Corrección de alta precisión de los cambios cromáticos 3D en la era de las imágenes biológicas de superresoría utilizando Chromagnon

Resumen

La corrección de los cambios cromáticos en imágenes de microscopía de fluorescencia multicolor tridimensionales (3D) es crucial para los análisis cuantitativos de datos. Este protocolo se desarrolla para medir y corregir los cambios cromáticos en muestras biológicas a través de la adquisición de imágenes de referencia adecuadas y el procesamiento con el software de código abierto, Chromagnon.

Resumen

La microscopía cuantitativa de fluorescencia multicolor se basa en la cuidadosa coincidencia espacial de los canales de color adquiridos en diferentes longitudes de onda. Debido a la aberración cromática y la alineación imperfecta de las cámaras, las imágenes adquiridas en cada canal pueden ser desplazadas y magnificadas, así como rotadas en relación entre sí en cualquiera de las tres dimensiones. Con el método de calibración clásico, los cambios cromáticos se miden por cuentas multicolores unidas a la superficie de un cubreobjetos, y hay una serie de software disponibles para medir los cambios cromáticos de dichas muestras de calibración. Sin embargo, la aberración cromática puede variar con la profundidad, el cambio con las condiciones de observación y ser inducida por la propia muestra biológica, lo que dificulta la determinación de la verdadera cantidad de desplazamiento cromático en la muestra de interés y a través del volumen. La corrección de los cambios cromáticos con mayor precisión es particularmente relevante para la microscopía de superresor resolución, donde sólo los ligeros cambios cromáticos pueden afectar a los análisis cuantitativos y alterar la interpretación de las imágenes multicolor. Hemos desarrollado un software de código abierto Chromagnon y métodos de acompañamiento para medir y corregir los cambios cromáticos 3D en muestras biológicas. Aquí proporcionamos un protocolo de aplicación detallado que incluye requisitos especiales para la preparación de muestras, la adquisición de datos y el procesamiento de software para medir los cambios cromáticos en muestras biológicas de interés.

Introducción

La imagen multicolor es uno de los aspectos fundamentales de la microscopía de fluorescencia biológica, en los casos en que la relación espacial de diferentes moléculas o estructuras es de gran interés. La aberración cromática, una aberración óptica de la luz policromática causada por la dispersión, cambia la posición aparente de los objetos de color de interés. Del mismo modo, los microscopios equipados con múltiples cámaras dedicadas a adquirir cada color tienen cambios cromáticos más complejos debido a las diferencias en los elementos ópticos y la alineación imperfecta entre los canales. Por lo tanto, tales cambios cromáticos pueden conducir a una conclusión falsa a menos que el usuario lo corrija explícitamente. Aunque los cambios cromáticos no han sido un problema importante mientras la resolución de la microscopía esté limitada por el límite de resolución clásico, el reciente desarrollo de la microscopía de superresor resolución¹ ha provocado la necesidad de una corrección más precisa de los cambios cromáticos.

Ha sido una práctica común medir los cambios cromáticos de los sistemas de microscopio utilizando una diapositiva de calibración de perlas multicolor^2. El método de calibración basado en perlas es adecuado para medir los desplazamientos cromáticos de toda la óptica del microscopio hacia la superficie del cubreobjetos^2. Este método, sin embargo, es incapaz de medir los cambios cromáticos en las muestras biológicas de interés. Es importante tener en cuenta que muchas muestras biológicas son tridimensionales (3D), y los cambios cromáticos de tales muestras son diferentes de los que se encuentran en la superficie del cubreobjetos. Además, los cambios cromáticos cambian con las condiciones de imagen^2,,3. Hemos medido los cambios cromáticos en muestras biológicas 3D y hemos encontrado que la incertidumbre de los cambios cromáticos era a menudo hasta 350 nm por el método clásico de calibración multicolor-perla³. Por lo tanto, los cambios cromáticos deben medirse en muestras biológicas a la profundidad de interés y en las condiciones de imagen que se utilizan.

Aquí, describimos procedimientos para medir los cambios cromáticos en muestras biológicas y corregir estos cambios utilizando nuestro software, Chromagnon³. Para medir los cambios cromáticos en muestras biológicas, nuestro método utiliza dos tipos de conjuntos de datos, una imagen "objetivo" y una imagen de "referencia". La imagen "objetivo" es una imagen multicolor de interés, por ejemplo, imágenes manchadas para ADN, envolvente nuclear y microtúbulos. A menudo es imposible medir los cambios cromáticos en una imagen de este tipo. Por lo tanto, necesitamos una imagen de "referencia" que se dedique a medir los cambios cromáticos en la muestra. La única definición de una imagen de "referencia" es una imagen multicolor del mismo objeto. En este sentido, una imagen de cuentas multicolor también es un tipo de imagen de referencia. Aquí, describimos tres tipos diferentes de imagen de referencia que se utilizan para medir los cambios cromáticos en las muestras biológicas: "imágenes de referencia de habla cruzada", "imágenes de referencia de campo brillante" e "imágenes de referencia de calibración biológica". El tipo de imagen de referencia depende del tipo de microscopio utilizado o de la precisión de corrección requerida como se resume en la Tabla 1.

	Diafonía	Campo brillante	Calibración biológica (en una diapositiva diferente)	Calibración biológica (en la misma diapositiva)
Precisióna	+++	+	++b	+++
Simplicidad	++	+++	++	++
Microscopía aplicable	Campo amplio	Campo amplio	todo	todo
Disponibilidad de la alineación local	+	+	-c	-c
a: El número de "+" indica un aumento de la calificación. Una sola ventaja es de aproximadamente 50 nm y tres más es de aproximadamente 15 nm en 3D. b: La precisión depende de cuánto se mantengan constantes las condiciones de imagen variables. c: La calibración local medida por muestras de perlas multicolores se puede combinar como se describe en la sección 4 del protocolo.

Tabla 1: Parámetros al elegir el tipo de imágenes de referencia.

