Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali sulle larve dei pesci zebra

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60818
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 2,4, 2,4
1State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, 2Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, 3Shanghai Collaborative Innovation Centre for WEEE Recycling, WEEE Research Center of 10 Shanghai Polytechnic University, 4Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security

Summary

Un protocollo sperimentale dettagliato è presentato in questo documento per la valutazione della tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali utilizzando un modello di larva di pesce zebra, compreso il processo di esposizione e i test per gli indicatori neurocomportamentali.

Abstract

Negli ultimi anni sempre più inquinanti ambientali si sono dimostrati neurotossici, soprattutto nelle prime fasi di sviluppo degli organismi. Le larve di pesce zebra sono un modello preminente per lo studio neurocomportamentale degli inquinanti ambientali. In questo caso, viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per la valutazione della neurotossicità degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra, compresa la raccolta degli embrioni, il processo di esposizione, gli indicatori neurocomportamentali, il processo di prova e analisi dei dati. Inoltre, vengono discussi l'ambiente culturale, il processo di esposizione e le condizioni sperimentali per garantire il successo del test. Il protocollo è stato utilizzato nello sviluppo di farmaci psicopatici, ricerca sugli inquinanti neurotossici ambientali, e può essere ottimizzato per fare studi corrispondenti o essere utile per studi meccanicistici. Il protocollo dimostra un chiaro processo operativo per studiare gli effetti neurocomportamentali sulle larve di pesce zebra e può rivelare gli effetti di varie sostanze neurotossiche o inquinanti.

Introduction

Negli ultimi anni sempre più inquinanti ambientali si sono dimostrati neurotossici1,2,3,4. Tuttavia, la valutazione della neurotossicità in vivo dopo l'esposizione agli inquinanti ambientali non è così facile come quella della perturbazione endocrina o della tossicità dello sviluppo. Inoltre, l'esposizione precoce agli inquinanti, soprattutto a dosi rilevanti per l'ambiente, ha attirato una crescente attenzione negli studi di tossicità5,6,7,8.

Il pesce zebra viene istituito come modello animale adatto agli studi di neurotossicità durante lo sviluppo precoce dopo l'esposizione agli inquinanti ambientali. I pesci zebra sono vertebrati che si sviluppano più velocemente di altre specie dopo la fecondazione. Le larve non hanno bisogno di essere nutrite perché i nutrienti nel chorion sono sufficienti per sostenerli per 7 giorni dopo la fecondazione (dpf)9. Le larve escono dal chorion a 2 dpf e sviluppano comportamenti come il nuoto e la tornitura che possono essere osservati, tracciati, quantificati e analizzati automaticamente utilizzando strumenti di comportamento10,11,12,13 a partire da 3-4 dpf14,15,16,17,18. Inoltre, i test ad alta velocità possono essere realizzati anche da strumenti di comportamento. Pertanto, le larve di pesce zebra sono un modello eccezionale per lo studio neurocomportamentale degli inquinanti ambientali19. Qui, viene offerto un protocollo utilizzando il monitoraggio ad alta produttività per studiare la tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali sulle larve di pesce zebra sotto leggeri stimoli.

Il nostro laboratorio ha studiato la tossicità neurocomportamentale di 2,2',4,4'-tetrapemodinoil etere (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2,2',4,4'-tetra etere bromodiphenyl (6-OH/MeO-BDE-47)22, etere difenile deca-brominato (BDE-209), paraffine di piombo e clorato23 utilizzando il protocollo presentato. Molti laboratori utilizzano anche il protocollo per studiare gli effetti neurocomportamentali di altri inquinanti su larve o pesci adulti24,25,26,27. Questo protocollo neurocomportamentale è stato utilizzato per aiutare a fornire supporto meccanicistico dimostrando che l'esposizione a basse dosi al bisfenolo A e il bisfenolo sostitutivo S indotta neurogenesi ipotalamica precoce nel pesce zebra embrionale27. Inoltre, alcuni ricercatori hanno ottimizzato il protocollo per eseguire studi corrispondenti. Uno studio recente ha eliminato la tossicità della beta amiloide (A) in un modello di pesce zebra facile e ad alto throughput utilizzando nanoparticelle d'oro rivestite di caseina (Cas AuNP). Ha mostrato che - Cas AuNPs in circolazione sistemica traslocato attraverso la barriera egizia-encefalica delle larve di pesce zebra e sequestrato intracerebrale A -42, suscitando tossicità in modo non specifico, chaperone-like, che era supportato dalla patologia comportamentale28.

