Artículo de método

Cuantificación de los niveles de etanol en embriones de pez cebra mediante cromatografía de gases del espacio de cabeza

DOI:

10.3791/60766

⸱

11 de febrero de 2020

1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo describe un protocolo para cuantificar los niveles de etanol en un embrión de pez cebra utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza a partir de métodos de exposición adecuados para el procesamiento de embriones y el análisis de etanol.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los Trastornos del Espectro Alcohólico Fetal (TEAF) describen un continuo muy variable de defectos del desarrollo inducidos por etanol, incluyendo dismorfologías faciales y deficiencias neurológicas. Con una patología compleja, el TEAF afecta aproximadamente a 1 de cada 100 niños nacidos en los Estados Unidos cada año. Debido a la naturaleza altamente variable del FASD, los modelos animales han demostrado ser críticos en nuestra comprensión mecanicista actual de los defectos de desarrollo inducidos por etanol. Un número cada vez mayor de laboratorios se ha centrado en el uso de peces cebra para examinar defectos de desarrollo inducidos por etanol. Los peces cebra producen un gran número de embriones translúcidos, genéticamente traficados y fertilizados externamente. Esto permite a los investigadores controlar con precisión el tiempo y la dosis de la exposición al etanol en múltiples contextos genéticos y cuantificar el impacto de la exposición al etanol embrionario a través de técnicas de imagen en vivo. Esto, combinado con el alto grado de conservación tanto de la genética como del desarrollo con los seres humanos, ha demostrado que el pez cebra es un modelo potente en el que estudiar la base mecanicista de la teratogenicidad del etanol. Sin embargo, los regímenes de exposición al etanol han variado entre diferentes estudios de pez cebra, lo que ha confundido la interpretación de los datos del pez cebra a través de estos estudios. Este es un protocolo para cuantificar las concentraciones de etanol en embriones de pez cebra utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los Trastornos del Espectro Alcohólico Fetal (TEAF) describen una amplia gama de deficiencias neurológicas y dismorfologías craneofaciales asociadas con la exposición al etanol embrionario1. Múltiples factores, incluyendo el momento y la dosis de la exposición al etanol y los antecedentes genéticos, contribuyen a la variación del TEAF2,3. En los seres humanos, la compleja relación de estas variables hace que estudiar y entender la etiología del TEAF sea un reto. Los modelos animales han demostrado ser cruciales en el desarrollo de nuestra comprensión de la base mecanicista de la teratogenicidad del etanol. Se ha utilizado una amplia variedad de sistemas de modelos animales para estudiar múltiples aspectos del TEAF y los resultados han sido notablemente consistentes con lo que se encuentra en la exposición en humanos4. Los sistemas de modelos de roedores se utilizan para examinar muchos aspectos del FASD, siendo los ratones los5,6,7más comunes. La mayor parte de este trabajo se ha centrado en defectos de desarrollo a la exposición temprana al etanol8, aunque se ha demostrado que la exposición posterior al etanol causa anomalías en el desarrollo también9. Además, las capacidades genéticas de los ratones han ayudado en gran medida en nuestra capacidad de sondear los fundamentos genéticos del TEAF10,11. Estos estudios en ratones sugieren fuertemente que hay interacciones gene-etanol con la vía sónica de erizo, señalización de ácido retinoico, Superóxido dismutasa, óxido nítrico sintasa I, Aldh2 y Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Estos estudios muestran que los modelos animales son fundamentales para avanzar en nuestra comprensión del TEAF y sus mecanismos subyacentes.

