Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.
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Artículo de método
Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales
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Resumen
Resumen
La microscopía intravital del intestino mediante imágenes confocales permite la observación en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales y la fuga de barreras en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal de los ratones anestesiados se tiñe tópicamente con tinción inespecífica (acriflavina) y un marcador fluorescente (dextrano rhodamine-B), montado en una placa enjuacida con solución salina e imágenes directamente con un microscopio confocal. Esta técnica puede complementar otras técnicas no invasivas para identificar fugas de permeabilidad intestinal, como el paso transmucoso de trazados administrados por vía oral. Además de esto, el enfoque presentado aquí permite la observación directa de eventos de desprendimiento de células en tiempo real. En combinación con ratones reportero fluorescentes apropiados, este enfoque es adecuado para arrojar luz en mecanismos celulares y moleculares que controlan la extrusión de células epiteliales intestinales, así como a otros procesos biológicos. En las últimas décadas, interesantes estudios con microscopía intravital han contribuido al conocimiento sobre permeabilidad endotelial, localización del intestino de las células inmunitarias, comunicación inmune-epitelial e invasión de componentes luminales, entre otros. Juntos, el protocolo presentado aquí no sólo ayudaría a aumentar la comprensión de los mecanismos que controlan la extrusión de células epiteliales, sino que también podría ser la base para el desarrollo de otros enfoques que se utilizarán como instrumentos para visualizar otros procesos celulares altamente dinámicos, incluso en otros tejidos. Entre las limitaciones técnicas, las propiedades ópticas del tejido específico, así como la tecnología de imagen seleccionada y la configuración del microscopio, a su vez, determinarían la distancia de trabajo de la imagen y la resolución de las imágenes adquiridas.
Introducción
El intestino es un órgano altamente especializado con una función estrechamente regulada que permite procesos contradictorios, a saber, nutrición y protección contra sustancias luminales nocivas. Revestimiento entre el cuerpo humano y el medio ambiente, el epitelio intestinal actúa como una barrera física e inmunológica y contribuye al mantenimiento de la homeostasis mucosa en el intestino1,2. La pérdida de integridad epitelial y el aumento de la permeabilidad de la unión estrecha es bien conocido por estar asociado con la Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)3,
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Protocolo
Las autoridades locales pertinentes de Erlangen han aprobado el siguiente protocolo (Regierung von Unterfranken, Wurzburgo, Alemania). Los ratones fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos.
NOTA: La inhibición de la prenilación mediada por GGTase dentro de los CI provoca una alteración grave de la permeabilidad intestinal en ratones Pggt1bi-CEC 24. Por lo tanto, este modelo de ratón se utilizó para demostrar cómo el protocolo puede ser útil para estudiar defectos de barrera intestinal. Sin embargo, este protocolo podría utilizarse para el estudio de cualquier otra línea de rat....
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Resultados
El protocolo presentado aquí describe un enfoque intravital basado en microscopía para visualizar fugas epiteliales intestinales y observar el rendimiento de desprendimiento celular en el intestino en tiempo real. Brevemente, los ratones son anestesiados y sometidos a preparación quirúrgica con el fin de exponer la superficie de la mucosa del intestino delgado. A continuación, los CI se tiñen mediante la aplicación tópica de acriflavina; mientras que la rhodamine luminal B-dextran se util.......
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Discusión
Aunque técnicamente desafiante, la metodología basada en microscopía intravital representa un enfoque experimental único para visualizar el proceso celular altamente dinámico en tiempo real, como el rendimiento de desprendimiento celular. Hasta ahora, no existe un enfoque experimental alternativo para visualizar la extrusión celular in vivo. Creemos que este protocolo puede contribuir a la descripción de diversos procesos celulares que juegan un papel en el mantenimiento de la homeostasis intestinal.
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Agradecimientos
La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Programa de Personas (Acciones Marie Curie) en virtud del acuerdo de subvención REA número 302170 del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (7PM/2007-2013); el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de la Universidad Erlangen-Nuremberg; el Centro de Investigación Colaborativa TRR241 y el Grupo de Investigación Clínica KFO257 del Consejo Alemán de Investigación (DFG); y el DFG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clorhidrato de acriflavina | Sigma Aldrich | A8251 | solución de 1 mg/mL en PBS |
| Almohadilla isotérmica Deltaphase | BrainTree | B-DP-PAD-Gemini | |
| BrainTree | B-GEM-5917-Ketamin | ||
| WDT | 9089.01.00 | ||
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscopio SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; solución de 2 mg/mL |
| Pinzas estándar (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23-Tijeras | |
| finas rectas | Fine Science Tools | 14060-10-Tamoxifeno | |
| Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL en etanol | |
| Xilacina | Bayer | 1320422 |
Referencias
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T.
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Reimpresiones y permisos
