Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Stefany Rubio; Oscar Cazares; Hector Macias; Lindsay Hinck

doi:10.3791/60742

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Artículo de método

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

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DOI:

10.3791/60742

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11 de marzo de 2020

Stefany Rubio¹ , Oscar Cazares¹ , Hector Macias¹ , Lindsay Hinck¹

¹Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

En este artículo

Resumen

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Resumen

Los organoides ofrecen estructuras de tejido tridimensionales autoorganizadas que recapitulan los procesos fisiológicos en la comodidad de un plato. La glándula mamaria murina se compone de dos compartimentos celulares epiteliales distintos, que cumplen diferentes funciones: el compartimento mioepitelial externo y contractilo y el compartimento luminal interior y secretor. Aquí, describimos un método por el cual las células que componen estos compartimentos se aíslan y luego se combinan para investigar sus contribuciones individuales de linaje a la morfogénesis y diferenciación de la glándula mamaria. El método es simple y eficiente y no requiere tecnologías de separación sofisticadas como la clasificación celular activada por fluorescencia. En su lugar, cosechamos y digerimos enzimáticamente el tejido, sembramos el epitelio en platos de cultivo de tejidoadherente, y luego usamos trippsinización diferencial para separar el mioepitelial de las células luminales con una pureza del 90 %. Las células se platean en una matriz extracelular donde se organizan en organoides bicapados tridimensionales (3D) que se pueden diferenciar para producir leche después de 10 días en cultivo. Para probar los efectos de las mutaciones genéticas, las células se pueden cosechar a partir de modelos de ratón de tipo salvaje o genéticamente diseñados, o pueden ser manipuladas genéticamente antes del cultivo 3D. Esta técnica se puede utilizar para generar organoides de mosaico que permiten la investigación de la función génica específicamente en el compartimento luminal o mioepitelial.

Introducción

La glándula mamaria (MG) es una estructura epitelial tubular similar a un árbol incrustada dentro de un estroma rico en adipocitos. El epitelio ductal bicapado comprende una capa externa basal de células contráctil, mioepiteliales (MyoEC) y una capa interna de células epiteliales luminarias y secretoras (LEC), que rodea un lumen central¹. Durante la lactancia cuando los MyoECexternos externos se contraen para exprimir la leche de los LEC alveolares internos, la MG sufre numerosos cambios que están bajo el control de factores de crecimiento (por ejemplo, EGF y FGF) y hormonas (por ejemplo, progesterona, insulina y prolactina). Estos cambios caus....