El pez cebra ha surgido como un potente sistema modelo para examinar muchos aspectos de la teratogénesis del etanol22,23. Debido a su fertilización externa, alta fecundidad, capacidad genética de tractificación y capacidad de imagen en vivo, el pez cebra es ideal para estudiar factores como el momento, la dosificación y la genética de la teratogénesis del etanol. El etanol se puede administrar a embriones escenificados con precisión y los embriones pueden ser imágenados para examinar el impacto directo del etanol durante los procesos de desarrollo. Este trabajo puede estar relacionado directamente con los seres humanos, ya que los programas genéticos de desarrollo están altamente conservados entre los peces cebra y los seres humanos y, por lo tanto, pueden ayudar a guiar los estudios en humanos del TEAF24. Mientras que el pez cebra se ha utilizado para examinar la teratogénesis del etanol, la falta de consenso en la notificación de concentraciones de etanol embrionario hace que la comparación con los seres humanos sea difícil25. En los sistemas de mamíferos, los niveles de alcohol en sangre se correlacionan directamente con los niveles de etanol tisular26. Muchos de los estudios de pez cebra tratan embriones antes de la formación completa de su sistema circulatorio. Sin una muestra materna que examinar, se requiere un proceso para evaluar las concentraciones de etanol para cuantificar los niveles de etanol dentro del embrión. Aquí describimos un proceso para cuantificar las concentraciones de etanol en un embrión de pez cebra en desarrollo utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los embriones de pez cebra utilizados en este procedimiento fueron criados y criados siguiendo los protocolos establecidos de la IACUC27. Estos protocolos fueron aprobados por la Universidad de Texas en Austin y la Universidad de Louisville.

NOTA: La línea de pez cebra Tg(fli1:EGFP)y1 se utilizó en este estudio28. Toda el agua utilizada en este procedimiento es agua estéril de ósmosis inversa. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graphpad Prism v8.2.1.

1. Fabricación de medios embrionarios

  1. Para hacer un stock de 20x de medios embrionarios, disolver 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO4, 0,142 g de NA2HPO4y 4,9 g de MgSO4x 7H2O en 1 L de agua. Ignora el precipitado blanco que se forma; esto no afectará a los medios de comunicación. Filtrar esterilizar la solución de stock y almacenar a 4 oC.
  2. Para crear la solución de medios embrionarios de trabajo, disolver 1,2 g de NaHCO3 en 1 L de 20x material de medios embrionarios y añadir 19 L de agua. Mantener la solución de medios embrionarios de trabajo a 28 oC.

2. Medición del volumen embrionario mediante desplazamiento de agua

NOTA: En este protocolo, se utilizan embriones de postfertilización (hpf) de 24 h (Figura 1). Los embriones utilizados en las mediciones de volumen no se utilizan en el análisis de etanol.

  1. Colocar 10 embriones y fluido extraembrionario en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado a un volumen de 250 ml(Figura 2A). Añadir agua a la línea de llenado de 250 l (ver muestra con agua teñida en la Figura 2B).
  2. Repita el paso 2.1 para configurar receptáculos para embriones a los que se les hayan extirpado los coros.
    1. Para extraer el coro, coloque los embriones en sus coros en una placa Petri de 100 mm con 2 mg/ml de cóctel de proteasa en medios embrionarios a temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Cada pocos minutos, gire suavemente los embriones para romper el coro.
    2. Una vez que todos los embriones estén libres de su coro, retire los embriones desconuados de los medios de cóctel/embrión proteasa y colóquelos en una nueva placa Petri de 100 mm con medios embrionarios frescos para lavar los embriones. Repita este paso de lavado 1 vez más (para un total de 2 lavados). Transfiera los embriones a una nueva placa Petri de 100 mm.
  3. Usando la punta más pequeña posible y sin dañar los embriones, retire cuidadosamente todo el líquido de alrededor de los embriones usando un micropipetador p200 (Figura 2C) y pese el agua con una escala con una precisión de <0.1 mg. Para determinar el volumen de la muestra de 10 embriones, reste el peso/volumen del agua (1 ml de agua a 1 g de agua.) extraída de 250 ml. Para determinar el volumen de un solo embrión, divida la diferencia entre 250 ml y el peso del agua eliminada por 10.

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3. Tratamiento de embriones con etanol

  1. Reúna embriones de tanques de apareamiento y colóquelos en una placa Petri estándar de 100 mm. No cuente más de 100 embriones por plato de Petri individual e incubar a 28,5 oC.
    NOTA: Si se va a retirar el coro (paso 2.2), es necesario retirarlo antes de añadir etanol.
  2. A 6 hpf, agregue hasta 100 embriones a una nueva placa Petri estándar de 100 mm, ya sea con medios embrionarios o medios embrionarios + 1% de etanol (v/v). Cubra, pero NO selle el plato Petri. Colocar los embriones en una incubadora de baja temperatura a 28,5 oC durante 18 h, o hasta que los embriones alcancen el punto de tiempo de desarrollo de 24 cv.