Las "imágenes de referencia de crosstalk" tienen la mayor precisión de corrección y son relativamente sencillas de lograr^3,4 (Tabla 1). El inconveniente es su limitación en aplicaciones de microscopía debido a su incapacidad para medir los cambios cromáticos en las trayectorias de excitación. Además, para obtener estas imágenes, el microscopio debe estar equipado con espejos dicroicos multibanda y filtros de emisión que se controlen independientemente de los filtros de excitación o fuentes de luz. La microscopía adecuada incluye microscopía convencional de campo ancho, microscopía de localización de molécula única (SMLM) como microscopía de localización fotoactivada/microscopía de reconstrucción óptica estocástica (PALM/STORM)^5,6 y microscopía de expansión⁷ observada con microscopía de campo ancho. Se adquiere una imagen de referencia de conversación cruzada desde el propio ejemplo de destino. Es una imagen de fluorescencia de crosstalk (sangrado a través) de un tinte obtenido en todos los canales requeridos. La emisión de fluorescencia siempre se expande hacia las longitudes de onda más largas, por lo tanto, los tintes con la longitud de onda de emisión más corta se excitan para obtener fluorescencia de interferencia en canales de longitudes de onda más largas. Por ejemplo, cuando la muestra se tiñe con azul, verde y rojo, solo se excita el tinte azul y la luz de emisión se obtiene en los canales azul, verde y rojo. En este protocolo, se utilizó ADN manchado con 4o,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para obtener fluorescencia de interferencia.

Las "imágenes de referencia de campo brillante" son una alternativa más fácil y menos fototóxica a las "imágenes de referencia de conversación cruzada", pero son las menos precisas³ (Tabla 1). Se trata de imágenes de campo brillantes de la muestra de destino, adquiridas en todos los canales de color utilizados en la imagen de destino.

Las "imágenes de referencia de calibración biológica" tienen la ventaja de ser aplicables a cualquier tipo de microscopía debido a su capacidad para medir los cambios cromáticos tanto en las rutas de excitación como en las rutas de emisión^3,8 (Tabla 1). La microscopía adecuada incluye microscopía de campo amplio, microscopía confocal, microscopía de láminas de luz, agotamiento de emisiones estimulada (STED)^9,microscopía de iluminación estructurada (SIM)^10,Airyscan/SORA^11,12, SMLM observado con el modo de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), Olympus super resolución (OSR)^13,etc. Una imagen de referencia de calibración biológica se adquiere a partir de una muestra de calibración preparada de forma similar a la muestra objetivo, pero con la tinción de una sola estructura con múltiples colores. La precisión de corrección sobresale la resolución de la mayoría de la microscopía de superresor resolución y la preparación de una muestra de calibración biológica puede ser relativamente simple. Otra ventaja es la disponibilidad para "promedio" de múltiples imágenes de referencia. Por lo tanto, aunque las imágenes individuales contienen poca información para la medición de los cambios cromáticos, el contenido de la información se puede aumentar promediando varias imágenes. La precisión depende de cuánto se mantengan constantes las condiciones de imagen. En este sentido, se obtiene el mejor rendimiento cuando las muestras de destino y de referencia están en la misma diapositiva, utilizando, por ejemplo, vidrios de cubierta de cámara de 8 pozos(Tabla 1, más a la derecha). En este protocolo, actin manchado con tres colores de faloide se utilizó como calibración biológica.

Una vez que se obtiene una imagen de referencia, el desplazamiento cromático es medido y corregido por nuestro software Chromagnon. No hay limitación en el número de canales, secciones Z y marcos de tiempo para los que Chromagnon puede medir y corregir los cambios cromáticos. Chromagnon mide los cambios cromáticos en dos pasos. El primer paso adquiere los parámetros de alineación "global" o "afines" de la traducción en los ejes X, Y, Z, la ampliación a lo largo de los ejes X, Y, Z y la rotación alrededor del eje Z. La precisión del cálculo de la alineación global es de 16 nm en 3D y 8 nm en 2D. El segundo paso es una "alineación local" iterativa 2D opcional en imágenes proyectadas para obtener una mayor precisión. En el proceso de alineación local, las imágenes se subdividen en varias regiones y se miden los desplazamientos cromáticos en estas regiones locales. Posteriormente, las regiones se dividen y los desplazamientos cromáticos en las subregiones se miden de forma iterativa hasta que el número de píxeles de la región alcanza el número mínimo de píxeles (normalmente 60 x 60 píxeles). El mapa de alineación local resultante se combina con el parámetro de alineación global y se aplica a la imagen de destino mediante una transformación elástica. Después de este paso, la precisión del cálculo se mejora a 14 nm en 3D y 6 nm en 2D. La alineación local no es adecuada para imágenes de referencia de calibración biológica porque la estructura biológica de la referencia es diferente de la del objetivo (Tabla 1). Por lo tanto, solo se utiliza la alineación global para las imágenes de referencia de calibración biológica.

Los cambios cromáticos locales se originan en dos fuentes; distorsión local instrumental del microscopio y la inhomogeneidad estructural biológica. Debido a que la distorsión local instrumental del microscopio es constante, esto se puede medir a partir de la muestra de referencia de cuentas multicolor y corregirse como un parámetro fijo. Chromagnon puede combinar el mapa de distorsión local instrumental del microscopio y los parámetros de alineación global de las calibraciones biológicas (Tabla 1). Usando este método, se espera que la precisión media de la calibración biológica se mejore en un adicional de 1-2 nm.

Aquí, describimos un protocolo para corregir los cambios cromáticos de las imágenes de fluorescencia 3D utilizando nuestro software Chromagnon,desde el extremo inferior más fácil hasta la más alta precisión. Utilizamos la inmunostaining de las células de HeLa como ejemplo y las observamos usando microscopía de campo ancho 3D y 3D-SIM. En la primera sección, describimos cómo preparar muestras de destino y muestras de calibración biológica. Esta parte del protocolo debe optimizarse para los objetivos específicos de la investigación. En la segunda sección, describimos los métodos de adquisición para tres tipos de imágenes de referencia por microscopios. La suposición era obtener canales azules, verdes y rojos, pero la composición del canal debía ser modificada por los objetivos específicos de la investigación y por las configuraciones del microscopio. No importa si el microscopio está equipado con una sola cámara o varias cámaras. En la tercera sección, describimos cómo se puede utilizar nuestro software para medir y corregir los cambios cromáticos de la imagen de destino mediante el uso de imágenes de referencia. Por último, en la cuarta sección, describimos un método para complementar las imágenes de referencia de calibración biológica mediante la calibración local instrumental de un microscopio.