Locomozione, angolo di percorso e attività sociale sono tre indicatori neurocomportamentali utilizzati per studiare gli effetti della neurotossicità delle larve di pesce zebra dopo l'esposizione agli inquinanti nel protocollo presentato. La locomozione è misurata dalla distanza di nuoto delle larve e può essere danneggiata dopo l'esposizione agli inquinanti. L'angolo di percorso e l'attività sociale sono più strettamente correlati con la funzione del cervello e del sistema nervoso centrale29. L'angolo del percorso si riferisce all'angolo del percorso del movimento animale rispetto alla direzione di nuoto30. Nel sistema sono impostate otto classi d'angolo a partire da 180 gradi. Per semplificare il confronto, sei classi nel risultato finale sono definite come turni di routine (-10, 0, 0, 0, 10 dollari), curve medie (-10, 90, 10 dollari e giri reattivi (-180 gradi, 90, 90 dollari, 90 dollari), curve medie (-10, 90, 90 dollari) secondo i nostri studi precedenti21,22. L'attività sociale a due pesci è fondamentale per il comportamento di gruppo shoaling; qui una distanza di < 0,5 cm tra due larve valide è definita come contatto sociale.

Il protocollo qui presentato dimostra un chiaro processo per studiare gli effetti neurocomportamentali sulle larve di pesce zebra e fornisce un modo per rivelare gli effetti di neurotossicità di varie sostanze o inquinanti. Il protocollo andrà a beneficio dei ricercatori interessati a studiare la neurotossicità degli inquinanti ambientali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Il protocollo è conforme alle linee guida approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Tongji.

1. Raccolta di embrioni di pesce zebra

  1. Mettere due coppie di sano adulto Tubingen zebrefish nella scatola di deposizione delle uova la notte prima dell'esposizione, mantenendo il rapporto di sesso a 1:1.
  2. Rimuovere il pesce adulto al sistema 30-60 min dopo la luce del giorno la mattina successiva.
  3. Togliere gli embrioni dalla scatola di riproduzione.
  4. Sciacquare gli embrioni con acqua di sistema.
  5. Trasferire gli embrioni in una parabola di vetro Petri (9 cm di diametro) con acqua di sistema sufficiente.
  6. Osservare gli embrioni al microscopio e selezionare gli embrioni sani per un'esposizione successiva.
    NOTA: Gli embrioni sani sono solitamente trasparenti con un colore dorato chiaro al microscopio. Gli embrioni malsani sono solitamente pallidi e raggruppati insieme come osservato al microscopio.

2. Preparazione prima dell'esposizione

  1. Preparare la soluzione di Hanks's secondo le linee guida del libro di pesce zebra31.
    NOTA: la soluzione Di Hanks include 0.137 M NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, e 4.2 mM NaHCO3.
  2. Diluire la soluzione di Hanks ' alla soluzione 10% Hanks' utilizzando acqua sterile.
  3. Aggiungi 1 mL di DMSO in 999 mL di 10% soluzione Hanks per creare una soluzione di controllo del 10% di soluzione Hanks, incluso lo 0,1% DMSO.
    NOTA: i passaggi successivi utilizzano BDE-47 come esempio di soluzione di esposizione.
  4. Sciogliere 5 mg del pulito BDE-47 in 1 mL di 100% DMSO per fare una soluzione di esposizione standard di 5 mg/mL.
  5. Vorticare la soluzione 5 mg/mL per 1 min per sciogliere completamente il BDE-47 nel DMSO.
  6. Trasferire 10 l della soluzione 5 mg/mL in una bottiglia di vetro marrone da 12 ml.
  7. Aggiungere acqua sterilizzata ad un volume finale di 10 mL per rendere la concentrazione di soluzione di esposizione BDE-47 5 rapporto mg/L e DMSO allo 0,1%, quindi vortice per 1 min.
  8. Trasferire 10 e 100 l una delle soluzione da 5 mg/L rispettivamente in due flacci volumetrici da 100 ml.
  9. Aggiungere il 10% della soluzione Hanks, incluso lo 0,1% DMSO (preparato al punto 2.3) a 100 mL per effettuare le concentrazioni finali delle soluzioni di esposizione BDE-47, rispettivamente 5 g/L e 50 g/L.
  10. Trasferire le soluzioni in bottiglie di vetro marrone da 100 ml e conservarle a 4 gradi centigradi.

