Artículo de método

Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile

DOI:

10.3791/60793

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14 de febrero de 2020

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1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Molecular Biotechnology, Turkish-German University, 3Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 4Braunschweig Integrated Centre of Systems Biology, 5Helmholtz Centre for Infection Research

En este artículo

Resumen

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Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.

Resumen

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Clostridioides difficile infección (CDI) se considera una de las infecciones gastrointestinales más comunes asociadas a la atención médica en los Estados Unidos. Se ha descrito la respuesta inmune innata contra C. difficile, pero se entienden menos los roles exactos de los neutrófilos y los macrófagos en la CDI. En el estudio actual, las larvas de Danio rerio (pez cebra) se utilizan para establecer un modelo de infección por C. difficile para tomar imágenes del comportamiento y la cooperación de estas células inmunitarias innatas in vivo. Para monitorear C. difficile, se ha establecido un protocolo de etiquetado utilizando un tinte fluorescente. Una infección localizada se logra mediante microinyección etiquetada C. difficile, que crece activamente en el tracto intestinal del pez cebra e imita el daño epitelial intestinal en CDI. Sin embargo, este protocolo de infección directa es invasivo y causa heridas microscópicas, que pueden afectar los resultados experimentales. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo de microgavage más no invasivo. El método consiste en la entrega de células C. difficile directamente en el intestino de las larvas de peces cebra por intubación a través de la boca abierta. Este método de infección imita de cerca la ruta de infección natural de C. difficile.

Introducción

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C. difficile es un bacilo grampositivo, formador de esporas, anaeróbico y productor de toxinas que es la principal causa de infecciones graves en el tracto gastrointestinal1. Los síntomas típicos de la ICD incluyen diarrea, dolor abdominal y colitis pseudomembranosa fatal, y a veces puede llevar a la muerte1,2. La evidencia ha demostrado que las respuestas inmunitarias del huésped desempeñan un papel crítico tanto en la progresión como en el resultado de esta enfermedad3. Además de la respuesta inmunitaria, la microbiota intestinal autóctona es crucial p....

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Protocolo

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Todo el trabajo animal descrito aquí se realizó de acuerdo con las regulaciones legales (DIRECTIVA UE 2010/63, licencia AZ 325.1.53/56.1-TUBS y licencia AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Preparación de agarosa de baja fusión, placa de gel y agujas de microinyección/microgavage

  1. Disolver 0,08 g de agarosa de baja fusión(Tabla de materiales, agarosa A2576) en 10 ml del medio de Danieau al 30% (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, HEPES de 1,5 mM (pH a 7,2) y 17,4 mM de NaCl, almacenados a temperatura ambiente (RT) para obtener una solución del 0,8%.
    NOTA: Se pueden utilizar ....

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Resultados

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C. difficile es estrictamente anaeróbico, pero el cromóforo de las proteínas fluorescentes generalmente requiere oxígeno para madurar. Para superar este problema, se utilizó un tinte fluorescente para manchar las células vivas de C. difficile que estaban creciendo activamente (R20291, una cepa ribotipo 027; Figura 1A). Utilizando el sistema Gal4/UAS, se generaron líneas estables transgénicas de peces cebra para imágenes en vivo, en las que los promotores

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Discusión

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Los métodos presentados modifican y amplían un enfoque existente para infectar las larvas de peces cebra mediante la realización de inyección y microvaage10,14. También demuestra un enfoque para estudiar patógenos anaeróbicos con larvas de peces cebra22. Además, el protocolo facilita el análisis de las respuestas innatas de las células inmunitarias in vivo sobre el CDI y sobre la colonización de C. difficile en el pez cebra. El mé.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Estamos agradecidos a Timo Fritsch por su excelente cuidado animal. Agradecemos a los miembros de los laboratorios de Koster y Steinert el apoyo y las discusiones útiles. Agradecemos al Dr. Dandan Han por leer críticamente el manuscrito. Agradecemos la financiación del Estado Federal de Baja Sajonia, Nieders-chsisches Vorab (VWZN2889).

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarosaSigma-AldrichA2576Agarosa gelificante ultra baja
Agarosa de bajo punto de fusión (LM)Pronadisa8050Se utiliza en placas de agarosa
BacLight Tinción bacteriana rojaThermo Fisher ScientificB35001Colorante fluorescente
Caldo de infusión cerebro-corazónCarl Roth GmbHX916.1
Latón (tipo salvaje)deficiente en la síntesis de melanina, utilizada para generar líneas transgénicas estables
Nitrato de calcio (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
Vidrio capilarAparato Harvard30-0019Agujas de inyección
Clostridioides difficileR20291,, una cepa del ribotipo 027, producción de TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSOCarl Roth GmbHA994
de código abiertoFIJIProcesamiento de imágenes
HEPESCarl Roth GmbH6763
Extractor de agujas horizontalSutter instrument IncP-87
L-cisteínaSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaProcesamiento de imágenes
Sulfato de magnesio (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Microinyectoreppendorf5253000017
Moldes de microinyección Herramientasciencia adaptativaTU1
Microscopio confocal Leica SP8Leica
Phenol RedSigma-AldrichP0290
Cloruro de potasio (KCl)Carl Roth GmbH5346
Cloruro de sodio (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocolatoCarl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3línea transgénica estable en la que los promotores lyZ impulsan la expresión de la proteína fluorescente EGFP en los neutrófilos
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3línea transgénica estable en la que los mpeg1.1 impulsan la expresión de la proteína fluorescente EGFP en macrófagos
TricaineSigma-AldrichE10521
Extracto de levaduraBD Bacto212750
Plataforma de

Referencias

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  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al.

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Etiquetas

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