Protocolo

1. Preparación de muestras

1. Preparación de una muestra objetivo
   1. Semilla 2,5 x 10⁵ células de HeLa en un plato de fondo de vidrio de 35 mm y cultivarlas en 2 ml de medio de crecimiento (medio de águila modificada de Dulbecco con L-glutamina y piruvato de sodio complementado con 10% de suero bovino fetal [FBS]) a 37oC y una concentración de_CO2 del 5%. Alternativamente, semilla 6 x 10⁴ células De HeLa en una cubierta de cámara de 8 pozos y crecerlas en 0,5 ml de medio de crecimiento a 37 oC y una concentración de_CO2 del 5%. Utilice #1.5 cubierta (con espesor de 0.170 mm) para microscopía de alta resolución.
      NOTA: Utilice volúmenes de 1 a 4 para la cubierta de 8 pocicos para otros pasos, excepto los pasos 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 y 1.2.5, donde el volumen es de 100 l independientemente del tipo de contenedor.
   2. Después de aproximadamente 24 horas de incubación, sustituya la solución por 2 ml de 3,7% de formaldehído en solución salina tamponada por fosfato (PBS). Después de una mezcla suave, continúe fijando las células durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) en una plataforma de rotación.
      ADVERTENCIA: Trabajar en una campana de humos.
   3. Lavar las células con 2 ml de PBS, 3 veces cada una durante 5 a 10 min en una plataforma de rotación.
      NOTA: Siga las regulaciones locales para eliminar los residuos de formaldehído.
   4. Permeabilizar las células con 2 ml de 0,1% Tritón X-100 en PBS durante 5 min en una plataforma de rotación, seguido de tres lavados con 2 ml de PBS, cada uno durante 5 x 10 min en una plataforma de rotación.
   5. Incubar células en 100 l de albúmina sérica bovina al 1% (BSA) en PBS durante 1 h en RT en una plataforma de rotación.
   6. Sustituya la solución por 100 l de una mezcla de anticuerpos primarios (anticuerpo policlonal anti-emerína¹⁴ y anticuerpo monoclonal anti-tubulina¹⁵) en 1% de BSA en PBS a diluciones apropiadas (1/500 para anti-emerin y 1/100 para la anti-tubulina), e incubar durante la noche a 4 oC.
   7. Lavar las células con 2 ml de PBS, 3x5x cada una durante 10 min en una plataforma de rotación.
   8. Sustituya la solución por 100 l de una mezcla de anticuerpos secundarios (Anti-conejo IgG con Alexa Fluor 488 y IgG antiratón con Alexa Fluor 555) en 1% BSA en PBS a 1/500 dilución, e incubar durante 3 x 4 h en RT.
   9. Lavar las células con 2 ml de PBS, 3x4x cada una durante 5 min en una plataforma de rotación.
   10. Sustituya la solución por 2 ml de DAPI de 0,5 g/ml en PBS para manchar el ADN durante 30 minutos en RT en una plataforma de rotación.
       NOTA: En lugar de DAPI, Hoechst 33342 con la misma concentración también se puede utilizar.
   11. Sustituya la solución por un medio de montaje de 100 ml(Tabla de materiales).
2. Preparación de una muestra de calibración biológica
   1. Prepare las celdas fijas como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.4.
      NOTA: Preferiblemente, las muestras se preparan en una cubierta de cámara para colocar las muestras de destino y de referencia en cámaras separadas en el mismo cubreobjetos(Tabla 1, más a la derecha). Esta preparación es preferible cuando el experimento requiere la mayor precisión de corrección. Cuando la muestra necesite prepararse en un cubreobjetos regular, utilice cubreobjetos de precisión con variación de bajo espesor ("No. 1.5H") para asegurar la reproducibilidad.
   2. Preparar la solución en stock de falhalloidina conjugada con colorante fluorescente en 1,5 ml de metanol y almacenar a -20 oC. Mezclar solución en stock de faloide en PBS en la siguiente dilución: 1/100 para faloideína con Alexa Fluor 405, 1/1,000 para faloideína con Alexa Fluor 488 y 1/200 para phalloidin con Alexa Fluor 594.
   3. Sustituya la solución por 1 ml de la mezcla de falhalloidina preparada en el paso 1.2.2 e incubar durante 30 minutos en RT en una plataforma de rotación.
   4. Lavar las células con 2 ml de PBS, 3x5x cada una durante 10 min en una plataforma de rotación.
   5. Sustituya la solución por un medio de montaje de 100 ml.
      NOTA: Las muestras de calibración se pueden almacenar a 4 oC o -20 oC para su uso repetido.

2. Adquisición de imágenes de referencia

1. Imágenes de referencia de crosstalk
   1. Coloque la muestra objetivo preparada en el paso 1.1 en un microscopio de campo ancho.
   2. Adquiera una imagen de fluorescencia del objetivo en canales azul, verde y rojo.
      NOTA: Para las imágenes 3D, el tamaño del paso Z en la imagen de referencia puede ser diferente del de la imagen de destino, siempre que el archivo de imagen contenga información para el tamaño del paso. El tamaño del paso Z para las imágenes de referencia y de destino es preferiblemente menos de la mitad de la resolución óptica del eje Z, que se calcula mediante una microscopía limitada por difracción, donde la longitud de onda en los nanómetros es la apertura numérica de la lente objetivo. NA Por ejemplo, si la resolución axial es de 550 nm, utilice un paso Z inferior a 275 nm. No se requiere ninguna serie temporal para la imagen de referencia.
   3. Posteriormente, para adquirir una imagen de fluorescencia de la referencia, seleccione la luz de excitación solo para DAPI y elija adquirir en canales azul, verde y rojo. Adquiera la imagen de referencia exactamente en la misma posición de etapa y altura Z, en el caso de una pila 3D.
      NOTA: Para longitudes de onda de emisión más largas, se requerirá una mayor intensidad de iluminación y tiempo de exposición.
2. Imágenes de referencia de campo brillante
   1. Coloque la muestra objetivo preparada en el paso 1.1 en un microscopio de campo ancho.
   2. Adquiera una imagen de fluorescencia del objetivo en canales azul, verde y rojo.
      NOTA: El tamaño del paso Z cumple preferentemente el criterio Nyquist como se describe en el paso 2.1.2.
   3. Adquiera una imagen de campo brillante del objetivo en canales azules, verdes y rojos exactamente en la misma posición del escenario que en 2.2.2 y la misma altura Z en caso de una pila 3D.
3. Imágenes de referencia de calibración biológica
   1. Coloque la muestra objetivo preparada en el paso 1.1 en un microscopio 3D-SIM.
   2. Adquiere una imagen de fluorescencia del objetivo en canales azul, verde y rojo mediante 3D-SIM. Reconstruya la imagen superconsuelta.
      NOTA: El tipo de microscopio puede ser de cualquier tipo como 3D-SIM, confocal, STED, etc. El tamaño del paso Z cumple preferentemente el criterio Nyquist como se describe en el paso 2.1.2.
   3. Adquiera múltiples imágenes de fluorescencia de la referencia preparadas en el paso 1.2 en diferentes posiciones de etapa similares a la imagen de destino (paso 2.3.2) por 3D-SIM. Reconstruye las imágenes superconsueltas.
      NOTA: El número total de píxeles en XY debe ser el mismo en todas las imágenes de referencia. El tamaño del paso en Z debe ser el mismo en todas las imágenes de referencia. Se prefiere que el número total de secciones Z sea el mismo que el de la imagen de destino, pero esto no es un requisito absoluto. La posición XY en el escenario para estas imágenes de referencia no importa porque la posición o el cubreobjetos ya es diferente de la posición de la muestra de destino y, además, la diferencia en el desplazamiento cromático en un solo cubreobjetos es inferior a 15 nm^3. Las condiciones de imagen, incluyendo lente objetiva, temperatura de observación, aceite de inmersión, tamaño del agujero en microscopía confocal, y ángulo de inclinación en la microscopía de iluminación altamente inclinada^16,deben coincidir con la referencia para el mejor rendimiento. Si el microscopio equipa varias cámaras para adquirir varios canales simultáneamente, las imágenes de referencia deben adquirirse con la frecuencia semanal para corregir la deriva instrumental.

