Summary
Dit protocol beschrijft klinisch implementeerbare bereiding van hoogwaardige PBMC- en plasmabioamples op de klinische proeflocatie die kunnen worden gebruikt voor translationele biomarkeranalyse.
Abstract
Analyse van biomarkers in perifeer bloed wordt steeds belangrijker in klinische studies om bewijs van mechanisme vast te stellen om effecten van de behandeling te evalueren, en om de dosis en schema-instelling van therapieën te helpen begeleiden. Van een enkele bloedafname kunnen perifere bloedmononucleaire cellen worden geïsoleerd en verwerkt om eiwitmarkers te analyseren en te kwantificeren, en plasmamonsters kunnen worden gebruikt voor de analyse van circulerend tumor-DNA, cytokinen en plasmametabolomics. Longitudinale monsters van een behandeling geven informatie over de evolutie van een bepaalde eiwitmarker, de mutatiestatus en het immunologische landschap van de patiënt. Dit kan alleen worden bereikt als de verwerking van het perifere bloed effectief wordt uitgevoerd op klinische locaties en monsters goed worden bewaard van het bed tot de bank. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor algemeen gebruik dat op klinische locaties kan worden geïmplementeerd voor het verkrijgen van PBMC-pellets en plasmamonsters in multicenter klinische proeven, waarmee klinische professionals in ziekenhuislaboratoria met succes monsters van hoge kwaliteit kunnen leveren, ongeacht hun niveau van technische expertise. Er worden ook alternatieve protocolvariaties gepresenteerd die zijn geoptimaliseerd voor meer specifieke downstream-analysemethoden. We passen dit protocol toe voor het bestuderen van eiwitbiomarkers tegen DNA-schaderespons (DDR) op röntgenstralingsbloed om de geschiktheid van de aanpak aan te tonen in oncologische omgevingen waar DDR-geneesmiddelen en/of radiotherapie zijn beoefend, evenals in preklinische stadia waar mechanistische hypothesetests vereist zijn.
Introduction
De ontwikkeling van geneesmiddelen is gericht op het leveren van nieuwe therapieën die tegemoet komen aan onvervulde medische behoeften en meer gerichte, gepersonaliseerde geneeskunde. Meerdere geneesmiddelmechanismen worden actief onderzocht, waaronder enzymatische remming zoals kinase1,protease2of poly (ADP-ribose) polymeraseremmers (PARP)3,eiwitafleiders4,therapeutische antilichamen5en antilichaamconjugeerde geneesmiddelen (ADC's)6, onder vele anderen. Een voorbeeld van de inspanningen om betere behandelingen in de oncologie te verkrijgen , is het gebruik van kinaseremmers met als doel de signaalcascades te stoppen die de proliferatie van kankercellen1,7houden . Het meten van de niveaus van substraatfosforylatie die specifiek zijn voor deze kinases is de beste farmacodynamische biomarker om het werkingsmechanisme van deze remmers te kwantificeren8. Andere geneesmiddelen kunnen de expressie van een bepaald eiwit moduleren en in dat geval is het van het grootste belang om de veranderingen in de concentratie van hun doeleiwit in de lengterichting tijdens de behandeling te kwantificeren. Daarom is, onafhankelijk van de kenmerken van een geneesmiddel of een pathologie, evaluatie van biomarkers om de farmacokinetiek (PK)/farmacodynamica (PD) relatie tussen blootstelling aan geneesmiddelen en doelmodulatie vast te stellen, de beste praktijk in vroege klinische ontwikkeling en maakt het mogelijk een veilige en getolereerde farmacologisch actieve dosis/schema te bepalen9.
Hoewel in de klinische ontwikkeling van oncologie biomarkeranalyse in biopten misschien de beste instelling is om het bewijs van het mechanisme van een geneesmiddel vast te stellen, is het aantal beschikbare biopsieën in een studie meestal vrij beperkt10,11. Als alternatief zijn perifere bloedmonsters zeer waardevol voor klinische proeven omdat ze een minimaal invasieve procedure omvatten, snel en gemakkelijk te verkrijgen zijn voor een vergemakkelijkende longitudinale analyse, goedkoper zijn dan biopten en uitgebreide informatie bieden voor realtime monitoring van het resultaat van een behandeling. Een bijkomend voordeel van de beoordeling van PD-biomarkers in perifeer bloed is het vermogen om de biosample te gebruiken om ook PK te kwantificeren, waardoor nauwkeurigheid mogelijk is bij het bepalen van pk/PD-kwantitatieve relaties en daaropvolgende PK/PD-modellering12,13. Perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) uit volbloed kunnen worden geïsoleerd om eiwitmarkers te bestuderen, die ofwel veranderingen in hun expressieniveau of in hun post-translationele modificaties ervaren. Bovendien kunnen PBMC's worden gebruikt voor immunofenotyperingsdoeleinden14,15, immuunfunctionaliteitstesten zoals het beoordelen van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC)16 en epigenetische analyse door RNA-isolatie. Evenzo kan plasma uit volbloed worden gebruikt om cytokinen te kwantificeren om de immunologische respons van een patiënt te karakteriseren, om metabolische studies uit te voeren, en ook om circulerend tumor-DNA (ctDNA) te isoleren en te sequencen voor het monitoren van de klonale evolutie van ziekte onder selectie uit het therapeutische middel, vaak met een mechanistische basis voor behandelingsresistentie17,18,19 waardoor de ontwikkeling van volgende generaties therapeutische stoffen mogelijk wordt20. Ten slotte maakt isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit perifeer bloed de evaluatie van ziekteprogressie mogelijk door longitudinale opsomming, DNA/RNA-sequencing en eiwit-biomarkeranalyse21. Hoewel deze isolatie verenigbaar is met het hierin beschreven protocol22, maakt de lage overvloed aan CTC 's in veel kankertypen en vroege stadia van de ziekte het gebruik van gespecialiseerde buizen geschikter voor het minimaliseren van CTC-afbraak23.
In de afgelopen jaren heeft het gebruik van vloeibare biopten de informatie die is verkregen in klinische studies verbeterd en PBMC-collecties zijn opgenomen in veel studies om doelbetrokkenheid en bewijs van mechanisme te controleren, hetzij rechtstreeks in tumorcellen voor sommige soorten hematologische maligniteiten, hetzij op de PBMC's zelf als PD-surrogaten van tumorcellen24,25,26. De bereiding van hoogwaardige monsters heeft een positieve invloed op het bepalen van de veiligste en meest effectieve behandeling voor een bepaalde pathologie, maar onze ervaring is dat de kwaliteit van PBMC-preparaten die zijn verkregen van verschillende klinische locaties is onderworpen aan een grote variabiliteit in kwaliteit, wat resulteert in monsters die niet geschikt zijn voor downstream-analyse. Dit heeft invloed gehad op de hoeveelheid PD-gegevens die uit die studies kunnen worden verzameld.