4. Preparación del flujo de trabajo antes de procesar los embriones para la cromatografía de gases del espacio de la cabeza

  1. Hacer una solución de 5 M NaCl en agua (se necesitarán 450 l por tubo de muestra) para desnaturalizar todas las proteínas y prevenir el metabolismo del etanol. Hacer el cóctel de proteasa(Tabla de Materiales)a una concentración de 2 mg/ml en medios embrionarios.
  2. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y un vial de cromatógrafo de gases de 2 ml para cada muestra. Etiquete viales de cromatógrafo de gas de 2 ml adicionales para las normas de etanol descritas a continuación, así como aire, agua y los espacios en blanco de cóctel es 5 M NaCl/proteasa.
  3. Configurar tres micropipetadores p200 dos ajustados a 50 l, y el tercero se establece en 200 l; un micropipetador p1000 ajustado a 450 l y un micropipetador p2 ajustado a 2 l. Para las pipetas de vidrio utilizadas para transferir embriones de los platos De Petri a los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, pase rápidamente la punta de la pipeta a través de una llama para suavizar los bordes para no dañar los embriones al llevarlos a la pipeta.

5. Procesamiento de embriones para cromatografía de gases del espacio de la cabeza

NOTA: Tanto los embriones en sus coros como los previamente retirados de sus coros son tratados de la misma manera para la consistencia en el cálculo de los factores de dilución.

  1. Usando los dos micropipetores p200 ajustados a 50 l, dibuje 50 ml de la solución de cóctel de proteasa en uno y extraiga 50 ml de agua en el segundo.
  2. Con la pipeta de vidrio y el micropipetador, coloque rápidamente 10 embriones (del paso 3.2) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cierre la tapa (como se describe en la Figura 2A). Repita el procedimiento para que se prueben todas las muestras, controles y embriones tratados con etanol.
  3. Usando el micropipetador p200 ajustado a 200 l, abra rápidamente la tapa y retire todos los medios embrionarios residuales (como se describe en la Figura 2C). Coloque rápidamente la pipeta que contiene 50 ml de agua en el tubo y rápida pero suavemente (para no dañar los embriones) agregue, luego retire el agua. Agregue rápidamente 50 l de la solución de cóctel de proteasa desde el pipeteador en espera y cierre la tapa del tubo(Figura 2D).
    NOTA: Realice este proceso de una muestra a la vez.
  4. Deje que la muestra se sente a RT durante 10 minutos para permitir que el cóctel de proteasa degrade el coro. A continuación, agregue rápidamente 450 l de 5 M de NaCl y cierre la tapa del tubo(Figura 2E). Vortex las muestras durante 10 min. Para acelerar el proceso, configure el mezclador para vórtice varias muestras al mismo tiempo.
    NOTA: Agregue una pequeña cantidad (-100 l) de una mezcla de perlas de sílice (2 tamaños, 0,5 mm y 1 mm de perla) a cualquier tubo con embriones de más de 24 hpf. En embriones más antiguos, el notochord permanecerá intacto independientemente de cuánto tiempo estén homogeneizados.
  5. Después de homogeneizar durante 10 min, retire rápidamente 2 ml de sobrenadante embrionario homogeneizado y agréguelo a un vial de cromatógrafo de gases. Selle rápidamente el vial con la tapa de politetrafluoroetileno.

6. Preparación de los medios y las normas de etanol

  1. Para preparar los estándares de los medios, diluir los medios por un factor de 10 con una solución de cóctel de 5 M NaCl/proteasa. Añadir 2 ml de cada muestra a un vial de cromatógrafo de gases y sellar con una tapa de politetrafluoroetileno.
  2. Para preparar las normas de etanol, cree una dilución en serie de etanol 100% en solución de cóctel NaCl/proteasa de 5 M a las siguientes concentraciones: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 y 40 mM. Añadir 2 ml de cada estándar a un vial de cromatógrafo de gases y sellar con una tapa de politetrafluoroetileno.

7. Preparación del cromatógrafo de gases del espacio de la cabeza

NOTA: Es posible que sea necesario cambiar esta configuración y protocolo en función del cromatógrafo de gases utilizado. La cromatografía de gases del espacio de la cabeza se utiliza para cuantificar los niveles de etanol, no para la separación.

