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Artículo de método

Evaluación de la función de la memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina

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DOI:

10.3791/60751

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4 de junio de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta procedimientos experimentales para evaluar las deficiencias de memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina. Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos fisiofitosiológicos del deterioro cognitivo asociado a la epilepsia, que es una de las comorbilidades más comunes en la epilepsia.

Resumen

El deterioro cognitivo es una de las comorbilidades más comunes en la epilepsia del lóbulo temporal. Para recapitular el deterioro cognitivo asociado a la epilepsia en un modelo animal de epilepsia, generamos ratones epilépticos crónicos tratados con pilocarpina. Presentamos un protocolo para tres pruebas de comportamiento diferentes utilizando estos ratones epilépticos: localización de objetos nuevos (NL), reconocimiento de objetos nuevos (NO) y pruebas de separación de patrones (PS) para evaluar el aprendizaje y la memoria de lugares, objetos y contextos, respectivamente. Explicamos cómo configurar el aparato conductual y proporcionar procedimientos experimentales para las pruebas NL, NO y PS después de una prueba de campo abierto que mide las actividades de locomotora basal de los animales. También describimos las ventajas técnicas de las pruebas NL, NO y PS con respecto a otras pruebas de comportamiento para evaluar la función de la memoria en ratones epilépticos. Por último, analizamos las posibles causas y soluciones para que los ratones epilépticos no puedan hacer 30 s de buen contacto con los objetos durante las sesiones de familiarización, lo que es un paso crítico para las pruebas de memoria exitosas. Por lo tanto, este protocolo proporciona información detallada sobre cómo evaluar las deficiencias de memoria asociadas a la epilepsia mediante ratones. Las pruebas NL, NO y PS son ensayos simples y eficientes que son apropiados para la evaluación de diferentes tipos de memoria en ratones epilépticos.

Introducción

La epilepsia es un trastorno crónico caracterizado por convulsiones recurrentes espontáneas1,,2,,3. Debido a que las convulsiones repetitivas pueden causar anomalías estructurales y funcionales en el cerebro1,2,3, la actividad convulsiva anormal puede contribuir a la disfunción cognitiva, que es una de las comorbilidades asociadas a la epilepsia más comunes4,5,6. Contrariamente a los eventos de convulsiones crónicas, que son transitorios y momentáneos, los deterioros cognitivos pueden persistir a lo largo de la vida de los pacientes epilépticos, deteriorando su calidad de vida. Por lo tanto, es importante entender los mecanismos fisiofitosiológicos del deterioro cognitivo asociado a la epilepsia.

Se han utilizado varios modelos animales experimentales de epilepsia para demostrar los déficits de aprendizaje y memoria asociados con la epilepsia crónica7,8,9,10,11,12. Por ejemplo, el laberinto de agua de Morris, el acondicionamiento contextual del miedo, el tablero de agujeros, la localización de objetos novedosos (NL) y las pruebas de reconocimiento de objetos novedosos (NO) se han utilizado con frecuencia para evaluar la disfunción de la memoria en la epilepsia del lóbulo temporal (TLE). Debido a que el hipocampo es una de las regiones primarias en las que TLE muestra patología, las pruebas conductuales que pueden evaluar la función de memoria dependiente del hipocampo a menudo se seleccionan preferentemente. Sin embargo, dado que las convulsiones pueden inducir neurogénesis hipocampal aberrante y contribuir al deterioro cognitivo asociado a la epilepsia10,los paradigmas conductuales para probar la función neuronal del recién nacido dengunato (es decir, la separación del patrón espacial, PS)8,,13 también pueden proporcionar información valiosa sobre los mecanismos celulares de las deficiencias de memoria en la epilepsia.

En este artículo, demostramos una batería de pruebas de memoria, NL, NO y PS, para ratones epilépticos. Las pruebas son simples y de fácil acceso y no requieren un sistema sofisticado.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad Católica de Corea y se llevaron a cabo de conformidad con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publications No. 80-23).