Hier beschrijven we in detail een eenvoudig te volgen protocol dat laat zien hoe u zowel PBMC's als plasmamonsters efficiënt kunt isoleren van een enkele bloedafname in een klinische omgeving. Het protocol is gebaseerd op de instructies van de fabrikant van de mononucleaire celvoorbereidingsbuizen, waarin wijzigingen zijn opgenomen waarbij de praktijkervaring problemen in de uitvoering van het protocol heeft aangetoond, zoals gemeld door klinische locaties, zoals centrifugeerproblemen, verwerkingsvertragingen en monsteroverdracht naar cryovials. Er zijn alternatieve commercieel beschikbare methoden voor het gebruik van mononucleaire celpreparaatbuizen op basis van dichtheidsgradiëntscheiding met behulp van polysacharideoplossingen met of zonder barrière die de oplossing van het bloed scheidt27. Als de relevante klinische site al goed ervaren is in deze alternatieve methodologieën, kan dit protocol aanvaardbaar worden vervangen door deze. In dergelijke gevallen kunnen twee factoren worden overwogen: sommige alternatieve methoden vereisen een overdracht van volbloed van een verzamelbuis naar een afzonderlijke bereidingsbuis waar een extra overdracht van menselijk primair biologisch materiaal een licht verhoogd veiligheidsrisico kan opleveren, en het succes van methoden zonder barrières die het bloed van de polysacharideoplossing scheiden, is afhankelijk van kritieke stappen, zoals het laagje van het bloedmonster op het dichtheidsgradiëntmedium dat de ontwikkeling vereist van een verfijnd niveau van technische expertise dat niet altijd in een ziekenhuislaboratoriumomgeving wordt aangetroffen. De bovenstaande punten niettegenstaande, zijn de algehele levensvatbaarheid en het celherstel vergelijkbaar tussen deze technieken15,28. De keuze van de methodologie is daarom enigszins afhankelijk van eerdere technische ervaring, maar in onze handen kunnen mononucleaire celvoorbereidingsbuizen met succes worden gebruikt in een brede klinische context en zijn onze, anders, aanbeveling.
Hoewel een eindpunt van dit protocol is om PBMC-pellets te produceren voor verdere verwerking tot lysaten, kunnen andere definitieve toepassingen van de PBMC-collectie worden geïmplementeerd, zoals isolatie van nucleïnezuren, of het produceren van PBMC-uitstrijkjes of PBMC-blokken die geschikt zijn voor immunohistochmiemethoden (IHC). Belangrijk is dat, aangezien elke biosample van patiënten een invasieve procedure op ten minste een bepaald niveau vertegenwoordigt, dit protocol het nuttige materiaal van elk monster maximaliseert door ook plasma te isoleren dat kan worden gebruikt voor cytokine-analyses, metabolomische studies of ctDNA-sequencing.
De analyse van perifere biomarkers in oncologische studies is een van de vele toepassingen van PBMC-lysaten. Een voorbeeld is de evaluatie van de DNA-schaderespons (DDR) bij behandelingen zoals chemotherapie, radiotherapie of het gebruik van remmers van enzymen die betrokken zijn bij de DDR, zoals de fosfatidylinositol-3 kinase-gerelateerde kinases (PIKK's)7 en PARPs3,13. Het doel van deze behandelingen is om dna-schade in proliferatiecellen te vergroten, wat een hoge toxiciteit genereert in cellen met verminderde DDR-mechanismen en celcycluscontrolepunten, zoals kankercellen. Hier presenteren we een voorbeeld met een studie van DDR-biomarkers in perifeer bloed dat wordt onderworpen aan röntgenfoto's.
Protocol
Geïnformeerde toestemming van de patiënt en volledige naleving van relevante nationale ethische vereisten in elk rechtsgebied, bijvoorbeeld de Human Tissues Act (HTA – Verenigd Koninkrijk, 2004) en de Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA – Verenigde Staten, 1996) zijn verplicht. Zorg ervoor dat u volledig gedocumenteerde ethische goedkeuring hebt voordat u begint met het werken aan van mensen afgeleide materialen. Bloed dat werd gebruikt bij de optimalisatie van dit protocol werd verstrekt met de juiste toestemming van het Volunteers Advancing Medicine Panel (VAMP) (ethische referentie 16/EE/0459, studie CRF494, substudie 001) uitgevoerd door de NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Verenigd Koninkrijk, in het kader van een overeenkomst voor de levering van menselijke biologische monsters met het National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. De AstraZeneca Biobank in het Verenigd Koninkrijk heeft een licentie van de Human Tissue Authority (Licentie nr. 12109) en heeft de National Research Ethics Service Committee (NREC) Goedkeuring als Research Tissue Bank (RTB) (REC nr. 17/NW/0207).
1. Algemene voorbereidingsbegeleiding
OPMERKING: Alle werkzaamheden met niet-gefixeerd menselijk materiaal zoals bloed, plasma en PBMC's in dit protocol moeten werken in de veronderstelling dat deze materialen potentieel besmettelijke agentia kunnen bevatten en moeten daarom worden uitgevoerd onder geschikte bioveiligheidsvoorzorgsmaatregelen. Voor patiënten die als negatief zijn getest op bekende ziekteverwekkers, mag niet worden aangenomen dat monsters niet-infectieus zijn en daarom moeten nog steeds geschikte veiligheidsmaatregelen worden toegepast. Afvalproducten die uit deze materialen worden gegenereerd, moeten met dezelfde bioveiligheidsmaatregelen worden behandeld en volgens de plaatselijke voorschriften worden verwijderd.
- Kies tussen de twee soorten mononucleaire celpreparaatbuizen die natriumcitraat of natriumroparine als anticoagulantia gebruiken. Voor veel downstreamtoepassingen kunnen deze twee anticoagulantia door elkaar worden gebruikt, maar beide anticoagulantia moeten worden getest voordat er een voor de studie wordt geselecteerd.
- Label één mononucleaire celpreparaatbuis van 8 ml die moet worden gebruikt voor de bloedafname met de gecodeerde ID van de patiënt. Houd de buisjes op kamertemperatuur (18-25 °C).
- 1x PBS bewaren bij kamertemperatuur (18-25 °C). Gebruik 30 ml per preparaat.
- Zorg ervoor dat buizen voor afzonderlijke plasmamonsters en het cryovial voor het PBMC-monster nauwkeurig zijn gelabeld met unieke identificatiemiddelen, zoals gespecificeerd in het betreffende gedeelte van de labhandleiding.
- Als PBMC's worden gebruikt om gefosforyleerde eiwitten te controleren, bereid pbs dan samen met fosfataseremmers: meng 5 ml PBS met 50 μL fosfataseremmercocktail 2 + 50 μL fosfataseremmercocktail 3. Bereid vers en houd op ijs tot gebruik.
- Als PBMC's cryopreserved worden, bereid dan 1 ml vriesmengsel per monster door 90% FBS + 10% DMSO te mengen.
2. PBMC-collectie (Figuur 1A)
- Trek 8 ml bloed in de mononucleaire celvoorbereidingsbuis met behulp van de door de fabrikant beschreven standaardtechniek. Keer de buis voorzichtig 8 tot 10 keer om om het antistollingsmiddeladditief met bloed te mengen. Niet schudden om hemolyse te voorkomen. Noteer het tijdstip waarop het bloed werd afgenomen.
- Bewaar de buis na het ophalen rechtop bij kamertemperatuur tot centrifugeren. Verwerk de monsters zo snel mogelijk, idealiter binnen een uur na deze bloedafname, maar niet later dan 4 uur na het verzamelen. Noteer de timing bij het starten van de verwerking van het bloed.
- Onmiddellijk voorafgaand aan de centrifugeer remix het bloedmonster door de buis nog 8 tot 10 keer voorzichtig om te keren.