3. Corrección del cambio cromático utilizando el software Chromagnon

1. Usando un navegador web, vaya a https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases,y descargue la versión binaria más reciente de Chromagnon.
   NOTA: Las versiones binarias están disponibles para Windows, Mac y algunas versiones de Linux.
2. Extraiga el programa y coloque el archivo ejecutable en una ubicación conveniente. En windows o Mac, haga doble clic en el archivo para abrirlo o, de lo contrario, ejecute el archivo binario desde la línea de comandos en un sistema Linux.
   NOTA: Se abrirá la interfaz gráfica de usuario como en la Figura 1. El programa puede ser impedido de abrir haciendo doble clic por primera vez debido a una razón de seguridad. En este caso, utilice el método dependiente de la plataforma para abrir el programa descargado de Internet.

Figura 1: Una captura de pantalla de la interfaz gráfica de usuario de Chromagnon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Arrastre y suelte los archivos de referencia en el "Cuadro de referencia" (Figura 1) o haga clic en Archivos de referencia ( Figura1A) para abrir un cuadro de diálogo de selector de archivos. Dependiendo de los formatos de archivo, si el programa solicita instalar un Java Development Kit (JDK), pulse yes y el usuario será navegado a la página de descarga. Descargue e instale el JDK para el sistema operativo según las instrucciones. Chromagnon debe ser capaz de leer el formato de archivo de imagen después de reiniciar el programa.
   NOTA: Chromagnon puede leer la mayoría de los formatos de archivo de imagen (multipágina 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', etc.). El formato de imagen del microscopio original se prefiere en este paso porque los metadatos se pueden perder cuando un formato de imagen se convierte en un archivo de tif de varias páginas. Si el nombre del canal se muestra como 0, 1, 2, etc. en lugar de longitudes de onda tales como 528, 609(Figura 2A, cuadros verdes), después Chromagnon no conoce la identidad de los canales en la imagen. En este caso, asegúrese de que el orden de los canales y el tamaño de píxel del archivo de referencia coincidan con los del archivo de destino. Por ejemplo, si el orden de los canales en la referencia es verde y rojo, entonces el orden de los canales en el destino también debe ser verde y rojo, pero no rojo y verde.