3. Esposizione degli embrioni

  1. Trasferire 50 embrioni in ciascuno dei tre piatti di vetro Petri (6 cm di diametro) 3-5 ore dopo la fecondazione (hpf).
  2. Utilizzare una punta pipetta da 1 mL per macchiare l'acqua del sistema intorno agli embrioni.
  3. Utilizzare una pipetta per trasferire il controllo e due soluzioni di esposizione BDE-47 (controllo, 5 g/L, 50 g/L) rispettivamente nei tre piatti di vetro Petri.
  4. Agitare i piatti di vetro Petri delicatamente uno per uno per rendere gli embrioni dispersi nella parte inferiore del piatto.
  5. Mettete i piatti di vetro Petri nell'incubatrice leggera sotto i 28,5 gradi centigradi.
  6. Rinnovare metà delle soluzioni di esposizione ogni 24 ore fino a 5 dpf.
  7. Controllare gli embrioni morti di ogni gruppo su 1 dpf e 2 dpf e calcolare il tasso di mortalità.
  8. Controllare gli embrioni incubati di ogni gruppo su 2 dpf e 3 dpf e calcolare la schiusa.
  9. Controllare la deformità delle larve ogni giorno dopo che escono dal chorion e calcolare il tasso di deformità di ogni gruppo.
    NOTA: Gli indicatori di deformità includono la cisti pericardio, la curvatura spinale, la curvatura della coda, tra gli altri fattori32.

4. Preparazione per il test di comportamento

  1. Preparare una micropiastra di 48 pozzetto per la locomozione e la prova dell'angolo di percorso e tre 6 microplacche per il test di attività sociale la mattina del 5 dpf.
  2. Trasferire 800 litri di soluzione di esposizione in ogni pozzo della microplacca 48 pozzo.
    NOTA: Utilizzare 16 pozze per ogni gruppo (ad es. la soluzione di controllo, 5 g/L e 50 gruppo g/L).
  3. Utilizzare una punta di pipetta da 1 mL per trasferire 200 l'l di soluzione di esposizione con una larva dalla piastra di vetro Petri in uno dei 48 pozzetti.
  4. Trasferire 4 mL di soluzione di esposizione in ogni pozzo della micropiastra a 6 pozzetto.
    NOTA: Utilizzare una micropiastra 6 po ' per ogni gruppo.
  5. Utilizzare una punta di pipetta da 1 mL per trasferire 200 l-L di soluzione di esposizione con due larve in ogni pozzetto della micropiastra del pozzo a 6.
    NOTA: ogni gruppo ha sei gruppi ripetuti.
  6. Prima del test, assicurarsi che la temperatura della sala prove sia di 28 h.
    NOTA: I test comportamentali vengono di solito eseguiti nel pomeriggio.