  1. Ajuste el calentador para el muestreador automático a 58 oC y enciéndalo. Permita que el calentador alcance los 58 oC y encienda las líneas de gas de aire e hidrógeno que alimentan el cromatógrafo de gases (para la ionización de llamas utilizada para cuantificar el etanol).
    NOTA: La psi debe ajustarse para que funcione correctamente el cromatógrafo de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Asegúrese de que la línea de helio esté encendida y configurada en la psi adecuada.
  2. Para el tabique, asegúrese de que el número de muestras inyectadas no es >100. Para la fibra de inyección, asegúrese de que el número de muestras inyectadas no es >500.
    NOTA: Si cualquiera de ellos supera la cantidad de inyecciones, deberá cambiarse antes de ejecutar las muestras de prueba.
  3. Encienda el software de análisis y asegúrese de que la estación de trabajo esté configurada correctamente. Almacene todos los datos de acuerdo con los estándares de laboratorio/departamento. Cree una nueva lista de ejemplo para los ejemplos que se van a ejecutar.
  4. Inicie el método de arranque y espere a que el detector de ionización de llama se estabilice antes de ejecutar las muestras. Una vez estable, ejecute el método de inicio del software para limpiar la fibra.

8. Mediciones de muestras mediante cromatografía de gases del espacio de la cabeza

  1. Una vez completado el método de inicio, cree 1 nueva línea por muestra en la lista de ejemplo. Desde el menú de métodos del software de análisis, carga 436 Actual spme ethanol 2013 3min absorb2_5min rg run. METH para cada muestra de la lista de muestras.
    1. Rellene la lista de muestras, comenzando con el aire, el agua, 5 M NaCl/proteasa de cócteles en blanco. A continuación, introduzca las normas en orden, de 0.3125 a 40 mM. Siga las normas con una segunda ronda de aire, agua y 5 M NaCl/proteasse cócteles en blanco.
    2. Introduzca todas las muestras de sobrenadantes embrionarios homogeneizados que se van a probar, desde la concentración de etanol pronosticada más baja hasta la más alta. Termine entrando en una tercera y última ronda del aire, el agua y 5 M NaCl/proteasa de cócteles en blanco.
  2. Añada los viales de cromatógrafo de gases al muestreador automático en el orden en que se introdujeron las muestras. Deje que las muestras se calienten durante 10-15 min. Inicie las ejecuciones de la muestra en el software.
  3. Después de que se hayan ejecutado todas las muestras y los espacios en blanco finales, active el método de apagado en el software agregando una muestra final en la lista de muestras y ejecutando standby. METH. Realice una copia de seguridad de todos los datos adquiridos durante las ejecuciones de ejemplo. Apague el equipo en el siguiente orden: calentador de automuestrador, tanque de hidrógeno y, sólo después de que la temperatura del cromatógrafo alcance los 30 oC, el tanque de aire. Deje el tanque de helio encendido para preservar la columna de cera.

9. Integración del pico de etanol de muestra sin salida y análisis de concentración de muestras

NOTA: Todos los valores de 9.3 en fueron calculados en un archivo de Excel que todas las ecuaciones se rellenaron previamente.

  1. Una vez completado el método de apagado, haga clic en Abrir cromatograma. Abra la carpeta que contiene los resultados. Las muestras se integran automáticamente en este programa.
  2. En los resultados, asegúrese de que se han integrado los picos correctos (picos de etanol entre 2 y 2,5). Una vez confirmadas todas las muestras, imprima o exporte los resultados.
  3. Trazar la altura máxima de los estándares de etanol en un gráfico. Calcule los valores de pendiente, intercepción Y y R2 para los estándares de etanol (R2 debe ser >0,99).
    NOTA: Estos valores se utilizarán para determinar la concentración de etanol a partir de la altura máxima de la muestra.
  4. Para cada muestra, reste la altura máxima de la muestra de la interceptación Y de los estándares de etanol. Divida este valor por la pendiente de las normas de etanol para obtener el valor de etanol para cada muestra en los viales GC.