Figura 2: Captura de pantalla de ejemplo para cargar varios archivos. (A) Un caso en el que todas las imágenes de referencia tienen las imágenes de destino correspondientes. Los nombres de canal se identifican correctamente mediante longitudes de onda (indicadas por un cuadro verde) en los archivos de imagen utilizados en este ejemplo. (B) Un caso en el que se utiliza una sola imagen de referencia para corregir varias imágenes de destino. (C) Un caso en el que se promedian varias imágenes de referencia (indicadas por un cuadro rojo) y la imagen de referencia resultante después del promediado se utiliza para corregir varias imágenes de destino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Arrastre y suelte los archivos de destino en el "cuadro de destino" (Figura 1) o haga clic en Archivos de destino ( Figura1B) para abrir un cuadro de diálogo selector de archivos.
   NOTA: Si hay varias imágenes de destino y cada una de ellas tiene las imágenes de referencia correspondientes, la imagen de referencia correspondiente y la imagen de destino deben estar en la misma fila en los cuadros de referencia y de destino respectivos (Figura 2A). También se puede utilizar una sola imagen de referencia para alinear varias imágenes de destino(Figura 2B).
5. Marque la casilla de verificación de los márgenes de recorte si está desactivada (Figura 1C).
   NOTA: Si esta casilla está marcada, los márgenes resultantes de la alineación se recortan. Marque esta opción para uso general, pero desactive si se requiere una comparación a nivel de píxel entre imágenes antes y después de la alineación.
6. Elija un formato de imagen de salida de la lista de opciones(Figura 1D).
   NOTA: Los formatos disponibles son 'tif' (formato ImageJ^17), 'dv' y 'ome.tif'; el formato 'ome.tif' solo está disponible después de instalar JDK.
7. Especifique el sufijo para el nombre de archivo de salida(figura 1E, el valor predeterminado es '_ALN'), que se agrega al nombre de archivo de destino.
8. Para imágenes de referencia de conversación cruzada con alta relación señal-ruido, utilice la alineación local de la lista de opciones de Alineación local (Figura 1F), elija Proyección para utilizar la alineación local y Ninguno para deshabilitarla. Utilice un tamaño mínimo de ventana de 60 (Figura 1G).
   NOTA: Cuando se utiliza la alineación local, todas las imágenes de destino deben tener las imágenes de referencia correspondientes (Figura 2A). No se recomienda la alineación local para las imágenes de referencia de calibración biológica, ya que los desplazamientos cromáticos locales varían de una muestra a la otra(Tabla 1). Por la misma razón, la alineación local única no se puede aplicar a muchas imágenes de destino(Figura 2B). Como excepción, se puede utilizar cuando la muestra de interés está sólo en la superficie del cubreobjetos, y el campo de visión se llena de objetos brillantes, al igual que las muestras de perlas fluorescentes multicolor.
9. Para varias imágenes de referencia de calibración biológica, marque la opción de referencias medias (Figura 1H) para medir un único parámetro de alineación de la imagen promediada, y el parámetro de alineación única se aplica a todas las imágenes de destino (Figura 2C). Elija Ninguno para la alineación local (Figura 1F).
10. Haga clic en Ejecutar todo (Figura 1I) para iniciar las mediciones; los parámetros de alineación se aplican a las imágenes de destino.
    NOTA: Después de medir los cambios cromáticos de los archivos de referencia, el programa fabrica archivos con la extensión "chromagnon.csv" o "chromagnon.tif". El tipo de archivo de salida depende de si la alineación local está en vigor(Figura 1F). Si la alineación se realiza sin alineación local, la salida es "chromagnon.csv", mientras que si se utiliza la alineación local, la salida es "chromagnon.tif". Los nombres de archivo son los mismos que el archivo de referencia, excepto el sufijo especificado(Figura 1J, el valor predeterminado es sin sufijo) y la extensión ("chromagnon.csv" o "chromagnon.tif"). Puede encontrar una descripción detallada del proceso de alineación en el archivo "Chromagnon.log" creado en la misma carpeta.
11. Espere hasta que aparezca la imagen corregida en el visor (Figura 3).
    NOTA: Al arrastrar la imagen con el ratón se mueve la imagen y mover la rueda del ratón cambia el zoom. Mueva el control deslizante(Figura 3A) para cambiar la sección Z (y/o T cuando corresponda) para su visualización. Si el visor es demasiado lento para actualizar una imagen, haga clic en el botón Cargar datos completos en memoria ( Figura3B) para detener el acceso a los datos del disco duro. Arrastrar el borde izquierdo o derecho de los cuadros de color (Figura 3C) puede controlar los valores mínimo o máximo para su visualización. Al hacer clic en el botón de cada canal (Figura 3D) se alterna entre mostrar u ocultar el canal seleccionado en el visor. Al hacer clic con el botón derecho en el cuadro de color (Figura 3D) permite a los usuarios elegir los colores para mostrar, o cambiar las opciones de visualización de la barra de color, y también permite a los usuarios especificar los valores mínimos y máximos exactos para la escala de visualización eligiendo "escalar a ...". Al hacer clic en el botón Vista ortogonal (Figura 3E) se muestran las imágenes de las vistas ZY y XZ. Mover las líneas cruzadas cambia la posición que se mostrará en las vistas laterales.

Figura 3: Captura de pantalla del visor de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

12. Para comprobar si la medición se ha realizado correctamente, arrastre y suelte las imágenes de referencia en el "cuadro de referencia" y "cuadro de destino". Ejecute el programa y compruebe si las imágenes están perfectamente superpuestas.
    NOTA: Cuando están disponibles, los archivos "chromagnon.csv" o "chromagnon.tif" se pueden utilizar como referencias para omitir las mediciones. Si el desplazamiento cromático de la imagen sigue sin corregirse, pruebe las soluciones resumidas en la Tabla 2.
13. Para acceder a los parámetros de alineación de la muestra, o cuando los parámetros de alineación deban editarse manualmente, abra los archivos "chromagnon.csv" directamente con cualquier editor de texto o software de hoja de cálculo. Cuando se edite, guárdelo como "csv".
    NOTA: Los valores están en píxeles para "tz", "ty", "tx" y en grados para "r", y en factores de ampliación para "mz", "my" y "mx".
    1. Alternativamente, cargue un archivo "chromagnon.csv" o "chromagnon.tif" en el cuadro Referencia o Destino de Chromagnon(Figura 1)y, a continuación, haga doble clic en él para abrir el editor de alineación (Figura 4).
    2. Para ver cuánto se desplaza un canal cuando se editan los parámetros, arrastre y suelte el archivo de imagen de referencia en el área inferior (Figura 4A) para abrir la imagen en el editor. Al editar los valores de la tabla (Figura 4B) y pulsar la tecla Intro/retorno, observe cómo se mueve la imagen del canal correspondiente a medida que cambian los valores. Después de la edición, haga clic en Guardar como... (Figura 4C) para guardar los cambios.

Figura 4: Captura de pantalla de un editor de parámetros de alineación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

14. Para comprobar el mapa de alineación local, cargue el "chromagnon.tif" a través del cuadro Referencia o Destino de Chromagnon(Figura 1) y haga doble clic en él para abrir el editor de alineación (Figura 4). Haga clic en la vista (Figura 4D) para ver el desplazamiento local indicado por las líneas cuyas longitudes se magnifican por el factor especificado en la lista de opciones de ampliación (Figura 4E).
    NOTA: Al especificar el "archivo de imagen original" (Figura 4F), los turnos se asignan junto con la imagen original.