5. Test comportamentale

  1. Test dell'angolo di locomozione e percorso
    1. Fare clic sull'icona di avvio sulla scrivania del computer per aprire il software (vedere Tabella dei materiali) che controlla l'enclosure di monitoraggio ad alta velocità effettiva per avviare il programma.
    2. Scegliere il modulo "Tracking, Rotations, Path Angles" per accedere all'interfaccia operativa.
    3. Trasferire la micropiastra ben 48 preparata al punto 4.3 sulla piattaforma di registrazione e tirare giù il coperchio.
    4. Fare clic sul pulsante "File" " "Genera protocollo" a sua volta nel software per iniziare a generare un nuovo protocollo.
    5. Immettere "48" nella posizione "Numero di ubicazione" e fare clic sul pulsante "OK".
    6. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Parametri protocollo""" a sua volta nel software. Impostare la durata dell'esperimento per 1 h e 10 min e impostare il periodo di integrazione su 60 s33.
    7. Disegnare le aree rilevate.
      1. Selezionare la forma ellittica e disegnare il primo cerchio intorno al primo riquadro in alto a sinistra.
      2. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Primo-Destra "Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato in alto a destra.
      3. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Segno inferiore" "Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato in basso a destra.
      4. Fare clic sul pulsante "Costruisci" "Cancella segni" a sua volta.
        NOTA: Il sistema attirerà automaticamente ogni altro pozzo della piastra. Le aree appena create dovrebbero perfettamente adattarsi ogni bene tra il pesce reale e la sua riflessione sul lato del pozzo.
    8. Fare clic sul pulsante "Disegna scala", disegnare una linea di calibrazione sullo schermo (un percorso diagonale o parallelo al lato della microplacca), immettere la sua lunghezza e impostare l'"Unità". Quindi fare clic sul pulsante "Applica al gruppo".
    9. Impostare il colore animale su "Nero" nel software.
    10. Impostare la soglia di rilevazione a 16-18 per consentire il rilevamento degli animali.
    11. Ingresso inattivo/piccolo/grande velocità a 0,5 cm/s e 2,5 cm/s rispettivamente.
    12. Impostare le classi dell'angolo di percorso. Immettere "-90, -30, -10, 0, 10, 30 e 90" per creare classi di angolo di percorso da -180 a 180 gradi.
    13. Impostare le condizioni della luce
      1. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Guida leggera" utilizza uno dei 3 metodi diattivazione sottoil pulsante " "Stimoli avanzati" per impostare le condizioni della luce.
      2. Scegli il pulsante "Bordo", quindi imposta un periodo buio di 10 min, seguito da tre cicli di alternanza di 10 min di periodi chiari e bui.
    14. Salvare il protocollo e abbassare la luce della sala prove.
    15. Acclimatare le larve nel sistema per 10 minuti e fare clic sul pulsante "Esperimento" "Esegui" a sua volta, quindi scegliere la cartella in cui vengono salvati i file dell'esperimento e immettere il nome del risultato.
    16. Fare clic sul pulsante "Sfondo" " "Start" a turno per avviare il test.
    17. Fare clic sul pulsante "Esperimento" "Stop" a turno per interrompere l'esperimento al termine del test.
      NOTA: il sistema mostra i dati testati all'arresto del sistema. I dati includono la distanza tracciata a tre classi di velocità e i numeri di angolo del percorso in otto classi angolo di ogni minuto. Per il test di locomozione nell'esempio presentato, viene calcolata la distanza totale in ogni periodo di luce (10 min) e la differenza tra il gruppo di controllo e i gruppi di trattamento confrontati.
    18. Trasferire la micropiastra 48 pozzetto nell'incubatrice leggera per altri esperimenti.
  2. Test di attività sociale
    1. Fare clic sull'icona di avvio sulla scrivania del computer per aprire il software che controlla l'enclosure di monitoraggio ad alta velocità effettiva per avviare il programma.
    2. Scegliere il modulo "Interazioni Sociali" per accedere all'interfaccia operativa.
    3. Trasferire la micropiastra ben preparato a 6 (gruppo di controllo) nel passaggio 4.4 sulla piattaforma di registrazione e tirare giù il coperchio.
    4. Fare clic sul pulsante "File" " "Genera protocollo" a sua volta nel software per iniziare a generare un nuovo protocollo.
    5. Immettere "6" nella posizione "Conteggio posizioni" e fare clic sul pulsante "OK".
    6. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Parametri protocollo""" a sua volta nel software. Impostare la durata dell'esperimento per 1 h e 10 min e impostare il periodo di integrazione su 60 s.
    7. Disegnare le aree rilevate.
      1. Selezionare la forma ellittica e disegnare il primo cerchio intorno al primo riquadro in alto a sinistra.
      2. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Primo-Destra ""Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato nel pozzo in alto a destra.
      3. Seleziona il cerchio, fai clic sul pulsante "Copia" " "Segno inferiore" "Incolla" "Seleziona" a sua volta, e usa il mouse per trascinare il cerchio copiato in basso a destra.
      4. Fare clic sul pulsante "Costruisci" "Cancella segni" a sua volta.
        NOTA: Le aree appena create dovrebbero adattarsi perfettamente a ciascuno e tra le larve effettive e la sua riflessione sul lato del pozzo.
    8. Fare clic sul pulsante "Disegna scala", disegnare una linea di calibrazione sullo schermo (un percorso diagonale o parallelo al lato della microplacca), immettere la sua lunghezza e impostare l'"Unità". Quindi fare clic sul pulsante "Applica al gruppo".
    9. Impostare la soglia di rilevazione a 16-18 per consentire il rilevamento degli animali.
    10. Fare clic sul pulsante "Black animal" nel software.
    11. Scegliere il pulsante "Soglia distanza" e inserire "5" nel software.
    12. Impostare le condizioni della luce.
      1. Fare clic sul pulsante "Parametri" " "Guida leggera" utilizza uno dei 3 metodi diattivazione sottoil pulsante " "Stimoli avanzati" per impostare le condizioni della luce.
      2. Scegli il pulsante "Bordo", quindi imposta un periodo buio di 10 min, seguito da tre cicli di alternanza di 10 min di periodi chiari e bui.
    13. Salvare il protocollo e abbassare la luce della stanza.
    14. Acclimatare le larve nel sistema per 10 minuti e fare clic sul pulsante "Esperimento" "Esegui" a sua volta, quindi scegliere la cartella in cui vengono salvati i file dell'esperimento e immettere il nome del risultato.
    15. Fare clic sul pulsante "Sfondo" " "Start" a turno per avviare il test.
    16. Fare clic sul pulsante "Esperimento" "Stop" a sua volta per interrompere l'esperimento nel software al termine del test.
      NOTA: il sistema mostra i dati testati all'arresto del sistema.
    17. Trasferire la micropiastra 6 pozzetto (gruppo di controllo) nell'incubatrice leggera per altri esperimenti.
    18. Trasferire le 6 microplacche (5 gruppi di g/L e 50 g/L) a turno sulla piattaforma di registrazione e ripetere i passaggi da 5.2.4 a 5.2.17 per ordinale.