1. Prueba de ubicación de objetos novedosos (NL)

  1. Preparar ratones epilépticos C57BL/6 o transgénicos 4–6 semanas después de la inyección de pilocarpina.
    NOTA: Las convulsiones agudas fueron inducidas por inyección intraperitoneal (IP) de pilocarpina, siguiendo el protocolo detallado en nuestro informe anterior14.
  2. Transfiera los ratones epilépticos de la sala de cría a la sala de comportamiento un día antes de que comiencen las pruebas de comportamiento. Permita que los ratones se habituan durante al menos 12 horas durante la noche.
  3. En la sala de comportamiento, separe los ratones individuales en jaulas nuevas para una sola vivienda. Escriba la información de cada animal en la tarjeta de jaula y mantenga a los animales en las mismas jaulas durante las pruebas de comportamiento. Múltiples jaulas se pueden transferir simultáneamente utilizando un carro.
  4. Al día siguiente, comience 3 días de sesiones de habituación (H1–H3) en la mañana temprano. Aclimatar a los animales a la luz baja en sus jaulas domésticas durante al menos 30 minutos.
  5. Preparar una caja de campo abierto con dimensiones exteriores de 44 x 44 x 31 cm y dimensiones interiores de 43 x 43 x 30,5 cm. En el día 1 de la habituación (H1), coloque un iluminamínómetro en el centro de la caja de campo abierto y ajuste la iluminancia a 60 lux.
  6. Rocíe el suelo y las paredes de la caja de campo abierto con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel limpia para eliminar posibles señales olfativas. A continuación, espere al menos 1 min hasta que el alcohol residual se haya secado por completo.
  7. Evalúe la actividad locomotora de cada ratón realizando una prueba de campo abierto.
    1. Para grabar y realizar un seguimiento del comportamiento de cada ratón experimental, utilice el software de seguimiento de vídeo de comportamiento animal (consulte Tabla de materiales).
    2. Una vez abierto el software de seguimiento de vídeo, calibre el tamaño de la caja de campo abierto. A continuación, establezca la zona para el seguimiento. Establezca 3 s de latencia y 15 minutos de tiempo de adquisición para evitar el seguimiento de las manos de un experimentador. Inserte la información sobre cada ratón experimental (grupo, sexo, edad, etc.).
    3. A continuación, coloque suavemente un ratón experimental en la caja de campo abierto que mira hacia la pared. Para ello, colocándolo en la tapa de la jaula para minimizar el estrés y la ansiedad asociados al manejo. A continuación, suelte el ratón cerca del muro del cuadro de campo abierto que está más lejos de donde estarán los objetos durante la sesión de familiarización (paso 1.9.3.).
      NOTA: Una vez que el ratón está en el cuadro de campo abierto, el software de seguimiento del ratón lo detectará automáticamente y comenzará a grabar. Para un seguimiento óptimo de la exploración, la cámara se puede colocar directamente encima de la caja de campo abierto.
    4. Después de 15 minutos de grabación, regrese el animal a su jaula de origen colocándolo en la tapa de la jaula. Limpie la caja de campo abierto con un spray de etanol al 70% y limpie con una toalla de papel limpia entre ensayos. Restaure la luz brillante y mida la distancia total del animal movida utilizando el software de seguimiento de vídeo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      1. Abra el software de seguimiento de vídeo y los clips de vídeo. A continuación, haga clic en Análisis para calcular la distancia total movida en función de la calibración del tamaño del cuadro de campo abierto.
  8. En el día 2 y el día 3, realice las sesiones de habituación (H2, H3) repitiendo los pasos 1.3 a 1.7.
  9. En el día 4, realice la sesión de familiarización (F1).
    1. En la luz tenue, coloque cada ratón en el campo abierto vacío durante 3 minutos. Después de esa breve rehabilitación, devuelve al animal a su jaula.
    2. Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y límpielos con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
    3. Coloque dos objetos idénticos (muñecas de goma, objeto A) en la arena de campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes contiguas. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto, frente a la pared más alejada de los objetos.
    4. Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión de F1 y transfiera al animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, quite el mouse del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
    5. Después de que el animal sea retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja con un 70% de spray de etanol y límpielos con una toalla de papel.
      NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
  10. En el día 5, realice la sesión de prueba de NL.
    1. Transfiera el ratón de su jaula de inicio a la zona de campo abierto para su rehabilitación durante 3 min. Luego devuelva el animal a su jaula de origen.
    2. Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y límpielos con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
    3. Mueva un objeto (muñeca de goma, objeto A) a la posición diagonal, a 5 cm de distancia de las paredes contiguas. Fije el objeto con cinta adhesiva de doble cara. Transfiera el ratón experimental en la tapa de su jaula a la zona de campo abierto y colóquelo frente a la pared de la caja de campo abierto.
      NOTA: Contrate la ubicación del objeto movido para reducir cualquier preferencia innata potencial para una dirección determinada. Por ejemplo, cambie la ubicación del objeto preferido de la sesión de familiarización para la mitad de los animales experimentales, y para el resto de los animales, mueva el objeto menos preferido de la sesión de familiarización.
    4. Permita 10 minutos de exploración y grabación gratuitas con un sistema de seguimiento de vídeo. Mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando dos cronómetros y calcule la relación de discriminación como
      figure-protocol-1
      NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
    5. Coge la cola del ratón experimental y colóquelo en la tapa de su jaula para transferirla a su jaula de origen. Durante 3 días (días 6–8), deje reposar el ratón con acceso gratuito a alimentos y agua.
    6. Una vez que el animal es retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja con un 70% de spray de etanol y limpie con una toalla de papel.

