Uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón

Resumen

Describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón.

Resumen

Los espermatozoides mamíferos adquieren capacidad de fertilización en el tracto reproductivo femenino en un proceso conocido como capacitación. Los procesos asociados a la capacitación requieren energía. Sigue habiendo un debate en curso sobre las fuentes que generan el ATP que alimenta la motilidad progresiva de los espermatozoides, la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosoma. Aquí, describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular como una herramienta para analizar los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación del esperma del ratón. Usando fluoróforos sensibles H⁺- y O_2,este método permite monitorear la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real en espermatozoides no capacitados frente a capacitantes. El uso de este ensayo en presencia de diferentes sustratos energéticos y/o activadores farmacológicos y/o inhibidores puede proporcionar información importante sobre la contribución de diferentes vías metabólicas y la intersección entre las cascadas de señalización y el metabolismo durante la capacitación de espermatozoides.

Introducción

La aplicación de la espectrometría de masas ha revolucionado el estudio del metabolismo. El perfilado metabólico dirigido y el rastreo metabolómico permiten un seguimiento preciso de los cambios en el metabolismo energético. Sin embargo, realizar metabolómicas requiere con éxito una amplia formación, personal experimentado y espectrómetros de masas caros y altamente sensibles que no están fácilmente disponibles para todos los laboratorios. En los últimos años, el uso de un analizador de flujo extracelular, como el Seahorse XFe96 se ha popularizando como método sustituto para medir los cambios en el metabolismo energético en varios tipos de células^1,<....

Protocolo

Los espermatozoides se recogen de ratones machos CD-1 de 8-16 semanas de edad. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de Weill Cornell Medicine.

1. Día antes del ensayo

1. Preparación del cartucho del sensor y calibrador del analizador de flujo extracelular
   1. Para hidratar el cartucho del sensor, retire el cartucho del sensor del kit de ensayo de flujo extracelular XFe96 y coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicios públicos.
   2. Llene un depósito de solución con 25 ml de Doble Destilado H

Resultados

Este método utiliza un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la tasa de glucólisis y oxfos durante la capacitación del esperma del ratón. La Figura 4 muestra un experimento ejemplar donde los espermatozoides fueron capacitados en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-DG y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. El sustrato de energía en el tampón de flujo extracelular TYH y los modul.......

Discusión

La pérdida de capacitación espermática en ausencia de ciertos sustratos metabólicos o enzimas metabólicas críticas reveló el metabolismo energético como un factor clave que apoya la fertilización exitosa. Un cambio metabólico durante la activación celular es un concepto bien establecido en otros tipos de células, sin embargo, estamos empezando a entender cómo los espermatozoides adaptan su metabolismo a la creciente demanda de energía durante la capacitación. Utilizando un analizador de flujo extracelular, desarrollamos .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-desoxi-D-glucosa	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; prepare una solución madre de 500 mM en DMSO (111,1 mg/ml) y almacene en pequeñas alícuotas
Antimicina A	Sigma-Aldrich	A8674	Anta; preparar una solución madre de 5 mM en DMSO (2,7 mg/ml) y almacenar en pequeñas alícuotas
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalina A, lectina de Arachis hypogaea (cacahuete)	Sigma-Aldrich	L7381
ConA Glucosa	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Salud Animal	1169567761	Isoflurano
Sulfato de magnesio	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutiriladenosina 3',5'-sal sal sódica monofosfato cíclico	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Fosfato de dihidrógeno de potasio	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenona	Cayman Chemical Company	13995	Rot; prepare una solución madre de 5 mM en DMSO (2 mg / ml) y almacene en alícuotas pequeñas
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-Cloruro
de sodio	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipo y materiales
12 canales 10-100 μ L	eppendorf	ES-12-100
pipeta de 12 canales 50-300 μ L	vwr	613-5257
37 ° C, no CO2 incubadora	VWR	1545
Tubos de cetrífugo de 5 mL Tubos de centrífuga	Eppendorf	30119380
50 mL	vwr	76211-286
Centrífuga con adaptador de placa	Thermo Scientific	IEC FL40R
Kit de disección	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Microscopio de contraste de fase invertida con objetivo 40X	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divididos	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divididos	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analizador	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	También se vende como XFe96 FluxPak mini (102601-100) con 6 cartuchos en lugar de 18.

pipeta de cónicos