6. Analisi dei dati

  1. Aprire il file del foglio di calcolo nei risultati della locomozione e dell'angolo del tracciato.
  2. Selezionare le tre colonne di distanza (inadico, smldista, lardist) e sommarle.
    NOTA: i dati di inadico, smldistae lardista indicano distanze diverse registrate dal sistema in diverse classi di velocità (inattive/piccole/grandi).
  3. Per ogni periodo di luce di 10 minuti riassumere la distanza di ogni pozzo, calcolare la distanza media di 16 pozzi, e confrontare i dati dei tre gruppi sotto stimoli leggeri.
  4. Per ogni periodo di luce di 10 minuti riassumere il numero di angolo di ogni pozzo in ogni durata di luce da cl01 a cl08 a sua volta, e confrontare i dati dei tre gruppi sotto stimoli leggeri.
    NOTA: i dati delle colonne da cl01 a cl08 indicano diversi numeri di angolo di percorso registrati dal sistema rispettivamente in diversi angoli di percorso.
  5. Aprire il file del foglio di calcolo nei risultati dell'attività social.
  6. Selezionare le colonne contct e contdur, e per ogni periodo di 10 min leggero riassumere i tempi sociali e la loro durata per ogni pozzo.
  7. Calcolare i tempi sociali medi e la durata di un gruppo in ogni durata della luce e confrontare i dati dei tre gruppi sotto stimoli leggeri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Qui, descriviamo un protocollo per studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra sotto stimoli leggeri. I test di locomozione, angolo di percorso e attività sociale sono definiti nell'introduzione. Di seguito sono riportate le impostazioni delle microplacche nei test di locomozione e di angolo di percorso e le immagini del software. Inoltre, i nostri risultati della ricerca sono presentati come esempi. Due studi presentano gli effetti della locomozione e dell'angolo del percorso dopo l'esposizione a BDE-47 e 6-OH/MeO-BDE-47. Il terzo studio presenta gli effetti di quattro paraffine commerciali clorurate sul comportamento sociale.