- Centrifugeer de buis/bloedmonsterbuizen in een horizontale rotor (uitzwaaikop) bij 1.500 – 1.800 x g gedurende 30 min bij kamertemperatuur (18-25 °C). Zorg ervoor dat alle buizen goed in balans zijn.
Figuur 1: Algemeen overzicht van het protocol en representatieve afbeeldingen van de centrifuge. (A) Schematisch overzicht van het protocol voor de bereiding van PBMC's en plasma. *Als er tijdsdruk is, kan stap 2.4 worden ingekort tot 20 minuten en kunnen stap 3.3 tot 3.6 worden verwijderd. ** Neem indien nodig een aliquot om cellen te tellen. 2 extra centrifugatiestappen vereist voor ctDNA-analyse/metabolomics (B) afbeelding van een swing-out hoofdrotorcentrifugeset voor stap 2.4. (C) Afbeelding van de rotor, die twee emmers bevat die de adapters bevatten om mononucleaire celvoorbereidingsbuizen te draaien. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
OPMERKING: x g (ook wel RCF, relatieve centrifugaaleenheden) en RPM (omwentelingen per minuut) zijn verschillende eenheden. Zorg ervoor dat u de centrifuge instelt op x g (RCF). Gebruik de online calculator (zie Materialentabel) voor de conversie. Als er alleen rotor met vaste hoek beschikbaar is, voert u deze stap gedurende 10 minuten uit bij 1.500 – 1.800 x g.
- Controleer na centrifugeren op de aanwezigheid van een donkerrode laag onder de barrière (die meestal rode bloedcellen bevat) en 2 lagen boven de barrière. De bovenste laag is het plasma (strokleurig) en de witachtige laag eronder is de buffy coat die de PBMC's bevat. Deze lagen zijn gemakkelijk te onderscheiden bij het bekijken van de buis tegen een donker/zwarte achtergrond.
Figuur 2: Buizen om PBMC's te isoleren. (A) Afbeelding van de buizen vóór centrifugeren (stap 2.4), leeg (links) of met bloed (rechts). (B) Succesvolle scheiding van de PBMC-laag na centrifugeren (stap 2.5). (C) Afbeelding van de PBMC-laag na centrifugeren en een beetje plasma over om ervoor te zorgen dat alle PBMC's worden verzameld (stap 2.7). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
OPMERKING: Als deze lagen niet zichtbaar zijn, duidt dit waarschijnlijk op een fout bij het instellen van de centrifugeereenheden. Zorg ervoor dat de juiste centrifugeadapter wordt gebruikt en dat de juiste "x g" is ingesteld. Herhaal stap 2.4.
- Gebruik onmiddellijk na centrifugeren een serologische pipet om ongeveer de helft van het plasma over te brengen in een gelabelde conische centrifugebuis van 15 ml met dop, terwijl u voorzichtig bent om de PBMC-laag (ongeveer 4-5 ml) niet te verstoren. Bewaar deze buis tijdelijk met plasma op nat ijs om later in stap 4 te worden gebruikt. Zet opzij voor nu.
- Verzamel de gehele PBMC-laag met een Pasteur pipet door de pipet in de cellaag te plaatsen en breng deze over op een andere conische centrifugebuis van 15 ml met dop. Het is acceptabel om ook een kleine hoeveelheid plasma te nemen, indien nodig, om alle PBMC-laag volledig te krijgen. Het volume is meestal 1-2 ml. Ga onmiddellijk verder met stap 3 hieronder.
3. PBMC wasstappen
OPMERKING: Het doel van de wasstappen is om resterende bloedplaatjes en plasma uit de PBMC-pellet te verdunnen en te verwijderen. Alle centrifugeerstappen moeten bij kamertemperatuur (18-25 °C) worden uitgevoerd.
- Voeg PBS op kamertemperatuur toe aan de PBMC-buis om het volume op 15 ml te brengen. Sluit de buis af. Meng cellen door de buis 5 keer voorzichtig om te keren.
- Centrifugeer gedurende 15 min op 300 x g. Merk op dat dit een veel zachtere centrifugeer is dan de initiële centrifugeren.
- Visualiseer de pellet door de buis tegen een donker/zwarte achtergrond te bekijken. Verwijder het supernatant door vacuüm aspiratie of met een pipet (figuur 3A). Gooi het supernatant weg en laat een volume van ongeveer 500 μL boven de witachtige PBMC-pellet achter.
Figuur 3: PBMC pellets. (A) Pellet verkregen in de eerste wasstap 3.3. (B) Pellet geïsoleerd in de tweede wasbeurt (stap 3.7). (C) Pellet met een hoog hemolysegehalte verkregen uit bloed dat later dan 4 uur wordt verwerkt uit de bloedafname die in de tweede wasbeurt is geïsoleerd (stap 3.6). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Resuspend de cel pellet door zachtjes pipetten op en neer in de resterende supernatant.
- Voeg extra 1x PBS toe om het volume op 10 ml te brengen. Sluit de buis af. Meng de cellen door de buis voorzichtig 5x om te keren. Als celtelling vereist is in het studieprotocol, ga dan naar stap 3.5.1, indien niet vereist, ga dan direct naar stap 3.6.
- Neem een 40 μL aliquot van de opnieuw gesuspendeerde cellen en meng met 40 μL trypan blauw. Tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische celteller.
- Centrifugeer de suspensie vanaf stap 3.5 gedurende 10 min bij 300 x g. Verwijder zoveel supernatant als redelijkerwijs mogelijk is zonder de celkorrel te verstoren.
- Verwijder en gooi het resterende supernatant voorzichtig boven de celkorrel door te pipetten met een fijne pasteurpipet of een micropipet zonder de celkorrel te verstoren. Laat weinig tot geen vloeistof boven de pellet na het voltooien van deze stap. Als het eindpunt van dit protocol een PBMC-pellet is, gaat u naar stap 3.8; als het eindpunt cryopreserved PBMC's is, gaat u naar stap 3.10.
- Voeg 50 μL nieuw PBS (of het aangevulde PBS bereid in stap 1.5 indien van toepassing op uw eindpunt) toe aan de pellet en pipet voorzichtig op en neer met behulp van een micropipet om alle cellen homogeen te resuspenden. Breng de volledige celsuspensie over op een gelabeld cryoviaal van 1,5 ml en plaats deze onmiddellijk op nat ijs totdat de monsters zijn bevroren.
- Vries de gelabelde monsters in door ze in vloeibare stikstof of direct in droogijs te plaatsen. Cellen kunnen ook worden ingevroren bij -80 °C vriezer met behulp van celvriesdozen. In dit geval, prechill de dozen volledig in -80 °C alvorens de celbuizen toe te voegen. Noteer het tijdstip waarop celkorrels werden ingevroren. Zodra cellen bevriezen, bewaren bij -80 °C, schip bevroren op droog ijs.
- Optioneel, om de PBMC's te cryopreserveren, strekken ze de pellet opnieuw op in 1 ml van het vriesmengsel (stap 1.6) en brengen ze over naar een gelabeld cryoviaal. Ga verder zoals beschreven in stap 3.9, maar in dit geval is het alleen acceptabel om celvriesdozen te gebruiken om de monsters in te vriezen. Breng over op vloeibare stikstof voor verzending en opslag na minimaal 24 uur in de vriesbox te hebben ingsgebrengd.
