcan un rango de índice de refracción significativo. Por iluminación de campo oscuro e inspección visual, encontramos que las biopelículas fijas de C. albicans eran más transparentes por encima de n .5. Esto se refinó mediante la microscopía de contraste de fase a n .530–1.535. Por varias razones prácticas, utilizamos salicilato de metilo (n a 1.537) como disolvente de coincidencia de índice final. Aunque el intercambio de disolventes conlleva el riesgo de deformación de muestras u otros artefactos, las células de las muestras fijas y clarificadas tienen dimensiones similares del cuerpo celular, el diámetro de la hifa y las dimensiones de longitud interseptal que las muestras vivas.

Muchas variaciones en el proceso de intercambio de disolventes son posibles (por ejemplo, utilizando un disolvente transitorio diferente, o un disolvente final diferente). El metanol fue elegido por su alta polaridad y rápida difusión, pero se demostró que el etanol preserva mejor el rendimiento cuántico de proteína fluorescente roja (RFP)26 como disolvente de transición. El salicilato de metilo fue seleccionado por su índice, polaridad moderada, baja presión de vapor y compatibilidad con muchas manchas, colorantes y proteínas fluorescentes. Sin embargo, un disolvente final con un índice ligeramente más bajo, o una mezcla de salicilato de metilo y un disolvente de índice inferior, como el butanol, puede servir mejor.

Inesperadamente, la capacidad de ver a través de una biopelícula revela no sólo sus características internas estratificadas, sino que también ayuda a ver el origen de estructuras extendidas como hifas apicales largas, no enredadas e hifas basales invasivas en ciertos substratos. La virulencia oportunista en C. albicans depende de su versatilidad genética (es decir, el cambio al crecimiento hiplólico, la regulación ascendente del sustrato celular y la adherencia celular, la generación de osmolitos para la floración celular y el alargamiento, y el uso de nutrientes alternativos). La extensión hiphal permite la ruptura de células individuales de C. albicans de células inmunitarias fagocíticas, pero también es esencial para la invasión. La adhesión al biofilm y el entrelazamiento hiphalparecen proporcionar el anclaje superficial necesario para que las hifas invadan eficientemente un sustrato. Cuando ese sustrato es tejido huésped, puede producirse un aumento de la virulencia.

Las biopelículas intactas por imágenes permiten un gran número de experimentos informativos que utilizan cepas de reporteros para la expresión génica, sustratos de tejidos modelo y la inclusión de otros organismos como bacterias que se encuentran en biopelículas naturales. Incluso en el caso más simple de imágenes puramente estructurales con una mancha de pared celular, se revelan fenotipos in situ que luego pueden ser cuantificados y analizados genéticamente.

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses en competencia que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada en parte por las subvenciones R01 AI067703, R21 AI100270 y R21 AI135178 a A.P. Mitchell. Los autores están agradecidos a Greenfield 'Kip' Sluder por proporcionar el objetivo de inmersión en aceite de larga distancia de trabajo utilizado en este trabajo, y a Daniel Shiwarski para la microscopía confocal con inmersión directa de salicilato de metilo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Receptáculo para residuos biopeligrosos
Cabina de bioseguridad con lámpara
Calcofluor White M2R (2,5 mg/mL en metanol)
Concanavalina A - Alexafluor-594 u otro conjugado
destiladaDW
Agua destilada, estéril
Etanol, absolutoEtOH
Suero fetal bovino (FBS), estéril
Botella de residuos fijadores en contención
Formaldehído 20% en agua, ampollasCiencias de la Microscopía Electrónica
formaldehído: polvo de paraformaldehído, formalina 37%Ciencias de la Microscopía Electrónica
extractora
Glutaraldehído 25% en agua, ampollasMicroscopía Electrónica
- 30 ° C, con mezclador rotativo (60 rpm) para tubos de
Incubadora - 37 ° C, con mezclador orbital para placas de
Isopropanol 70%iPrOH 70%
Lámpara UV de onda larga (365 nm), 5 WCole-Parmer Scientificpara el curado Cemento NOA-61
Lámina de silicona de grado médico, 0,060" (1,52 mm) de espesorBentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/Láminas de silicona de grado médico no reforzadas
Metanol 99,9% MeOH
Salicilato de metilo 99%MS
Millipore Swinnex 13 mm juntas de anillo de silicona blancaMillipore Corp.
Adhesivo óptico de curado UV Norland - tipo NOA-61Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.comNOA-61
Mezclador orbital, de sobremesa
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), estéril
Líquido estándar de índice de refracción, n = 1.500 a 1.640 (29 líquidos, incremento de 0.005)Cargille Laboratories, https://cargille.comSerie ECedar Grove, NJ 07009, EE. UU.
RPMI-1640 medio base, HEPES tamponado, estéril
Viales de centelleo, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cono tapón linerFisher Scientific Co.03-341-25Hpara el procesamiento y almacenamiento de muestras
Botella de residuos de disolvente en contención secundaria Medio
araña con manitol, estéril (1% de caldo de nutrientes Difco, 0,2% K2HPO4, 1% D-Manitol)
Aglutinina de germen de trigo - Alexafluor-594 u otro conjugado
Placas de agar levadura-peptona-dextrosa (YPD), estériles (1% de extracto de levadura, 2% de bacto peptona, 2% de dextrosa, 2% de bacto agar)
Medio YPD, líquido, estéril (1% de extracto de levadura, 2% de bacto peptona, 2% de dextrosa)
UV germicida Agua secundaria Alternativas al Campana Incubadora de CienciascultivocultivoSX0001301 de

Referencias

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