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  1. Para calcular la concentración de etanol en los embriones, primero calcule el factor de dilución para cada muestra. Tome la medida de volumen calculada en el paso 2.3 de este protocolo y divídala por la medida de volumen más 500 l. Esto representa la solución de cóctel de 5 M NaCl/proteasa añadida a cada muestra durante el procesamiento de embriones (pasos 5.3 y 5.4).

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  1. Utilizando este factor de dilución de muestra, multiplique por el valor de etanol de muestra para cada muestra. Los resultados serán en concentración de mM. Calcule las muestras de referencia de medios multiplicando el valor de etanol de medios por el factor de dilución de 10.

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Resultados

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Los niveles de etanol en sangre no se pueden determinar en los primeros peces cebra embrionarios, porque carecen de un sistema circulatorio completamente formado. Para determinar el nivel de concentración de etanol en los embriones de pez cebra, los niveles de etanol se miden directamente a partir del tejido embrionario homogeneizado. Para medir adecuadamente las concentraciones de etanol embrionario, debe tenerse en cuenta el volumen embrionario. El embrión (yema unida) se encuentra dentro del coro (cáscara de huevo) ro...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como sistema de modelo de desarrollo, el pez cebra es ideal para estudiar el impacto de los factores ambientales en el desarrollo. Producen un gran número de embriones fertilizados externamente, lo que permite paradigmas precisos de sincronización y dosificación en estudios de etanol. Esto, combinado con las capacidades de imagen en vivo y la conservación genética y del desarrollo con los seres humanos, hacen del pez cebra un poderoso sistema modelo para estudios de teratología. Descrito es un protocolo para medir las co...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La investigación presentada en este artículo fue apoyada por subvenciones previas de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIH/NIDCR) R01DE020884 a J.K.E. y Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo (NIH/NIAAA) F32AA021320 a C.B.L. y por la subvención actual de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L. Agradecemos a Rueben Gonzales por proporcionar y ayudar con el análisis de cromatógrafo de gases. Agradecemos a Tiahna Ontiveros y a la Dra. Gina Nobles la asistencia para escribir.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Airesuministrado por contrato a la universidad
Balanza analíticaVWR10204-962
AutoSampler, CP-8400VarianCromatógrafo de gases Automuestreador
Cloruro de calcioVWR97062-590
EtanolDecon Labs2701
Vial de cromatógrafo de gases con tabique de politetrafluoroetileno/silicona y tapón de plástico 2 mLAgilent8010-0198Puede reutilizar los viales después de la limpieza, pero no los tapones/septos
Cromatógrafo de gases, CP-3800Varian
HelioProporcionado por contrato a la universidad
Columna capilar HP InnowaxAgilent19095N-123I30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m película gruesa
HyrdogenProporcionado por contrato a la universidad
Sulfato de magnesio (heptahidratado)Fisher ScientificM63-500
Tubo de microcentrífuga 1,5 mLFisher Scientific2682002
Puntas de micropipeta 10 μ LFisher Scientific13611106
Puntas de micropipeta 1000 μ LFisher Scientific13611127
Puntas de micropipeta 200 μ LFisher Scientific13611112
Placas de Petri 100 mmFisher ScientificFB012924
Pipetman L p1000L MicropipetaGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MicropipetaGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MicropipetaGilsonFA10001M
Tabique de politetrafluoroetileno/silicona y tapón de plásticoAgilent5190-7021Tapones/tabiques de repuesto para viales de cromatógrafo de gases
Cloruro de potasioFisher ScientificP217-500
Fosfato de potasio (Dibasic)VWRBDH9266-500G
PronaseVWR97062-916
Perlas de sílice .5 mmProductos Biospec11079105z
Perlas de sílice 1.0 mmBiospec Products11079110z
Bicarbonato de sodioVWRBDH9280-500G
Cloruro de sodioFisher ScientificS271-500
Fosfato de sodio (Dibasic)Fisher ScientificS374-500
Conjunto de fibra de microextracción en fase sólida Carboxen/PolidimetilsiloxanoMillipore Sigma57343-UFibras de repuesto Estación de
trabajo de cromatografía Star SoftwarecromatografíaVarian
Septa Thermogreen Low Bleed (LB-2)Millipore Sigma23154Septos de entrada de repuesto
de

Referencias

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