Artículo de método

Fabricación de la interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI) en la rata adulta

DOI:

10.3791/60841

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25 de febrero de 2020

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1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

En este artículo

Resumen

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El siguiente manuscrito describe un método novedoso para desarrollar un sistema de retroalimentación neuronal biológico de bucle cerrado llamado la interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI). Esta construcción tiene la capacidad de integrarse con los nervios periféricos para amplificar las señales motoras eferentes mientras que al mismo tiempo proporciona una retroalimentación sensorial aferente.

Resumen

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Los recientes avances en neuroprótesis han permitido a quienes viven con pérdida de extremidades reproducir muchas funciones nativas de la extremidad ausente, y esto a menudo se logra a través de la integración con el sistema nervioso periférico. Desafortunadamente, los métodos actualmente empleados se asocian a menudo con daños importantes en los tejidos que impiden el uso prolongado. Además, estos dispositivos a menudo carecen de cualquier grado significativo de retroalimentación sensorial, ya que su construcción compleja amortigua cualquier vibración u otras sensaciones de las que un usuario pueda haber dependido anteriormente al usar prótesis más simples. La interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI) fue desarrollada como una construcción biológica estable con la capacidad de amplificar las señales nerviosas del motor eferente mientras proporciona retroalimentación sensorial aferente simultánea. El C-RPNI consiste en un segmento de injerto dérmico y muscular libre asegurado alrededor de un nervio sensorimotor mixto objetivo, con reinnervación del nervio motor preferencial del injerto muscular y reinnervación del nervio sensorial del injerto dérmico. En ratas, esta construcción ha demostrado la generación de potencial estridebidos de acción muscular compuesta (CMAP), amplificando la señal del nervio objetivo desde el nivel de micro a mil voltios, con relaciones señal-ruido promediando aproximadamente 30-50. La estimulación del componente dérmico de la construcción genera potenciales de acción nerviosa sensorial compuesta (CSP) en el nervio proximal. Como tal, esta construcción tiene una utilidad futura prometedora para la realización de la prótesis ideal e intuitiva.

Introducción

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Las amputaciones de extremidades afectan a casi 1 de cada 190 estadounidenses1, y se prevé que su prevalencia aumente de 1,6 millones hoy a más de 3,6 millones para 20502. A pesar del uso documentado durante más de un milenio, la prótesis ideal aún no se ha realizado3. Actualmente existen prótesis complejas capaces de múltiples manipulaciones articulares con el potencial de reproducir muchas funciones motoras de la extremidad nativa4,5. Sin embargo, estos dispositivos no se consideran intuitivos, ya que el movimiento protésico deseado suele estar separado funcionalmente de la señal de control de entrada. Los usuarios suelen considerar estas "prótesis avanzadas" difíciles de aprender y por lo tanto no son adecuados para el uso diario1,6. Además, las prótesis complejas actualmente en el mercado no proporcionan ningún grado apreciable de retroalimentación sensorial sutil para un control adecuado. El sentido del tacto y la propriocepción son vitales para llevar a cabo las tareas diarias, y sin éstas, actos simples como recoger una taza de café se vuelven gravosos ya que se basa enteramente en señales visuales7,8,9. Por estas razones, prótesis avanzadas se asocian con un grado significativo de fatiga mental y a menudo se describen como gravosas e insatisfactorias5,10,11. Para hacer frente a esto, algunos laboratorios de investigación han desarrollado prótesis capaces de proporcionar un grado limitado de retroalimentación sensorial a través de la interacción neuronal directa12,13,14,15, pero la retroalimentación a menudo se limita a pequeñas áreas dispersas en las manos y los dedos12,13, y las sensaciones se notaron para ser dolorosas y antinaturales a veces15. Muchos de estos estudios desafortunadamente carecen de cualquier seguimiento apreciable a largo plazo y histología nerviosa para delinear los efectos del tejido local, mientras que la observación de fallo de la interfaz en la escala de semanas a meses16.