4. Generación de un mapa de alineación local específico para microscopios

1. Diluir 2 l de perlas fluorescentes multicolores de 200 nm de diámetro en 18 l de etanol.
2. Vórtice la solución y coloque 10 l de la solución de perlas en el centro de un plato de fondo de vidrio. Asegúrese de utilizar #1.5 cubierta (con espesor de 0.170 mm) para microscopía de alta resolución.
3. Deje el plato en RT durante 1 h para secar completamente.
4. Coloque el plato en un microscopio a calibrar y concéntrese en las cuentas fluorescentes.
5. Obtenga imágenes 2D o 3D con la microscopía a calibrar. Obtenga varias imágenes cambiando la posición del escenario.
6. Abra la interfaz gráfica de usuario de Chromagnon.
7. Arrastre y suelte los archivos de imagen de cordón en el "Cuadro de referencia" (Figura 1) o haga clic en Archivos de referencia ( Figura1A) para abrir un cuadro de diálogo de selector de archivos.
8. Marque la opción de las referencias medias (Figura 1H). En la lista de opciones de Alineación local (Figura 1F), elija Proyección. Utilice un tamaño mínimo de ventana de 60 (Figura 1G). Haga clic en Ejecutar todo (Figura 1I) para iniciar las mediciones.
   NOTA: Se crea un archivo ".chromagnon.tif", en el que se almacena el mapa de alineación local del microscopio.
9. Después de la medición, haga clic en Parámetros adicionales (Figura 1K). En el cuadro Distorsión local del instrumento del microscopio, haga clic en la lista de opciones y elija Nuevo... para abrir un cuadro de diálogo. Arrastre y suelte el archivo "chromagnon.tif" generado en el paso 4.8 en el cuadro de nombre de archivo o haga clic en el botón Elegir archivo para abrir un cuadro de diálogo de selector de archivos. Introduzca el nombre del microscopio y haga clic en Aceptar.
10. Al medir los desplazamientos cromáticos de imágenes de referencia de calibración biológica o de conversación cruzada, haga clic en Parámetros adicionales (Figura 1K). En la caja Distorsión local de su instrumento de microscopio, elija el nombre del microscopio especificado en el paso 4.9. Haga clic en Aceptar.
    NOTA: La elección de la "Distorsión local de su instrumento de microscopio" no se guarda después de apagar el programa.
11. Proceda a la corrección cromática sin alineación local como en la sección 3.
    NOTA: También es posible utilizar la alineación local además de la calibración del microscopio. En este caso, la alineación local comienza con la calibración del microscopio.

Resultados

Un ejemplo de corrección cromática de turnos utilizando una imagen de referencia de habla cruzada se muestra en la Figura 5. La imagen se obtuvo con un microscopio de campo ancho equipado con una sola cámara. La emisión de fluorescencia de DAPI se utilizó como referencia (Figura 5A, B) para corregir los canales azul, verde y rojo. La imagen consta de 3 canales de 60 sectores Z, cada uno compuesto de 256 x 256 píxeles. Las imágenes fueron desconvolucionadas antes de medir los cambios cromáticos. La medición de los cambios cromáticos locales con Chromagnon tomó 51 s en un Mac con Intel Core i7 (núcleo cuádruple, 8 hilos, 2,7 GHz), 16 GB de RAM y 1 TB de almacenamiento flash. El parámetro de alineación se aplicó a la imagen de destino(Figura 5C,D), que tiene exactamente el mismo número de vóxeles que la imagen de referencia. La preparación del archivo alineado tomó 3 s. Como resultado de recortar los píxeles de borde durante el proceso de alineación (casilla de verificaciónde márgenes de recorte en la figura 1C), el número de vóxeles se redujo después de la alineación(Figura 5B,51 sectores Z, 252 x 251 píxeles). El ADN en el puente antófago (indicado por puntas de flecha) se ve incorrectamente fuera de la envolvente nuclear antes de la alineación(Figura 5C, obvia en el panel inferior que muestra la vista XZ), pero como se esperaba dentro del sobre después de la alineación(Figura 5D).

Un ejemplo de corrección cromática del cambio utilizando una imagen de referencia de calibración biológica se muestra en la Figura 6. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio SIM equipado con tres cámaras. Se promediaron tres imágenes de células de HeLa teñidas con faloides conjugados con tintes azules, verdes y rojos(Figura 6A). La imagen de referencia consta de 3 canales de 76 sectores Z, cada uno compuesto de 1.024 x 1.024 píxeles. La medición de los cambios cromáticos utilizando Chromagnon sin alineación local requería 194 s en el sistema Mac descrito anteriormente. El parámetro se aplicó a una imagen de destino que consta de 3 canales de 73 sectores Z, cada uno compuesto de 1.024 x 1.024 píxeles. La generación del archivo alineado tomó 25 s. La vista XZ muestra posiciones de canal incorrectas a lo largo de la Z, y ligeramente a lo largo de las direcciones X (Figura 6A,C) pero este registro incorrecto se corrigió después de la alineación (Figura 6B,D).

Figura 5: Un ejemplo de alineación con una imagen de referencia de conversación cruzada. Las células HeLa se tiñeron con DAPI para ADN (mostrado en magenta), Alexa Fluor 488 (mostrado en amarillo) para sobre nuclear y Alexa Fluor 555 (mostrado en azul) para microtúbulos. Las imágenes fueron adquiridas por microscopía de campo ancho 3D con una sola cámara y desconvolucionadas. (A,B) Una imagen de referencia de conversación cruzada representativa utilizando la emisión DAPI, antes y después de la alineación por Chromagnon. Tres canales de color se muestran como superpuesta. (C,D) Una sección óptica de la pila 3D en tres canales antes y después de la alineación. La aberración cromática axial es obvia en el puente anafásico mostrado por las puntas de flecha. La barra de escala en el panel A indica 5 m para todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Un ejemplo de alineación con una imagen de referencia de calibración biológica Las imágenes fueron adquiridas con 3D-SIM equipado con tres cámaras. (A,B) Una imagen de referencia promediada a partir de tres imágenes antes de la alineación (A) y después (B). Las células de HeLa estaban manchadas con faloide conjugado con Alexa Fluor 405, 488 o 594. (C,D) La imagen de destino antes(C) y después de la alineación (D). Las células HeLa se teñiron con DAPI para ADN (mostrado en magenta), Alexa Fluor 488 (mostrada en amarillo) para sobre nuclear y Alexa Fluor 594 (mostrada en azul) para microtúbulos. La barra de escala en el panel A indica 5 m para todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El procedimiento de corrección cromática es un equilibrio entre precisión y esfuerzo. Para ahorrar esfuerzos ins intrépidos, es mejor saber cuánta precisión se requiere para su estudio. La mayor precisión puede no ser necesaria para las imágenes convencionales de campo ancho (en vivo) y, por lo tanto, las imágenes de referencia de campo brillante a menudo son suficientes para corregir el desplazamiento cromático. Del mismo modo, cuando la condición de imagen y el entorno son constantes, el uso repetido de una calibración biológica ahorrará tiempo. Por otro lado, si se desea un registro muy preciso, se necesitan imágenes de referencia de calibración biológica o de conversación de alta calidad. Para obtener el mejor rendimiento, las imágenes de referencia deben obtenerse con las condiciones y los tiempos más similares posibles a las imágenes de destino. Siempre y cuando las imágenes de referencia y de destino se obtengan mediante la misma microscopía, una resolución espacial más alta mejorará la precisión de la corrección. Si la desconvolución está disponible para las imágenes de referencia y de destino, implementar esto antes de la corrección puede mejorar la precisión de corrección. Además, para obtener el mejor rendimiento, el teorema de muestreo para el eje óptico (Z) debe cumplirse tanto en el archivo de referencia como en el de destino para una interpolación precisa de subpíxeles (paso 2.1.3 del protocolo).