L'impostazione della micropiastra 48 pozzo e il locus di movimento delle larve nella locomozione e test dell'angolo di percorso.
Nel protocollo sono stati utilizzati tre gruppi, tra cui un gruppo di controllo e due gruppi di trattamento. Poiché ogni gruppo può avere 16 animali, il sistema può essere utilizzato per eseguire test ad alta velocità di locomozione e angolo di percorso in una microplacca. La figura 1 mostra una larva trattata con la soluzione di controllo, una soluzione di 5 g/L e una soluzione di 50 g/L in ogni pozzo della prima, del centro e delle ultime due file, rispettivamente.

La figura 1 mostra anche tutti i loci di movimento delle larve nella locomozione e nei test dell'angolo di percorso. Il sistema ha monitorato la locomozione delle larve e calcolato la distanza di nuoto a diverse classi di velocità. Il sistema ha calcolato il numero di angolo del percorso delle larve in diverse classi di angoli di percorso. I ricercatori possono analizzare i dati registrati dal sistema a modo loro.

Figure 1
Figura 1: L'impostazione della micropiastra di pozzo 48 e i loci di movimento delle larve nella locomozione e nel test dell'angolo di percorso. A1-A8, B1-B8 - il gruppo di controllo; C1-C8, D1-D8 - il gruppo 5 g/L; E1-E8, F1-F8 - il gruppo 50g/L. La linea di tracciamento del colore nero significa inattività o piccoli movimenti; la linea di tracciamento del colore verde significa movimenti normali; e la linea di tracciamento del colore rosso significa grandi movimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il 6 pozzo micropiastra nel test di attività sociale.
La figura 2 mostra una micropiastra a 6 pozzetto nel processo di test dell'attività sociale. Ogni pozzo aveva due larve e il sistema registrava la distanza tra le due larve durante l'intero processo di test. Il sistema ha registrato i numeri di attività sociale e la durata nel tempo di prova impostato (1 min in questo protocollo).

Figure 2
Figura 2: La micropiastra ben 6 nel test di attività sociale. Ogni pozzo aveva due larve. La linea gialla indica che la distanza tra due animali è < 0,5 cm; la linea rossa significa che la distanza tra due animali è > 0,5 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'esposizione al BDE-47 ha influenzato la locomozione nelle larve di pesce zebra a 5 dpf.
Come mostrato nella Figura 3, il gruppo di concentrazione più elevato di BDE-47 ha prodotto una pronunciata ipoattività durante il periodo buio. Tuttavia, non sono stati osservati cambiamenti dovuti all'esposizione al BDE-47 durante i periodi di luce.

Figure 3
Figura 3: Effetti dell'esposizione al BDE-47 sulla locomozione del pesce zebra larvale a 5 dpf. La locomozione (distanza spostata misurata in cm) è stata registrata in periodi alternati di oscurità e luce per una durata totale di 70 min. I dati sono presentati come media : SEM(seM p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo). Questa cifra è stata modificatacon il permesso di questa cifra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'esposizione a 6-OH/MeO-BDE-47 ha influenzato gli angoli di percorso delle larve di pesce zebra a 5 dpf.
Come mostrato nella Figura 4, il gruppo ad alta concentrazione di 6-OH-BDE-47 ha eseguito meno turni di routine e giri medi a 5 dpf. Tuttavia, curve più reattive sono state indotte da gruppi di esposizione 6-MeO-BDE-47.

Figure 4
Figura 4: Effetti di 6-OH/MeO-BDE-47 sull'angolo di percorso del pesce zebra larvale durante il periodo buio. I dati sono presentati come la media : SEM(sezione p < 0,05 rispetto al controllo). Questa cifra è stata modificatacon il permesso di zhang et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'esposizione ai CP ha influenzato l'attività sociale delle larve di pesce zebra a 5 dpf.
Come mostrato nella Figura 5, i comportamenti sociali delle larve di pesce zebra sono stati influenzati da tre prodotti CP. L'attività sociale è stata stimolata dal CP-70 e dal short-chain CP-52b. La lunga catena CP-52a ha ridotto la durata per contatto delle larve.