Para esta población, el dispositivo protésico ideal proporcionaría un control motor de alta fidelidad junto con una retroalimentación somatosensorial significativa del entorno del individuo a lo largo de su vida útil. Crítico para el diseño de dicha prótesis ideal es el desarrollo de una interfaz estable y confiable que permita la transmisión simultánea de información somatosensorial aferente con señales motoras eferentes. Las interfaces hombre-máquina más prometedoras son las que interactúan directamente con el sistema nervioso periférico, y los recientes desarrollos en el campo de las prótesis neurointegradas han trabajado para salvar la brecha entre las señales bioeléctricas y mecánicas17. Las interfaces actuales utilizadas incluyen: placas nerviosas flexibles14,15,18, electrodos de manguito extraneurales13,19,20,21,22,23, electrodos penetrantes de tejido24,25,31,32,y electrodos intrafasciculares26,27 ,28. Sin embargo, cada uno de estos métodos ha demostrado limitaciones con respecto a la especificidad nerviosa, lesión tisular, degeneración axonal, agotamiento de mielina y/o formación de tejido cicatricial asociado con la respuesta crónica del cuerpo extraño residente16,17,18,19. Más recientemente, se ha postulado que un conductor detrás de una eventual falla de electrodo implantado es la diferencia significativa en los módulos de Young entre el material electrónico y el tejido neural nativo. El tejido cerebral está sujeto a una micromoción significativa a diario, y se ha teorizado que el estrés de cizallamiento inducido por las diferencias en los módulos de Young causa inflamación y cicatrices permanentes eventuales30,31,32. Este efecto a menudo se compone en las extremidades, donde los nervios periféricos están sujetos a micromoción fisiológica y macromoción intencional de las extremidades. Debido a este movimiento constante, es razonable concluir que la utilización de una interfaz de nervio periférico completamente abiótico no es ideal, y una interfaz con un componente biológico sería más adecuada.

Para hacer frente a esta necesidad de un componente biológico, nuestro laboratorio desarrolló una interfaz nerviosa biótica conlanada interfaz nerviosa periférica regenerativa (RPNI) para integrar los nervios periféricos transectos en una extremidad residual con un dispositivo protésico. La fabricación de RPNI consiste en implantar quirúrgicamente un nervio periférico en un injerto muscular libre autólogo, que posteriormente revasculariza y reinnerva. Nuestro laboratorio ha desarrollado esta interfaz nerviosa biológica en la última década, con éxito en la amplificación y transmisión de señales motoras cuando se combina con electrodos implantados en ensayos tanto animales como humanos, permitiendo un control protésico adecuado con múltiples grados de libertad2,34. Además, hemos demostrado por separado la retroalimentación sensorial mediante el uso de nervios periféricos incrustados en injertos dérmicos, llamados La Interfaz Sensorial Dérmica (DSI)3,35. En las amputaciones más distales, el uso de estas construcciones simultáneamente es factible ya que los fascículos motores y sensoriales dentro del nervio periférico objetivo se pueden separar quirúrgicamente. Sin embargo, para las amputaciones de nivel más proximal, esto no es factible debido a la mezcla de fibras motoras y sensoriales. La interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI) fue desarrollada para amputaciones más proximales, e implica la implantación de un nervio sensorimotor mixto en una construcción que consiste en injerto muscular libre asegurado a un segmento de injerto dérmico(Figura 1). Los nervios periféricos demuestran una reinnervación dirigida preferencial, por lo que las fibras sensoriales reinertan el injerto dérmico y las fibras motoras, el injerto muscular. Esta construcción tiene así la capacidad de amplificar simultáneamente las señales del motor mientras que proporciona retroalimentación somatosensorial36 (Figura 2), lo que permite la realización de la prótesis ideal, intuitiva, compleja.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales se realizan bajo la aprobación del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan.

NOTA: Las ratas donantes tienen acceso gratuito a alimentos y agua antes de los procedimientos de donación de la piel y los músculos. La eutanasia se realiza bajo anestesia profunda seguida de inyección intracardiaca de cloruro de potasio con un método secundario de neumotórax bilateral. Cualquier cepa de rata se puede utilizar teóricamente con este experimento; sin embargo, nuestro laboratorio ha logrado resultados consistentes tanto en ratas Fischer F344 machos como hembras (200-250 g) a los dos o cuatro meses de edad. Las ratas donantes deben ser isogénicas para las ratas experimentales.

1. Preparación del injerto dérmico

  1. Anestetizar rata donante en una cámara de inducción utilizando una solución de 5% de isoflurano en oxígeno a 0.8-1 L/min. Una vez anestesiada la rata, retirar de la cámara de inducción y colocar la nariz de respiración, reduciendo el isoflurano a 2-2,5% para el mantenimiento de la anestesia.
  2. Administrar una solución de 0,02-0,03 ml de carprofeno (50 mg/ml) en 0,2 ml de solución salina estéril subcutánea entre los omóplatos para la analgesia.
  3. Aplica un unción de lágrimas artificiales en ambos ojos para prevenir las úlceras corneales.
  4. Con las pinzas, asemete toda la(s) extremidades posteriores inferiores, la región del tobillo y los lados de las patas.
  5. Limpiar la extremidad posterior elegida y la superficie plantar de la pata con alcohol, seguido de la solución de yodopovidona, terminando con una limpieza final con alcohol para eliminar la iodopovidona residual.
  6. Usando un taladro de alta velocidad micromotor de mano con una piedra de pulido de grano fino redonda extraíble (4000 rpm), rebaba la superficie plantar de la pata para eliminar la epidermis. Durante el enredo, aplicar goteos de salina para no quemar la piel. La dermis subyacente tendrá un aspecto brillante con sangrado preciso.
  7. Aplique un torniquete en la extremidad inferior para disminuir el flujo sanguíneo.
  8. Retire la piel plantar bruscamente con un bisturí #15 y colóquela en gasa húmeda con salina para evitar la desecación. Algunos tejidos tendinosos y conectivos se extirparán intrínsecamente con la piel en este paso y se extraerán más adelante.
  9. Aplique una envoltura de gasa en el pie sangrante para reducir la hemorragia. Repita los pasos 1.5-1.9 si realiza dos construcciones.
  10. Bajo un microscopio (aumento de 20x), retire el tejido tendinoso y conectivo de la capa profunda del injerto de piel utilizando microtijeras. Tenga cuidado de no hacer agujeros en el injerto. El injerto dérmico adelgazado debe ser ligeramente opaco que contenga sólo dermis, midiendo aproximadamente 0,5 cm x 1,0 cm de tamaño.
  11. Colocar en gasa húmeda por salina hasta que esté lista para la fabricación de la construcción C-RPNI. Los injertos deben utilizarse dentro de las 2 horas posteriores a la cosecha.