La falta de corrección del cambio cromático conduce a conclusiones incorrectas. Además, el uso de una calibración incorrecta puede incluso empeorar los cambios cromáticos en lugar de corregirlos, por lo que es necesario evitarlos. Hemos resumido las posibles causas de los fallos y sus soluciones comunes en el Cuadro 2. Para examinar la causa de un fallo, en primer lugar, es necesario comprobar visualmente si el desplazamiento cromático en la imagen de referencia se corrige con precisión (paso 3.12 del protocolo). La mayoría de los fallos se deben a la calidad de las imágenes de referencia y se corrigen fácilmente según las descripciones del Cuadro 2. En cuanto a la calidad de las imágenes de referencia, es importante tener en cuenta que la precisión de la alineación global disminuye si todo el campo de visión no se rellena con la muestra (Figura 7, Tabla 2). En comparación con el buen ejemplo que se muestra en la Figura 7A,el mal ejemplo que se muestra en la Figura 7B contiene sólo tres sobres nucleares en la región superior izquierda, y Chromagnon no pudo alinear una parte de esta imagen. Esto se debe a que el método de alineación global de Chromagnon divide el campo de visión en cuatro regiones (Figura 7C) con el fin de medir las diferencias en rotación y ampliación con alta precisión³. Este método, si se opera correctamente, es un orden más preciso que otros métodos lineales como la transformación polar de registro y los métodos simplex³. Si alguna de las cuatro regiones no está disponible, Chromagnon cambiará a métodos lineales menos eficaces. Por lo tanto, para obtener el mejor rendimiento, los ejemplos que se muestran en la figura 7B y la figura 7C no son deseables y las cuatro regiones deben rellenarse con objetos. Los usuarios pueden comprobar si alguna región cuadrática del campo de visión no está disponible para la medición mirando el archivo de registro ("Chromagnon.log"; consulte el paso de protocolo 3.10). Afortunadamente, este problema se puede superar fácilmente promediando varias imágenes de calibración biológicas o utilizando la alineación local para imágenes de referencia de campo brillante o de conversación(Tabla 2). Contrariamente al caso de no corregir las imágenes de referencia, la falta de corrección de las imágenes de destino es más difícil de identificar. Debido a que tales errores surgen debido a diferencias en los formatos de archivo, las condiciones de creación de imágenes, los tiempos de creación de imágenes, los métodos de imagen/alineación entre las imágenes de referencia y las imágenes de destino (Tabla 2), los usuarios siempre deben tener cuidado al utilizar imágenes de referencia que se obtienen en diferentes condiciones/timings de las imágenes de destino. Algunas imágenes de ejemplo están disponibles para pruebas (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) para obtener una idea concreta de las imágenes de ejemplo buenas y malas.

Problema	Causa	Solución
No se pudo corregir la imagen de referencia	Bajo contraste	Adquiera una imagen de mayor contraste si es posible. Si se utiliza una imagen de referencia de campo brillante, vuelva a adquirir la imagen en una solución a base de agua para obtener un mayor contraste de la celda. Alternativamente, intente aplicar la reducción de ruido computacional (por ejemplo, filtrado gaussiano). Desactive la alineación local, que es más sensible al ruido.
	Contaminación de imágenes no relacionadas	Elimine el origen de las imágenes no relacionadas en la muestra si es posible. Para las imágenes de referencia de conversación cruzada, compruebe los espectros de excitación de los tintes utilizados para las imágenes de destino. Si los tintes se excitan durante la adquisición de una imagen de crosstalk (por ejemplo, Alexa Fluor 568 o 594), considere otros tintes (por ejemplo, Alexa Fluor 555). Si los polvos en el chip de la cámara crean una diferencia de canal obvia, limpie el chip de la cámara o utilice un método de campo plano computacional.
	Un punto extremadamente brillante hecho por un rayo cósmico	Vuelva a adquirir la imagen si es posible. Alternativamente, intente aplicar la reducción de ruido computacional (por ejemplo, filtrado medio o gaussiano).
	Artefactos de desconvolución (señales artificiales en los bordes axial y lateral)	Recorte los píxeles de borde o las secciones Z después de la desconvolución. Si se recorta un lado, el otro lado también debe recortarse para mantener el centro de la imagen.
	El tamaño del paso Z demasiado disperso	Se debe adquirir una pila Z para cumplir con el criterio Nyquist tal como está escrito en el protocolo 2.1.3.
	Aberración óptica	La aberración esférica es la principal aberración causada por los usuarios. Elija el objetivo adecuado para la muestra y utilice un espesor de cubreobjetos de 170 m. Si el objetivo está equipado con un anillo de corrección, ajústelo para encontrar la posición donde se obtiene el recuento de fluorescencia más alto del enfoque. En el caso de un objetivo de inmersión en aceite sin anillo de corrección, ajuste el índice de refracción del aceite de inmersión que aumenta el recuento de fluorescencia en el foco.
	El campo de visión no se rellena (Fig. 7)	En el caso de las imágenes de referencia de calibración biológica, promedia muchas imágenes. En el caso de imágenes de referencia de crosstalk o de campo brillante, utilice la alineación local.
	Un error de software no identificado	Informar del problema a través de GitHub(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
No se pudo corregir la imagen de destino	Se pierden los metadatos del archivo de imagen	Utilice el formato de archivo de microscopio original que contiene metadatos completos y evite convertir a un archivo tiff de varias páginas antes de procesar. Utilice el mismo orden de canales que se escribe en el protocolo 3.3.
	Métodos de alineación incorrectos para la microscopía dada	No aplique el método de alineación local al medir desde imágenes de referencia de calibración biológica a imágenes de destino. No utilice imágenes de referencia de conversación cruzada que no sean microscopía de campo ancho.
	Diferencias en las condiciones de imagen	Mantenga constantes las condiciones de imagen entre la referencia y las imágenes de destino tal como están escritas en el protocolo 2.3.3.
	Diferencias en la muestra (incluyendo coverslip)	Utilice siempre el mismo medio de montaje, el cubreobjeto (p. ej., no 1.5H) y una profundidad de enfoque similar.
	Deriva del microscopio desde la última vez que se realizó la calibración	Realice una calibración tantas veces como cada dos semanas. Mantenga la temperatura constante y utilice una mesa flotante para evitar la deriva de hardware del microscopio.