4. Plasmavoorbereidingsstappen (Figuur 1A)
- Na -80 °C opslag van de PBMC pellets, bereid nu de plasma aliquot die tijdelijk werd opgeslagen op nat ijs in stap 2.6. Voer de volgende centrifugeerstappen uit om het plasma te verduidelijken als het doel van het monster ctDNA-analyse is, anders gaat u direct naar stap 4.2.
- Centrifugeer het plasma gedurende 10 minuten bij 1.600 - 2.000 x g bij 4 – 8 °C in een rotor met vaste hoek (of 15 min in een uitklaprotor).
- Spuit voorzichtig het plasmasupernatant af, zorg ervoor dat u geen pellets verstoort en breng over op een nieuwe buis van 15 ml. Gooi de buis met het geplet materiaal weg.
- Centrifugeer het plasma gedurende 10 minuten bij 1.600 - 2.000 x g bij 4 – 8 °C in een rotor met vaste hoek (of 15 min in een uitklaprotor).
- Breng het plasmasupernatant voorzichtig over naar een nieuwe buis van 15 ml, waarbij u er zeker van bent dat u geen geplet materiaal verstoort. Gooi de buis met het geplet materiaal weg.
OPMERKING: Als er geen gekoelde centrifuge beschikbaar is, bewaar de cellen dan 5 minuten op ijs tussen elke draai of centrifugeer de monsters in een koude ruimte.
- Breng plasma in 1 ml aliquots over in 5 verse microtubes van 2 ml. Gebruik minder dan 5 flacons als er niet genoeg plasma is om 5 flacons te vullen met 1 ml aliquots en de verwachting is dat de laatste flacon minder dan 1 ml plasma zal bevatten. Als er meer dan 5 ml plasma is, gooi de rest dan weg. Noteer het totale plasmavolume in elke buis.
- Vries de plasma aliquots onmiddellijk rechtop in door ze op te slaan bij -80 °C.
5. Monsterzending
- Verzend zowel PBMC pellets als plasmamonsters op droogijs.
- Zorg ervoor dat het monster niet ontdooid is voor en tijdens de verzending. Verpak voldoende droogijs met de monsters om ervoor te zorgen dat ze gedurende het hele verzendproces bevroren blijven, rekening houdend met mogelijke vertragingen tijdens het transport.
6. Volbloedbestraling en westelijke vlekanalyse van DDR-biomarkers (figuur 4A)
OPMERKING: Dit is een ex vivo behandeling die in de meeste gevallen niet nodig zal zijn in de kliniek, maar deze experimenten zijn een waardevolle verkennende strategie om geschikte klinische biomarkers te vinden. Bloedmonsters moeten zo snel mogelijk na het verzamelen worden behandeld om de beste resultaten te garanderen.
- Warm de röntgenkast op. Label drie buizen van 15 ml als respectievelijk 0, 0,2 en 7 Gy.
- Neem drie mononucleaire celvoorbereidingsbuizen met vers getrokken bloed van één persoon en breng na het voorzichtig omkeren van de buizen 8 tot 10 keer het bloed over naar de drie buizen van 15 ml.
- Plaats de 0.2 Gy buis in de röntgenkast, sluit de deur en breng 0,2 Gy dosis aan op de buis door het signeernummer en de dosis te selecteren. Breng 7 Gy stralingsdosis aan op de 7 Gy buis door de in de kast gekozen dosis aan te passen.
- Incubeer de drie buizen gedurende een uur bij 37 °C.
- Breng het bloed terug naar de mononucleaire celpreparaatbuizen en voer het PBMC-bereidingsprotocol uit zoals voor een klinische instelling van stap 2.4 tot stap 3.8.
- Voeg een volume lysisbuffer aangevuld met protease- en fosfataseremmers gelijk aan het celpelletvolume (in dit geval 70 μL RIPA-buffer) toe aan elk van de celpellets, pipetteer op en neer en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Soniceer de monsters als er een sonicator beschikbaar is (3 cycli, 30 s ON / 30 s OFF, 4 °C), spuit de monsters als alternatief om de nucleïnezuren te breken om viscositeit in het monster te elimineren.
- Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij ≥ 15.000 x g, bij 4 °C. Breng elk supernatans over naar een nieuwe buis van 1,5 ml, beoordeel kwalitatief het niveau van hemolyse (visuele inspectie) en meet de eiwitconcentratie met elke gewenste methode.
- Meng 40 μg totaal lysaat met monsterlaadbuffer met SDS en monsterreducerend middel. Kook monsters gedurende 5 minuten in een hitteblok.
- Laad 20 μg van elk monster per rijstrook in tweevoud in een 4-12% bis-tris eiwitgel en voer een SDS-PAGE uit.
- Breng de eiwitten na de scheiding over naar een nitrocellulosemembraan met behulp van een in de handel verkrijgbaar systeem (20 V, 10 min) en blokkeer met 5 % melk in TBST.
- Snijd het membraan op de relevante moleculaire afmetingen en incubeer 's nachts met de primaire antilichamen bij 4 °C (zie tabel met materialen voor antilichamen en verdunningen).
- Verwijder de primaire antilichamen en was de membranen 3 keer met TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer met de HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Was 3 keer met TBST gedurende 5 min.
- Breng het ECL-reagens aan en analyseer de verkregen beelden ten opzichte van het HRP-signaal.
Representative Results
Om de kwaliteit van PBMC-preparaten in onze klinische proeven te verbeteren, hebben we een protocol gegenereerd met beknopte, duidelijke stappen die kunnen worden gevolgd door laboratoriumprofessionals in ziekenhuizen, onafhankelijk van hun moleculaire biologieachtergrond en laboratoriumvaardigheden. We hebben het protocol van de fabrikant aangepast met wijzigingen in die stappen waarbij uitvoeringsproblemen zijn geïdentificeerd of gerapporteerd vanaf klinische locaties die betrokken zijn bij verschillende klinische onderzoeken met meerdere centrales. Het protocol kan echter verder worden geoptimaliseerd om aan specifieke vereisten te voldoen, zoals tijdsbeperkingen op de klinische locatie of het type downstreamanalyses (zie Aanvullend dossier). We laten zien dat de DDR kan worden geanalyseerd in PBMC's door te kijken naar specifieke biomarkers op DNA-schade die wordt gegenereerd door straling.
De meest voorkomende vragen die we van klinische locaties hebben ontvangen, hebben betrekking op de centrifugeerstappen, die direct van invloed zijn op het succesvol kunnen isoleren van PBMC's en het verkrijgen van de uiteindelijke PBMC-pellet. Het gebruik van het juiste type centrifuge voor de rotor van de uitklapkop (figuur 1B,C) is de sleutel tot het succes van het protocol. Wanneer echter alleen een rotorcentrifuge met vaste hoek beschikbaar is op de klinische locatie, raden we aan stap 2.4 uit te voeren in een rotor met vaste hoek op dezelfde RCF als voor een uitklapkoprotor, maar gedurende slechts 10 minuten. Dit zorgt ervoor dat een PBMC-laag wordt gescheiden van het plasma (zie figuur 2B,C). Terwijl het gelaagd maken van bloed op een dichtheidsgradiëntscheidingsmedium een afremcentrifugatie vereist, kan bloed in mononucleaire celvoorbereidingsbuizen worden gecentrifugeerd met remmen aan vanwege de aanwezigheid van een gelbarrière in de buis die zorgt voor het behoud van de PBMC-laag gescheiden van de dichtere bloedbestanddelen27,28.