Figure 5
Figura 5: Effetti dei CP sulla durata media sociale per contatto in diversi periodi luce/buio. (A) CP-42,(B) CP-52a, (C) CP-52b, (D) CP-70. I dati sono presentati come la media : SEM (Sezionep < 0,05 rispetto al controllo). Questa cifra è stata modificata da Yang et al.19 con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo lavoro fornisce un protocollo sperimentale dettagliato per valutare la neurotossicità degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra. Il pesce zebra passa attraverso il processo dagli embrioni alle larve durante il periodo di esposizione, il che significa che una buona cura degli embrioni e delle larve è essenziale. Tutto ciò che influenza lo sviluppo degli embrioni e delle larve può influenzare il risultato finale. Qui vengono discussi l'ambiente culturale, il processo di esposizione e le condizioni sperimentali per garantire il successo dell'intero dato.

Per l'ambiente di coltura, gli embrioni di pesce zebra e le larve vivono a una temperatura stabile di 28 gradi centigradi. In questo lavoro, un incubatore leggero che può impostare automaticamente le condizioni di luce e mantenere la temperatura stabile viene utilizzato per ospitare gli embrioni e le larve. Gli embrioni non escono dal chorion a 1 dpf e 2 dpf, quindi bisogna fare attenzione a evitare di danneggiare gli embrioni non tratteggiati quando si rinnova la soluzione di esposizione. Inoltre, il rapporto di DMSO nella soluzione dovrebbe essere inferiore allo 0,1%34,35e la soluzione di esposizione fresca dovrebbe essere a 28 gradi centigradi prima di essere utilizzata per il rinnovo.

Anche il processo di selezione degli embrioni prima dell'esposizione è un fattore chiave per il successo dell'esperimento. La scelta di embrioni sani che si sviluppano contemporaneamente per ogni gruppo garantisce l'accuratezza della valutazione della tossicità. Il pesce zebra può vivere senza cibo durante i primi 7 giorni dopo la fecondazione, quindi è meglio non nutrire gli embrioni o le larve durante l'intero periodo di esposizione perché il cibo potrebbe influenzare il risultato finale. Inoltre, è meglio preparare la soluzione di esposizione fresco quando necessario.

Durante il test di comportamento, è essenziale offrire alle larve abbastanza tempo per adattarsi all'ambiente del recinto di monitoraggio ad alta velocità. Prima del test, ogni fase del protocollo testato deve essere controllata attentamente, compresa la condizione della luce, il tempo di prova, ecc. La sala prove deve essere mantenuta completamente tranquilla e buia per non disturbare gli animali.

Il protocollo presentato offre un quadro fondamentale per studiare la tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali. Ci sono anche altri tipi di comportamenti utilizzati quando si studiano gli effetti neurocomportamentali, come i test di preferenza del colore36, test di abitazione inferiore37, test di preferenza luce / scuro38,39, ecc. Tuttavia, questi test utilizzano principalmente pesci zebra adulti, che non sono adatti per i test ad alto consumo. Inoltre, Weichert et al. ha filmato il comportamento dei movimenti spontanei della coda che potrebbero essere quantificati subito dopo 24 ore di esposizione40. La valutazione della tossicità neurocomportamentale include anche studi di meccanismo sulla funzione del cervello e del sistema nervoso centrale. Gli indicatori neurocomportamentali fondamentali sono introdotti qui e possono costituire la base per indicatori più complessi utilizzando altri strumenti di comportamento. In definitiva, lo sviluppo di nuovi indicatori neurocomportamentali accompagnati da questo meccanismo di studio può essere utilizzato in studi futuri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori sono grati per il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (21876135 e 21876136), il National Major Science and Technology Project of China (2017-X07502003-03, 2018 Laboratorio chiave per la salute ambientale dei bambini (CEH201807-5) e il Consiglio svedese della ricerca (n. 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. , John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. , Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Tags

Scienze ambientali Numero 156 effetti neurocomportamentali inquinanti ambientali larve di pesce zebra neurotossicità stimoli leggeri test di comportamento
Studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali sulle larve dei pesci zebra
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu,… More

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter