Este protocolo presenta una manera simple y coherente de regular transitoriamente un gen de interés utilizando modRNA después del infarto de miocardio en ratones.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio
En este artículo
Resumen
Resumen
El infarto de miocardio (MI) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental. En la última década, la terapia génica se ha convertido en una opción de tratamiento prometedor para las enfermedades cardíacas, debido a su eficiencia y efectos terapéuticos excepcionales. En un esfuerzo por reparar el tejido dañado después de la MI, varios estudios han empleado terapia génica viral o basada en el ADN, pero han enfrentado obstáculos considerables debido a la expresión pobre e incontrolada de los genes entregados, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. El ARNm modificado sintético (MODRNA) presenta un novedoso enfoque de terapia génica que ofrece un suministro de ARNm alto, transitorio, seguro, no nommunogénico y controlado al tejido cardíaco sin ningún riesgo de integración genómica. Debido a estas características notables combinadas con su farmacocinética en forma de campana en el corazón, modRNA se ha convertido en un enfoque atractivo para el tratamiento de enfermedades del corazón. Sin embargo, para aumentar su eficacia in vivo, es necesario seguir un método de entrega coherente y fiable. Por lo tanto, para maximizar la eficiencia de la entrega de modRNA y la consistencia del rendimiento en el uso de modRNA para aplicaciones in vivo, se presenta un método optimizado de preparación y entrega de la inyección intracardiaca modRNA en un modelo MI de ratón. Este protocolo hará que la entrega de modRNA sea más accesible para la investigación básica y traslacional.
Introducción
La terapia génica es una poderosa herramienta que implica la administración de ácidos nucleicos para el tratamiento, cura o prevención de enfermedades humanas. A pesar de los avances en los enfoques diagnósticos y terapéuticos para las enfermedades cardíacas, ha habido un éxito limitado en la administración de genes en el infarto de miocardio (MI) y la insuficiencia cardíaca (HF). Tan sencillo como parece el proceso de la terapia génica, es un enfoque marcadamente complejo teniendo en cuenta los muchos factores que deben optimizarse antes de emplear un vehículo de entrega en particular. El vector de administración correcto debe ser no inmunogénico, eficiente y estable....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina de Icahn en el Comité de Cuidado y Uso Institucional del Monte Sinaí.
1. Síntesis de modRNA
NOTA: Los detalles de la síntesis de modRNA se pueden encontrar en Kondrat et al.13.
- Pida las plantillas de plásmido(Tabla de materiales)y genere un producto PCR limpio para utilizarlo como plantilla de ARNm.
- Preparar los modRNAs por transcripción in vitro con una mezcla de ribonucleósido personalizada de la siguiente (Tabla de materiales): Kit de t....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Ratones de ocho a diez semanas de edad fueron anestesiados con isoflurano e intubados. Después de que el animal estaba bajo anestesia, la región torácica izquierda fue afeitada y esterilizada con etanol, y el corazón fue expuesto para la ligadura de LAD. La arteria coronaria izquierda se ocluyó anudando firmemente la sutura debajo de la arteria (representación del diagrama Figura 1A). Después de un infarto exitoso (indicado por el paling de la pared libre ventricular izquierda), se entregó d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La terapia génica ha demostrado un enorme potencial para avanzar significativamente en el tratamiento de la enfermedad cardíaca. Sin embargo, herramientas tradicionales empleadas en los ensayos clínicos iniciales para el tratamiento de la IC han demostrado un éxito limitado y están asociadas con efectos secundarios graves. El ARN modificado presenta un suministro de genes no virales que está ganando popularidad continuamente como herramienta de transferencia de genes en el corazón. ModRNA no requiere localización nuclear.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen a Ann Anu Kurian por su ayuda con este manuscrito. Este trabajo fue financiado por una beca de puesta en marcha de cardiología otorgada al laboratorio Zangi y también por la subvención DE NIH R01 HL142768-01
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Trifosfato de adenosina | Invitrogen AMB13345 | Incluido en el kit Megascript | |
| Fosfatasa antártica | New England Biolabs | M0289L | |
| Analógico de tapa anti-retroceso, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Sistema de imágenes bioluminiscentes | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 sistema de imágenes de dispositivo de carga acoplada |
| Retractores romos | FST | 18200-09 | |
| Tropnina cardíaca I | Abcam | 47003 | |
| Trifosfato de citidina | Invitrogen | AMB13345 | Incluido en el kit Megascript |
| Sistema de Anestesia Dual | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Pinzas- Adson | FST | 91106-12 | |
| Pinzas- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Trifosfato de guanosina | Invitrogen | AMB13345 | Incluido en el kit Megascript |
| Kit de transcripción in vitro | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| cánula de intubación Aparato | Harvard | ||
| Megaclear | Life Technologies | ||
| Ventilador de ratón | Aparato Harvard | 73-4279 | |
| N1-metilpseudouridina-5-trifosfato | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| Espectrómetro NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar portaagujas con tijeras de sutura | FST | 12002-12 | |
| Plantillas de plásmidos | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Tijeras de disección de punta afilada | FST | 14200-12 | |
| Microscopio estereoscópico | Zeiss | ||
| Suturas | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Suturas | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Suturas | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 Enzima DNasa | Invitrogen AMB13345 | Incluido en el kit Megascript | |
| Estación | de cintaAligent | 4200 | |
| Kit de limpieza de transcripción | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 filtros centrífugos 10k | Amicon | UFC801096 |
Referencias
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