Tabla 2: Solución de problemas para la corrección cromática.

Figura 7: Ejemplos de imágenes de referencia. Sobre nuclear en células de levadura de fisión etiquetadas con GFP y mCherry. Las imágenes se adquirieron con microscopía convencional de campo ancho. Los cambios cromáticos se corrigieron utilizando Chromagnon sin alineación local utilizando las propias imágenes como imágenes de referencia. Las imágenes se desconvolvieron para mostrar los detalles. (A) Un buen ejemplo con muchos objetos en el campo de visión. (B) Un mal ejemplo con objetos solo en la esquina superior izquierda. La desalineación es obvia en una determinada región de la imagen. (C) Un ejemplo no deseado donde uno de los cuadrisecciones (separados por líneas cruzadas punteadas) está vacío. La barra de escala en el panel A indica 5 m para la vista de campo completa y 1,25 m para la vista ampliada y es aplicable a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este protocolo, describimos tres tipos de referencia diferentes (Tabla 1). Entre ellas, las imágenes de referencia de conversación cruzada y las imágenes de referencia de calibración biológica necesitan una discusión más cuidadosa. Para imágenes de referencia de interferencia, las muestras teñidas con DAPI o Hoechst 33342, y montadas en glicerol o medios de montaje comerciales se pueden utilizar eficientemente para alinear los canales azul, verde y rojo. Del mismo modo, Alexa Fluor 488 se puede utilizar para alinear los canales verde y rojo. Sin embargo, obtener fluorescencia de crosstalk es a menudo difícil ya que muchos tintes azules excepto DAPI y Hoechst son más tenues y decaen más rápido que la mayoría de los tintes verdes y rojos. Además, los espectros de emisión de los tintes modernos son más estrechos, lo que hace que la alineación de más de tres canales por este método sea un reto. También se debe prestar atención a algunos tintes rojos comunes (por ejemplo, Alexa Flour 568 y 594, pero no Alexa Fluor 555) que pueden ser excitados por la luz violeta, que impiden obtener imágenes cruzadas de alto contraste de tintes azules. Otro inconveniente es que este método no puede medir la aberración cromática de las trayectorias de luz de excitación en la excitación multicolor, porque sólo se utiliza una sola longitud de onda de excitación para la excitación (Tabla 1). Como la mayoría de la microscopía avanzada utiliza óptica de iluminación alterada, la aplicación de este método es limitada. Aún así, su mayor precisión de corrección es lo suficientemente ventajosa como para que se describa en este protocolo. En general, se debe tomar una imagen de conversación cruzada después de una imagen objetivo para evitar el blanqueo o los efectos fototóxicos. Para SMLM observado con el modo de campo ancho, se debe adquirir una imagen de referencia antes de adquirir una imagen de destino, ya que los tintes de fluorescencia se pueden blanquear durante la toma de imágenes.

Las imágenes de referencia de calibración biológica permiten a los usuarios alinear fácilmente cualquier número deseado de canales a costa de una preparación de muestra adicional. Otra ventaja de las imágenes de referencia de calibración biológica es la disponibilidad de múltiples referencias "promedio" que ayuda a rellenar todos los campos de visión. Este método puede sufrir diferencias en las condiciones de imagen si la muestra de calibración está preparada en una diapositiva diferente. La mayor parte de este problema se puede resolver si tanto los objetivos como las referencias se preparan en la misma diapositiva utilizando vidrios de cubierta con cámara comercial(Tabla 1),y otras condiciones de imagen se mantienen constantes como en el paso de protocolo 2.3.3. En este caso, se puede esperar una precisión de corrección similar a la de las imágenes de referencia de conversación cruzada³. El protocolo para utilizar faloideína como se muestra aquí es una de las maneras más fáciles de manchar una sola estructura celular con múltiples colores. Existen numerosos escenarios posibles para preparar muestras de calibración biológicas. Para la inmunosuchación, una muestra se puede etiquetar con un solo anticuerpo primario seguido de tinción con anticuerpos secundarios de múltiples colores. De este modo, una sola estructura de destino se puede etiquetar con varios colores. Alternativamente, 5-etilnyl-2'-deoxyuridine, detectado por "clic" etiquetas químicas recién sintetizado ADN en múltiples colores de alta densidad, como se describió en detalle anteriormente⁸. Para las células vivas, es útil preparar una cepa transgénica que contenga dos copias de un gen que se fusionan con GFP o mCherry para etiquetar la misma estructura con dos colores. Si el número de copia del gen es crítico como se observa a menudo para las proteínas de membrana, una sola copia del gen se puede fusionar en tándem con la GFP y mCherry (Figura 7). Las proteínas fluorescentes fotoconvertibles, como mEOS2^18,también se pueden utilizar iluminando un nivel moderado de luz violeta para obtener ambas especies proteicas con o sin fotoconversión. En condiciones de bajo oxígeno, GFP también se puede utilizar como una proteína fotoconvertible de verde a rojo^19,20. La elección de la muestra de calibración correcta hará que el experimento sea más robusto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de formaldehído al 16%	Polyscience	18814-10
Plato con fondo de vidrio de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A30104
Alexa Fluor 488 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 594 faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12381
Suero bovino	Thermo Fisher Scientific	16170078
Cubreobjetos	Matsunami	No. 1S HT
DAPI (4',6-Diaminino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dulbecco' s Medio Eagle modificado con L-Gln y piruvato de sodio	Nacalai Tesque	08458-16
Medio de montaje (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1000
Anticuerpo monoclonal anti-tubulina de ratón (TAT1)			Descrito en Ref 15.
Vitrina con cámara Nunc Lab-Tek II (8 pocillos)	Thermo Fisher Scientific	155409
Anticuerpo policlonal anti-emerina de conejo (ED1)			Un regalo de Hiroshi Yorifuji, Universidad de Gunma, Gunma, Japón y Kiichi Arahata, Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría, Tokio, Japón; fallecido.
Anticuerpo secundario con Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
Anticuerpo secundario con Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21424
Anticuerpo secundario con Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032
Microesferas TetraSpeck, 0,2 y micro; m	Thermo Fisher Scientific	T7280