2. Prueba de reconocimiento de objetos novedosas (NO)

  1. En el día 9, realice una sesión de habituación de 15 minutos repitiendo los pasos 1.2–1.7.
  2. En el día 10, realice la sesión de familiarización (F1).
    1. Con poca luz, coloque el ratón en el campo abierto vacío durante 3 minutos. Después de rehabilitar el ratón a la zona de campo abierto, devuélvalo temporalmente a su jaula de origen.
    2. Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
    3. Coloque dos objetos idénticos (tubos de plástico de 50 ml llenos de 40 ml de agua, objeto B) en el campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos.
    4. Como el animal está expuesto a los dos objetos diferentes (tubo de plástico de 50 ml lleno de 40 ml de agua, objeto B; tarro de Coplin de vidrio, objeto C) en la prueba NO, contrarresta el objeto durante la sesión F1. Por ejemplo, presente dos objetos idénticos (tarros de Coplin de vidrio, objeto C) para la mitad de los animales del grupo.
    5. Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión de F1 y transfiera al animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, elimínelo del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
    6. Después de que el animal sea retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja con un 70% de spray de etanol y límpielos con una toalla de papel.
      NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
  3. Al día siguiente (día 11), realice la sesión de prueba NO.
    1. Transfiera el ratón de su jaula de origen al campo abierto para la rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuelva al animal a su jaula de origen.
    2. Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
    3. Sustituya un objeto (tubo de plástico de 50 ml lleno con 40 ml de agua, objeto B) por otro objeto (tarro de Coplin de vidrio, objeto C) a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Transfiera el ratón experimental en la tapa de la jaula al campo abierto y colóquelo frente a la pared. Contrapeso de los objetos presentados juntos durante la prueba NO. Por ejemplo, reemplace un frasco de Coplin de vidrio (objeto C) por un tubo de plástico de 50 ml lleno de 40 ml de agua (objeto B) para los ratones expuestos a los dos frascos coplin de vidrio (objeto C) durante la sesión de familiarización.
      NOTA: También se puede realizar una contrapeso de la ubicación del objeto reemplazado para reducir la preferencia innata potencial para una dirección determinada. Por ejemplo, para cada cohorte de los animales expuestos al conjunto de dos objetos (objeto B u objeto C), cambie el objeto preferido en la sesión de familiarización para la mitad de los animales experimentales, y para el resto de los animales, reemplace el objeto menos preferido en la sesión de familiarización.
    4. Permita 10 minutos de exploración gratuita y grabarlo usando un sistema de seguimiento de vídeo. Mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando dos cronómetros y calcule la relación de discriminación.
      NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
    5. Agarre la cola del ratón experimental y colóquelo en la tapa de la jaula para transferirla a su jaula de origen. Durante 3 días (días 12–14), deje reposar el ratón con libre acceso a alimentos y agua.
    6. Una vez que el animal es retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja de campo abierto con un 70% de spray de etanol y limpie con una toalla de papel.

3. Prueba de separación de patrones (PS)

  1. En el día 15, realice la primera sesión de familiarización (F1) para la prueba PS.
    1. Transfiera el ratón de su jaula de origen al área de campo abierto para su rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuélvalo a su jaula de origen.
    2. Durante la habituación, limpie a fondo los objetos y la placa de suelo cuadriculada con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
    3. Coloque la placa de suelo (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con la rejilla ancha (5,5 x 5,5 cm) en la caja de campo abierto y coloque dos objetos idénticos (frascos T de plástico llenos de 50 ml de agua, objeto D) en el campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos.
    4. Como el animal está expuesto a dos objetos diferentes (frasco T de plástico lleno con 50 ml de agua, objeto D; botella de vidrio, objeto E) en la prueba PS, contrarresta el objeto durante las sesiones F1 y F2. Por ejemplo, presente dos objetos idénticos (botellas de vidrio, objeto E) en el amplio suelo de rejilla para la mitad de los animales del grupo.
    5. Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración total (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión de F1 y transfiera al animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, elimínelo del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
      NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
    6. Después de completar la primera sesión de familiarización (F1), limpie a fondo los objetos y la placa de suelo con un spray de etanol al 70% y retírelos de la caja de campo abierto.
  2. Al día siguiente (día 16), realice la segunda sesión de familiarización (F2) para la prueba PS.
    1. Transfiera el ratón de su jaula de origen a la zona de campo abierto para su rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuelva al animal a su jaula de origen.
    2. Durante la habituación, limpie a fondo los objetos y la placa de suelo cuadriculada con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
    3. Coloque la placa de suelo (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con la rejilla estrecha (2,75 x 2,75 cm) en la caja de campo abierto y coloque dos objetos idénticos (botellas de vidrio, objeto E) en el campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes contiguas. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos.
    4. Para el contrapeso, presente dos objetos idénticos (frascos T de plástico llenos de 50 ml de agua, objeto D) en el suelo estrecho de la rejilla.
    5. Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración total (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión F2 y transfiera el animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, elimínelo del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
      NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
    6. Después de completar la segunda sesión de familiarización (F2), limpie a fondo los objetos y la placa de suelo con un spray de etanol al 70% y retírelos de la caja de campo abierto.
  3. Al día siguiente (día 17), realiza la sesión de prueba pS.
    1. Transfiera el ratón de su jaula de origen al área de campo abierto para su rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuélvalo a su jaula de origen.
    2. Durante la habituación, limpie a fondo los objetos y la placa de suelo cuadriculada con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
    3. Coloque la placa de suelo con la rejilla estrecha (2,75 x 2,75 cm) en la caja de campo abierto y coloque dos objetos diferentes (frasco T de plástico lleno de 50 ml de agua, objeto D; botella de vidrio, objeto E) en la placa de suelo a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Transfiera el ratón experimental en la tapa de la jaula a la zona de campo abierto y colóquelo frente a la pared.
    4. Contrapeso de los objetos presentados juntos durante la prueba PS. Por ejemplo, coloque cada objeto (objeto D, objeto E) en el suelo de cuadrícula estrecho para que el objeto E sea un objeto novedoso en este contexto. También se puede realizar un contrapeso de la ubicación del objeto D o del objeto E (un objeto novedoso en el patrón de suelo estrecho) para reducir el potencial de una preferencia innata para una dirección determinada. Por ejemplo, reemplace el objeto preferido de la segunda sesión de familiarización para la mitad de los animales experimentales, y para el resto de los animales, reemplace el objeto menos preferido de la segunda sesión de familiarización.
    5. Permita 10 minutos de exploración y grabación gratuitas utilizando un sistema de seguimiento de vídeo. Mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando dos cronómetros y calcule la relación de discriminación.
      NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
    6. Agarre la cola del ratón experimental y colóquelo en la tapa de la jaula para transferirla a su jaula de origen.

4. Tinción violeta cresil

  1. Después de completar todas las pruebas conductuales, anestesia al animal inyectando un cóctel (4:0.5) de ketamina (50 mg/ml) y xilazina (23,3 mg/ml) disuelto en solución salina a una dosis de 110 ml/kg de peso corporal (IP; 1 ml de jeringa; 26 G aguja). Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo.
  2. Una vez que el animal está profundamente anestesiado, realizar perfusión transcardial con 4% de paraformaldehído para fijar el cerebro15.
  3. Una vez finalizada la perfusión transcardial, decapita al animal con un par de tijeras15. Luego, retire el cráneo usando un par de tijeras de iris para exponer el cerebro. Después de aislar el cerebro, postfijo en 4% de paraformaldehído durante la noche, seguido de crioprotección en 30% sacarosa en 0.01 M solución salina tamponada fosfato.
  4. Haga secciones coronales (30 m) a partir del cerebro congelado con un criostato.
  5. Montar los tejidos cerebrales en diapositivas y realizar una serie de pasos de hidratación de 100% etanol al agua del grifo mediante el lavado durante 3 minutos secuencialmente en 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanol.
  6. Incubar los portaobjetos en solución violeta de cresil al 0,1% durante 15 min.
  7. Elimine la mancha excesiva sumergiendo los portaobjetos en 95% de etanol/0.1% ácido acético glacial, y luego deshidrate los tejidos con soluciones de 100% etanol, 50% etanol/50% xileno y 100% xileno.
  8. Cubra los portaobjetos de tejido utilizando un medio de montaje de xileno disponible comercialmente.

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Resultados

En la Figura 1se muestra un cronograma experimental general y una configuración para evaluar la función cognitiva. Seis semanas después de la introducción de las convulsiones agudas inducidas por la pilocarpina, los ratones fueron sometidos a las pruebas de NL, NO y PS en ese orden separados por períodos de descanso de 3 días entre las pruebas (Figura 1A). Para la prueba NL, se colocaron dos objetos idénticos en el campo abierto durante la sesión de familiarizac...

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Discusión

Este trabajo describe procedimientos experimentales para evaluar la función cognitiva en ratones con epilepsia crónica. Muchos paradigmas de prueba de comportamiento diferentes se utilizan para evaluar las funciones de aprendizaje y memoria en ratones18. El laberinto de agua Morris, el laberinto de brazos radiales, el laberinto Y, el acondicionamiento contextual del miedo y las pruebas basadas en objetos son las pruebas de comportamiento más utilizadas y proporcionan resultados confiables. Entre e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Jae-Min Lee por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la National Research Foundation of Korea (NRF) financiadas por el gobierno de Corea (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 1 mlSung-shimÚselo con la aguja de calibre 26 o 30
Etanol al 70%DuksanUN1170Spray para limpiar la caja y los objetos
CortinaPara evitar señales visuales innecesarias
Cresyl violetaSigmaC5042Para Cresyl violeta criotomo de tinción
Leica E21040041Para pañuelos cinta
adhesivapara la colocación firme de los objetos medio de
montaje DPXSigma06522
serie de etanolDuksanUN1170Hacer 100%, 95%, 90%, 80%, 70% soluciones de etanol
placa de piso con patrones de rejilla estrechosLeehyo-bioEquipo de experimento conductual, tamaño de la placa: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, tamaño de la cuadrícula: 2,75 x Placa de suelo de 2,75 cm
con patrones de rejilla anchosLeehyo-bioEquipo de experimento conductual, tamaño de la placa: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, tamaño de la rejilla: 5,5 x 5,5 cm
iluminómetroTES Electrical Electronic Corp.1334APara la medición de la iluminación de la habitación (60 Lux)
Unidad de cuidados intensivosThermocare#W-1
clorhidrato de ketaminaYuhan7003Uso para anestesiar el ratón para la perfusión transcárdica
Lámpara LEDLungoP13A-0422-WW-04Iluminación para los objetos
de la sala de pruebas de comportamientoMuñeco de goma, tubo de plástico de 50 ml, frasco de vidrio Coplin, frasco de plástico T, botella de vidrio
caja de campo abiertoLeehyo-bioEquipo de experimento conductual, tamaño: 44 x 44 x 31 cm
toalla de papelYuhan-Kimberly47201Úselo para secar caja de campo abierto y objetos
paraformaldehído MerckMillipore104005Make 4% solución
de clorhidrato de pilocarpinaSigmaP6503
Úselo para ubicar los objetos en la caja de campo abierto
nitrato de metilo de escopolaminaSigmaS2250Hacer 10X stock
Smart system 3.0PanlabCronómetro del sistema de seguimiento de video
JunsoJS-307Para la medición de las actividades exploratorias de los ratones
sacarosaSigmaS9378Para la crioprotección de secciones de tejidos
sal de hemisulfato de terbutalinaSigmaT2528Marca 10X
(cámara CCD)VisionVCE56HQ-12Coloque la cámara directamente sobre la cabeza de la caja de campo abierto
, xilacina (Rompun)Bayer, coreaKR10381Úselo para anestesiar al ratón para la perfusión transcárdica
xilenoDuksanUN1307para Tinción de violeta cresilo
negra de doble cara regla , , , cámara de video de stock, , ,

Referencias

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

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