Ten minste 4 ml niet-verdund plasma van hoge kwaliteit werd verkregen uit de centrifugeren van bloed in het buisformaat van 8 ml, wat verder kan worden verduidelijkt voor het gebruik ervan in gespecialiseerde analyses zoals ctDNA-sequencing of metabolomics-studies29,30 (optionele stappen 4.1.1-4.1.4). De hoeveelheid geïsoleerde PBMC's, de grootte van de pellets en hemolyse of besmetting van rode bloedcellen zijn andere zorgen afkomstig van klinische locaties en ervaring met het analyseren van monsters. Het aantal cellen verkregen uit 8 ml bloed was variabel afhankelijk van de patiënt en de ziekte-instelling, maar over het algemeen is de verkregen pellet klein van formaat en van een transparante/witte kleuring (figuur 3A,B). Vanwege deze kenmerken is het belangrijk om de pellet te visualiseren tegen een donkere achtergrond om te voorkomen dat deze per ongeluk aspireert tijdens de wasstappen (2.5 en 3.3). Soms kunnen pellets enige rode verkleuring hebben als gevolg van rode bloedcelverontreiniging(figuur 3C),en dit heeft een negatief effect op de kwaliteit van het preparaat. Om te voorkomen dat kleine pellets zoals die in figuur 3verloren gaan, wordt het overbrengen van de PBMC-pellet naar een cryovial vergemakkelijkt door stap 3.7, waarbij de PBMC-pellet wordt geresuspendeerd in 50 μL PBS.
De typische opbrengst bij het gebruik van deze buizen en bloed van gezonde individuen varieert tussen 7 tot 21 x10 6 cellen voor 8 ml, en een celherstel tussen 70 en 80% zoals het onze ervaring is en zoals eerder is aangetoond27,28. Dit hangt af van zowel het individuele celaantal als de operator en is vergelijkbaar met de celnummers en celterugwinningswaarden die door andere methoden worden verkregen met behulp van dichtheidsgradiënt (met inbegrip van systemen die buizen met een scheidingsbarrière gebruiken)15,27,28. Een illustratief voorbeeld van de variatie in het aantal PBMC's dat met deze methode is geïsoleerd, afhankelijk van de ziekte-instelling, is de analyse van PBMC-markers bij patiënten met chronische lymfatische leukemie (CLL). Het aantal cellen dat bij de toepassing van dit protocol werd teruggevonden uit een mononucleaire celpreparaatbuis van 8 ml varieerde van 1,62 x 104 tot 1,99 x10 9 in 45 monsters verkregen van 7 patiënten in onderzoek NCT0332827331 (tabel 1). Een gerelateerde parameter is de eiwitconcentratie van de PBMC-lysaten die door deze methode wordt verkregen, en dit hangt af van het aantal geïsoleerde cellen en de efficiëntie van de eiwitextractie. De celkorrels die in sectie 6 werden gelyseerd, werden gegenereerd met RIPA-buffer en sonicatie (stap 6.6). De resuspensie van de celkorrels in hetzelfde volume lysisbuffer resulteert meestal in een reeks concentraties van 3 tot 10 mg/ml, en in dit specifieke voorbeeld waren de lysaatconcentraties respectievelijk 6,8, 8,3 en 8,6 mg/ml voor respectievelijk 0, 0,2 en 7 Gy. Dit wordt echter onderworpen aan een hoge variabiliteit bij het ontvangen van monsters van klinische locaties die niet optimaal zijn voorbereid, de ziekte van de patiënt en de aanwezigheid van hemoglobine door besmetting met rode bloedcellen. Zeer kleine pellets moeten bijvoorbeeld worden geresuspendeerd in een volume lysisbuffer dat groter is dan het volume van de celpellets om zowel eiwitconcentratiemeting als downstream biomarkeranalyse mogelijk te maken, wat resulteert in meer verdunde monsters. In dat geval kan, als een monsterconcentratie lager is dan 1 mg/ml, een uitdaging vormen om assays zoals western blot uit te voeren vanwege deze hoge verdunningsfactor. In de eerder genoemde CLL-monsters varieerde het volume van de lysisbuffer dat aan de resuspend werd toegevoegd van de celkorrels van 50 tot 500 μL en de eiwitconcentratie van 1,62 tot 19,77 mg/ml (tabel 1).
Wanneer monsters rode bloedcelverontreiniging of hemolyse vertonen(figuur 3C),wordt de eiwitconcentratie van het PBMC-lysaat overschat als gevolg van de opname van hemoglobine uit de erytrocyten. Dit is de reden waarom men een visuele inspectie en annotatie van dergelijke monsters zou moeten uitvoeren, zoals beschreven in stap 6.7 van het protocol. Een te hoog belastingsmonster kan de aanwezigheid van hemoglobine compenseren bij het uitvoeren van biomarkeranalyses voor zover in de test een beladingscontrole is opgenomen. Andere meer kwantitatieve methoden voor het meten van hemolyse zouden kunnen worden toegepast, zoals het meten van absorptie bij 414 nm32.
De DDR werd geanalyseerd in PBMC's verkregen volgens dit klinische protocol. Om een situatie te illustreren die DNA-schadelijke klinische behandelingen zoals radiotherapie of chemotherapie nabootst, werd volbloed van gezonde vrijwilligers ex vivo onderworpen aan röntgenstraling (figuur 4A). Ioniserende straling (IR) zoals röntgenstralen veroorzaakt verschillende soorten DNA-schade, waaronder DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's). DNA-schadedetectie van deze laesies activeert PIKK's zoals ataxie-telangiectasia mutated (ATM), ATM en Rad3-gerelateerde (ATR) en DNA-afhankelijke eiwitkinase (DNA-PK), die DNA-reparatiemechanismen zoals homologe recombinatie (HR) of niet-homologe eindvoeging (NHEJ) inschakelen. Activering van ATM door de aanwezigheid van DSB's vindt plaats door de rekrutering ervan op plaatsen van schade door het MRN-complex (MRE11-RAD50-NBS1), waardoor atm-autofosforylatie ontstaat bij verschillende residuen, waaronder Ser1981. Op zijn beurt, geactiveerd ATM fosforyleert de componenten van het MRN-complex en andere eiwitten zoals histon variant H2AX op Ser139 (waar pSer139-H2AX is ook bekend als γH2AX) ter bevordering van een structurele verandering in de chromatine die zich uitstrekt van de DSB die de rekrutering van andere DDR-factoren33vergemakkelijkt . PBMC's reageren op ioniserende straling, ondanks hun lage proliferatiesnelheid en massaspectrometriemethoden hebben kwantificering van de upregulatie van gefosforyleerde Ser635 op RAD50 door ATM mogelijk gemaakt. Deze fosforylering wordt verminderd in aanwezigheid van ATM-remmers en RAD50 pS635 is verder gevalideerd als farmacodynamische biomarker voor klinische ATM-remmerbehandelingen bij tumoren door immunohistochistry8. Om de reactie van PBMC's op straling te evalueren, werd bloed van gezonde vrijwilligers onderworpen aan verschillende IR-doses en werden monsters genomen na een incubatie van 1 uur bij 37 °C (figuur 4A). Hiertoe werden bloeden overgebracht naar plastic buizen om te voorkomen dat de opbrengst van de PBMC-isolatie als gevolg van hoge temperaturen zou afnemen (stap 6.2). We analyseerden hoe ATM werd geactiveerd, niet alleen door te kijken naar de eerder gerapporteerde RAD50 pS635, maar ook ATM pS1981 en γH2AX. In de drie onderzochte gevallen werd een toename van deze post-translationele modificaties waargenomen bij hogere IR-doses (figuur 4B). Interessant is dat de fosforylering van ATM en RAD50 aanzienlijk was bij de lage dosis 0,2 Gy, wat suggereert dat deze post-translationele modificaties mogelijk kunnen worden ondervraagd als PD-biomarkers voor behandelingen waarbij DNA-DSB's met een goed dynamisch bereik worden genereren, niet alleen in tumormonsters, maar ook in perifeer bloed. Dit maakt het mogelijk om de PD-respons op de behandeling te controleren door longitudinale monsters te verkrijgen tijdens de behandeling. De timing van de bloedafname tot de verwerking van de monsters is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat deze signaalcascades nog steeds actief zijn, omdat vertragingen in de verwerking van invloed zullen zijn op de kinetiek van dergelijke cascades en men de fosforyleringsgebeurtenissen zou kunnen missen die als fosfomarkers worden gebruikt.
Figuur 4: PBMC's geïsoleerd uit ex vivo bestraald bloed volgens dit klinische protocol vertonen biomarkers om te informeren over de omvang van de DNA-schade veroorzaakt door de behandeling. (A) Schematisch overzicht van het protocol voor de voorbereiding van PBMCs en analyse van de DDR bij volbloedbestraling. *2 extra centrifugatiestappen vereist voor ctDNA-analyse/metabolomics. (B) Westerse vlek met dosisafhankelijke upregulatie van DDR phospho-biomarkers in PBMC's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Monster | Aantal PBMC's/ 8 ml bloed | Aangevuld RIPA buffervolume (μL) | Eindconcentratie (mg/ml) |
| A.1 | 39100000 | 70 | 12.16 |
| A.2 | 97400000 | 100 | 4.54 |
| A.3 | 233000000 | 150 | 7.63 |
| A.4 | 316000000 | 150 | 16.87 |
| A.5 | 387000000 | 150 | 12.60 |
| A.6 | 459000000 | 150 | 12.71 |
| A.7 | 414000000 | 200 | 15.67 |
| A.8 | 253000000 | 150 | 14.56 |
| A.9 | 509000000 | 300 | 10.67 |
| B.1 | 15200000 | 70 | 2.96 |
| B.2 | 10500000 | 50 | 4.59 |
| B.3 | 13200000 | 50 | 3.99 |
| B.4 | 34800000 | 100 | 10.41 |
| B.5 | 1620000 | 70 | 7.11 |
| B.6 | 70200000 | 100 | 9.26 |
| B.7 | 65400000 | 100 | 12.10 |
| B.8 | 91100000 | 150 | 11.82 |
| C.1 | 6330000 | 70 | 4.04 |
| C.2 | 4400000 | 150 | 19.77 |
| C.3 | 68000000 | 100 | 8.96 |
| C.4 | 35100000 | 50 | 9.30 |
| C.5 | 35400000 | 70 | 10.55 |
| C.6 | 99200000 | 100 | 16.19 |
| D.1 | 402000000 | 70 | 7.23 |
| D.2 | 826000000 | 300 | 16.95 |
| D.3 | 1990000000 | 300 | 14.87 |
| D.4 | 1000000000 | 300 | 18.34 |
| D.5 | 1160000000 | 400 | 16.13 |
| D.6 | 806000000 | 400 | 19.40 |
| E.1 | 302000000 | 300 | 13.86 |
| E.2 | 990000000 | 500 | 19.04 |
| E.3 | 1200000000 | 400 | 17.13 |
| F.1 | 4010000 | 50 | 1.62 |
| F.2 | 5170000 | 50 | 2.84 |
| F.3 | 2810000 | 50 | 3.69 |
| F.4 | 3700000 | 75 | 3.62 |
| F.5 | 3460000 | 70 | 4.03 |
| F.6 | 7060000 | 50 | 3.32 |
| G.1 | 60700000 | 70 | 6.57 |
| G.2 | 82100000 | 150 | 7.78 |
| G.3 | 30500000 | 70 | 8.28 |
| G.4 | 134000000 | 100 | 15.14 |
| G.5 | 91900000 | 100 | 8.61 |
| G.6 | 372000000 | 150 | 15.88 |
| G.7 | 574000000 | 200 | 15.01 |
| Longitudinale PBMC-monsters die overeenkomen met 7 patiënten | |||
Tabel 1: Celgetal en eiwitconcentratie van PBMC-pellets van patiënten met chronische lymfatische leukemie (CLL). De gegevens in deze tabel komen overeen met 45 PBMC-monsters van 7 CLL-patiënten die deelnamen aan onderzoek NCT03328273 verzameld in mononucleaire celpreparaatbuizen. Dit zijn originele gegevens die zijn gegenereerd met behulp van monsters uit de geciteerde studie31.
Aanvullend bestand: alternatieve protocolopties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hoogwaardige preparaten van PBMC's en plasma die robuust en reproduceerbaar kunnen worden bereid op klinische proeflocaties zijn van onschatbare waarde om perifere voorspellende en farmacodynamische translationele biomarker-eindpunten van klinische studies te informeren. Hier hebben we een kort, duidelijk protocol verstrekt dat de typisch problematische stappen aanpakt die tot nu toe kwetsbaar zijn geweest voor uitvoeringsfouten in een klinische proefomgeving. Het protocol kan echter verder worden geoptimaliseerd om aan specifieke vereisten te voldoen, zoals tijdsdruk op de klinische locatie of type downstreamanalyses (zie Aanvullend dossier).
Hiertoe hebben we laten zien hoe we zowel PBMC's als plasma uit volbloed kunnen isoleren met behulp van mononucleaire celvoorbereidingsbuizen om bevroren PBMC-pellets en bevroren plasma te produceren die geschikt zijn voor een verscheidenheid aan downstreamanalyses. We hebben de aandacht gevestigd op bijzonder kritische protocolstappen met betrekking tot centrifugeren en identificatie van de PBMC-laag in stap 2.5 en PBMC-pellets in stap 3.3 en 3.6. Historisch gezien, waar klinische locaties vaak verkeerd zijn gegaan, is het instellen van de centrifuge op de juiste eenheden (het verwarren van een RCF- of x g-waarde met een RPM-waarde), het vertragen van de verwerking van bloedmonsters, de temperatuur en de aanwezigheid van grote hoeveelheden PBS boven de bevroren celkorrel. In de meeste centrifugerotors zal het ten onrechte invoeren van een x g-waarde als rpm-instelling resulteren in een aanzienlijke ondercentrifugatie met een resulterende slecht gedefinieerde of afwezige PBMC-laag, en mogelijk onbedoelde PBMC-verwijdering tijdens wasstappen als gevolg van inefficiënte celpellets. Er is echter een mogelijkheid dat een PBMC-laag niet zichtbaar is, ondanks het gebruik van de juiste centrifugeerinstellingen en rotoradapter als de patiënt leukopenie heeft ontwikkeld. Deze aandoening kan van invloed zijn op patiënten die zijn ingeschreven voor oncologische onderzoeken als gevolg van chemotherapie of bestralingstherapie en moet worden overwogen. Een ander kritiek punt dat in het protocol duidelijk is gemaakt, is dat monsters binnen 1-2 uur na de bloedafname moeten worden verwerkt om de kans op hemolyse die het protocol negatief beïnvloedt, te verminderen. Bovendien vermindert het streven om de monsters tijdens het eerste uur van de bloedafname te verwerken de ex vivo variabiliteit, wat een grote impact kan hebben op uitlezingen van farmacokinetiek en op biomarkers die worden beïnvloed door bloedconservering of actieve signaleringsroutes, zoals het geval in figuur 4. Vertragingen in de monsterverwerking kunnen ook een nadelig effect hebben op de levensvatbaarheid van cellen als cellen cryopreserved34zullen zijn. Een andere factor die zowel de opbrengst als de verontreiniging van rode bloedcellen kan beïnvloeden, is de opslag- en centrifugeertemperatuur, die bij kamertemperatuur (18-25 °C) moet worden bewaard. Lagere temperaturen verhogen de dichtheid van het dichtheidsgradiëntmedium, wat resulteert in een hogere mate van rode bloedcellen en granulocytverontreiniging, omdat deze cellen niet zo goed aggregeren. Aan de andere kant leiden hogere temperaturen ertoe dat PBMC 's vastzitten tussen geaggregeerde erytrocyten, waardoor de opbrengst van het preparaat15,27,28wordt verminderd . En ten slotte is het cruciaal dat er niet meer dan 50-100 μL vloeistof aanwezig is met de celkorrel in het cryoviaal, omdat dit een negatieve invloed heeft op de concentratie van eiwitlysaten die worden verkregen bij downstreamverwerking van deze PBMC-preparaten. Een teveel aan vloeistof zal monsters overdileren, wat leidt tot lysaten met een zeer lage eiwitconcentratie die niet geschikt zijn voor biomarkeranalyse. Bovendien zal het behoud van eventuele post-translationele wijzigingen worden aangetast en zal de efficiëntie van de lysis ook sterk worden verminderd.
Mononucleaire celpreparaatbuizen werden gekozen omdat ze de meest eenvoudige manier bieden om zowel PBMC's als plasma in één bloedafname te isoleren voor klinische proeven met, in onze ervaring, uitstekende reproduceerbaarheid. De bloedverwerking vereist geen hoogopgeleide operators en het gebruik van een enkele buis elimineert de noodzaak om het bloed en de overdracht ervan naar een andere buis te verdunnen, waardoor het risico op gevaar wordt verlaagd; verkort het protocol vanwege het uitvoeren van de centrifugeerstappen met remmen aan; en alle reagentia bevinden zich in de buis, wat de variabiliteit vermindert. Onze ervaring is dat deze voordelen opwegen tegen de hogere kosten van deze buizen in vergelijking met andere klassieke methoden die alleen het gebruik van een dichtheidsgradiëntscheidingsmedium27,28 (£ 410 per 60 eenheden, terwijl lymfoprep medium voor 66 50-ml preparaten £ 215 is). Ze zijn verkrijgbaar in twee soorten anticoagulantia, heparine en citraat, die beide vergelijkbaar zijn bij het handhaven van de functionaliteit van de geïsoleerde PBMC's35, daarom zal de keuze van het ene antistollingsmiddel boven het andere gebaseerd zijn op mogelijke invloed van heparine of citraat in de downstream biomarkerstudies. Hoewel is aangetoond dat EDTA-buizen de hoogste PBMC-isolatieopbrengst bieden in vergelijking met heparine of citraat13,is het voordeel van het gebruiksgemak van de manipulatie met één buis contrawicht voor deze overweging. Als cytokinen worden geanalyseerd, kunnen anticoagulantia een effect hebben van de in plasma gedetecteerde niveaus, daarom moeten beide anticoagulantia worden getest voordat er een wordt geselecteerd voor de klinische studie36. Als het plasma wordt gebruikt voor metabolomics studies, met behulp van heparine als antistollingsmiddel zou de voorkeurhebben 37. Daarom is het enige punt dat de eindgebruiker of de translationele wetenschapper van klinische proeven overhoudt, of citraat of heparine geschikter zal zijn voor hun doeleinden zodra de kosten zijn beoordeeld.
Hoewel de voordelen van het gebruik van celpreparaatbuizen talrijk zijn in vergelijking met de beperkingen die ze met zich meebrengen (hogere kosten en beschikbaarheid van een beperkt scala aan anticoagulantia), kan de belangrijkste beperking van het gebruik van PBMC's of plasma om PD-biomarkers te verkrijgen in klinische studies, vooral in de oncologie, geen verband houden met de isolatiemethode. Met uitzondering van hematologische kankers, waarbij de tumor rechtstreeks uit perifeer bloed wordt bemonsterd, zijn plasma en PBMC's voor andere kankerindicaties surrogaatweefsels die niet noodzakelijkerwijs de primaire tumor nabootsen. Perifeer weefsel mag het genoom en epigenoom niet delen met de primaire tumor, daarom is de perifere analyse van biomarkers afhankelijk van een specifieke tumormutatie voornamelijk beperkt tot ctDNA-analyse (uit plasma) of CTC's (door latere sortering van de PBMC-laag). Bovendien is het signaleren van cascades die de tumorproliferatie aansturen of bijdragen mogelijk niet zo actief in perifeer bloed. Deze uitdaging kan worden overwonnen door biomarker discovery benaderingen toe te passen die gericht zijn op bloed8 om alternatieve biomarkers te identificeren of ex vivo behandelingen te koppelen aan de isolatie van plasma38 en PBMC preparaten26.
In het huidige protocol kunnen bevroren PBMC-pellets gemakkelijk van de klinische site worden verwerkt om eiwitlysaten te geven die kunnen worden geëvalueerd met westerse blotting- of ELISA-technieken. Er zijn ook alternatieve methoden gepresenteerd om PBMC's te gebruiken om IHC-methoden mogelijk te maken (Aanvullend dossier). Daarnaast hebben we ook de mogelijkheid beschreven van cryopreserving PBMC's (zie Aanvullend Dossier) voor immuuncelbewaking, een relevante toepassing in de oncologie, waarbij immuuncontrolepuntremmers en ADC's steeds vaker worden getest in klinische studies. De beoordeling van immuunfuncties zoals ADCC16 en immunofenotypering zijn toepassingen die compatibel zijn met cryopreserved PBMC's geïsoleerd uit mononucleaire celpreparaatbuizen15. Er is een voorbehoud over cryopreservatie, omdat het de down-regulatie van bepaalde oppervlakte- en interne markers kan bevorderen en bepaalde celfuncties kan aantasten, maar PBMC cryopreservatie is de enige haalbare manier om deze assays uit te voeren vanwege tijdsdruk bij het verwerken van monsters van meerdere klinische locaties tot de verwerking in externe laboratoria14,15, en deze schadelijke effecten kunnen sterk worden overwonnen door goede ontdooimethoden en rustperioden39.
Concluderend kan in het hier verstrekte protocol een betrouwbare voorbereiding van PBMC's en plasmamonsters in elke klinische instelling met gemeenschappelijke apparatuur en materialen mogelijk zijn, zodat translationele eindpunten uit perifeer bloed robuust kunnen worden ingeschakeld in wereldwijde klinische proeven.
Ten slotte laten we zien hoe de analyse van PBMC-lysaten de respons op DNA-schadelijke stoffen mechanistisch kan informeren door een dosisafhankelijke post-translationele modificatie van belangrijke DDR-factoren te tonen, die kan worden gebruikt om de klinische ontwikkeling vorm te geven. Toekomstgerichte, toepassing van methoden die kwantitatiever zijn dan westerse blotting (bijv. massaspectrometrie40) en minder inputmateriaal vereisen (zoals capillaire western blotting en ELISA) zou helpen om deze preklinische resultaten te verplaatsen naar een robuustere, systematische evaluatie van PBMC-patiëntmonsters.
Disclosures
Alle auteurs zijn of waren werknemers en belanghouders van AstraZeneca. VM is een medewerker van Acerta Pharma, bezit aandelen in AstraZeneca en Gilead Sciences.
Acknowledgments
We willen alle leden van Translational Medicine van AstraZeneca Oncology Research and Early Development bedanken voor hun feedback over het protocol, met name Hedley Carr, Tammie Yeh en Nathan Standifer voor advies over plasmavoorbereiding voor ctDNA-analyse, over PBMC-isolatie en PBMC cryopreservatie en immunofenotypering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
| 15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
| 2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
| 20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
| 20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
| Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
| Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
| Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
| Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
| Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
| Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
| Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
| Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
| Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
| Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
| Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
| Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
| PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
| Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
| Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
| Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
| Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
| Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
| Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
| Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |
References
- Hoelder, S., Clarke, P. A., Workman, P. Discovery of small molecule cancer drugs: successes, challenges. and opportunities. Molecular Oncology. 6, 155-176 (2012).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 57-77 (2018).
- Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA repair in cancer: beyond PARP inhibitors. Cancer Discovery. 1, 20-37 (2017).
- Pettersson, M., Crews, C. M. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs)-Past, present and future. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 15-27 (2019).
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J.
- Thomas, A., Teicher, B. A., Hassan, R. Antibody-drug conjugates for cancer therapy. The Lancet Oncology. 17 (6), 254 (2016).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S.
- Jones, G. N., et al. pRAD50: a novel and clinically applicable pharmacodynamic biomarker of both ATM and ATR inhibition identified using mass spectrometry and immunohistochemistry. British Journal of Cancer. 119 (10), 1233-1243 (2018).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 419-431 (2014).
- Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2012).
- Olson, E. M., Lin, N. U., Krop, I. E., Winer, E. P. The ethical use of mandatory research biopsies. Nature reviews Clinical Oncology. 8, 620-625 (2011).
- O'Donnell, A., et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the oral mammalian target of rapamycin inhibitor Everolimus in patients with advanced solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1588-1595 (2008).
- Fong, P. C., et al. Inhibition of Poly(ADP-Ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. The New England Journal of Medicine. 361 (2), 123-134 (2009).
- Verschoor, C. P., Kohli, V., Balion, C. A comprehensive assessment of immunophenotyping performed in cryopreserved peripheral whole blood. Cytometry B Clinical Cytometry. 94 (5), 662-670 (2018).
- Ruitenberg, J. J., et al. VACUTAINER®CPT™ and Ficoll density gradient separation perform equivalently in maintaining the quality and function of PBMC from HIV seropositive blood samples. BMC Immunology. 7 (11), (2006).
- Yamashita, M., et al. A novel method for evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by flowcytometry using cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells. Scientific Reports. 6 (19772), 1-10 (2016).
- Schiavon, G., et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Science Translational Medicine. 7 (313), 182 (2015).
- Lee, J., et al. Tumor genomic profiling guides metastatic gastric cancer patients to targeted treatment: the VIKTORY umbrella trial. Cancer Discovery. , (2019).
- Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545, 545 (2017).
- Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
- Rossi, G., Ignatiadis, M. Promises and pitfalls of using liquid biopsy for precision medicine. Cancer Research. 79 (11), 2798-2804 (2019).
- Balasubramanian, P., et al. Isolation and characterisation of circulating tumor cells (CTCs) from peripheral blood specimens of patients with advanced solid tumor malignancies (using ApoStream® instrumentation) [abstract 3062]. Proceedings of the Annual meeting of the American Association for Cancer Research. , San Diego, CA. (2014).
- Qin, J., Alt, J. R., Hunsley, B. A., Williams, T. L., Fernando, M. R. Stabilization of circulating tumor cells in blood using a collection device with a preservative reagent. Cancer Cell International. 14 (13), 1-6 (2014).
- Biomarkers definitions working group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 69 (3), 89-95 (2001).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 472-484 (2013).
- Bundred, N., et al. Evaluation of the pharmacodynamics of the PARP inhibitor olaparib: a phase I multicentre trial in patients scheduled for elective breast cancer surgery. Investigational New Drugs. 31, 949-958 (2013).
- Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Advances in Clinical Chemistry. 92, 141-199 (2019).
- Grievink, H. W., et al. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: cell recovery and viability, population composition and cell functionality. Biopreservation and Biobanking. 14 (5), 410-415 (2016).
- Khadka, M., et al. The effect of anticoagulants, temperature, and time on the human plasma metabolome and lipidome from healthy donors as determined by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomolecules. 9 (5), 1-15 (2019).
- Hellmann, M. D., et al. Circulating tumor DNA analysis to assess risk of progression after long-term response to PD-(L)1 blockade in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (12), 2849-2858 (2020).
- ClinicalTrials.gov [Internet}. Identifier NCT03328273, A study of AZD6738 and Acalabrutinib in subjects with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL). National Library of Medicine (US). , Bethesda (MD). Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03328273 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. The impact of hemolysis on cell-free microRNA biomarkers. Frontiers in Genetics. 4 (94), 1-13 (2013).
- Blackford, A. N., Jackson, S. P. ATM, ATR, and DNA-PK: The Trinity at the Heart of the DNA Damage Response. Molecular Cell. 66, 801-817 (2017).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Basavaraj, M. G., Østerud, B., Hansen, J. B. Influence of different anticoagulants on monocyte procoagulant functions and monocyte-platelet aggregates formation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1673-1676 (2011).
- Biancotto, A., Feng, X., Langweiler, M., Young, N. S., McCoy, J. P. Effect of anticoagulants on multiplexed measurements of cytokine/chemokines in healthy subjects. Cytokine. 60, 438-446 (2012).
- Wawrzyniak, R., et al. New plasma preparation approach to enrich metabolome coverage in untargeted metabolomics: plasma protein bound hydrophobic metabolite release with proteinase K. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Duffy, D., et al. Standardized whole blood stimulation improves immunomonitoring of induced immune responses in multi-center study. Clinical Immunology. 183, 325-335 (2017).
- Wang, L., et al. Standardization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells through a resting process for clinical immunomonitoring- development of an algorithm. Cytometry A Clinical Cytometry. 89, 246-258 (2016).
- Whiteaker, J. R., et al. Targeted mass spectrometry enables robust quantification of FANCD2 mono-ubiquitination in response to DNA damage. DNA Repair. 65, 47-53 (2018).
- Lam, N. Y., Rainer, T. H., Chiu, R. W., Lo, Y. M. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis. Clinical Chemistry. 50, 256-257 (2004).
- Parpart-Li, S., et al. The effect of preservative and temperature on the analysis of circulating tumor DNA. Clinical Cancer Research. 23 (10), 2471-2477 (2017).