2. Preparación del injerto muscular

  1. Haga una incisión longitudinal a lo largo del aspecto anterior de la extremidad posterior inferior desde justo por encima del tobillo hasta justo debajo de la rodilla con un escalpelo #15. Diseccionar a través del tejido subcutáneo para exponer la musculatura subyacente.
  2. En el aspecto distal de la incisión, exponga las inserciones tendinosas de la musculatura de la extremidad inferior. Tibialis anterior (TA) es típicamente el más grande y más anterior de los músculos, y justo debajo y posterior a este músculo se encuentra el digitorum longus extensor (EDL). Aísle el tendón disal de EDL de los otros tendones de la zona, teniendo cuidado de no incisar su inserción en este punto.
  3. Asegurar el aislamiento del tendón correcto insertando ambos dientes de un fórceps debajo del tendón y ejerciendo presión ascendente abriendo los fórceps para causar la excursión del tendón. La manipulación de este tendón debe hacer que todos los dedos de los dedos se extiendan simultáneamente.
  4. Realizar una tenotomía distal con tijeras de iris afiladas y separar el músculo de los tejidos circundantes sin rodeos con tenotomías (u otras tijeras con punta sin rodeos) trabajando proximalmente para encontrar el origen tendinoso.
  5. Una vez visualizado el tendón proximal, vuelva a realizar una tenotomía utilizando tijeras de iris afiladas. Coloque el injerto muscular en una gasa humedecida con salina para evitar la desecación.
  6. Una vez que todos los injertos deseados han sido retirados de una rata donante, eutanasia principalmente por inyección intra-cardiaca de KCl (1-2 mEq K+/kg) seguida de eutanasia secundaria con pneumotórax punmotórax bilateral con una cuchilla #15.

3. Aislamiento y preparación del nervio peroneo común

  1. Anestesiar y proporcionar analgesia a la rata experimental de acuerdo con el protocolo descrito en los pasos 1.1-1.3.
  2. Afeitar el muslo deseado y limpiar con alcohol, betadina, terminando con alcohol para eliminar los rastros de betadina.
  3. Mueva al animal de la mesa de preparación quirúrgica a la mesa del microscopio quirúrgico y colóquelo en la almohadilla de calentamiento con sonda de temperatura para el mantenimiento de la temperatura corporal. Mantener el isoflurano al 2-2.5% y oxígeno a 0.8-1 L/min.
  4. Marque la incisión, extendiéndose de una muesca distal a una muesca ciática a la parte inferior de la rodilla. Esta marca debe ser inferior al fémur y alejarse de él. Haga la incisión con una cuchilla #15 incising a través del bíceps subyacente femoris fascia.
  5. Disecciona cuidadosamente a través del músculo del bíceps femoris con una microtijeras hemostadas o de punta contundente al espacio subyacente al bíceps femoris.
    NOTA: El nervio ciático viaja aproximadamente en la misma dirección que la incisión inicial que se hizo. Hay tres ramas, típicamente con nervio sural posterior y nervio peroneo común y nervio tibial viajando superficial y profundo hasta la rodilla, respectivamente.
  6. Después de la identificación del nervio peroneal común (CP), utilizando un par de fórceps micro, de punta fina y microtijeras, aislar cuidadosamente el nervio CP de las otras ramas ciáticas y eliminar cualquier tejido conectivo persistente distalmente.
  7. En el punto donde el nervio cruza la superficie de la rodilla, transpira bruscamente el nervio con un par de microtijeras.
    NOTA: El uso de tijeras afiladas es extremadamente importante en este paso, ya que causar un trauma significativo en el nervio podría aumentar el riesgo de formación de neuroma.
  8. Libere cuidadosamente cualquier tejido conectivo restante del nervio CP y trabaje proximalmente para liberar el nervio a una longitud de aproximadamente 2 cm.

4. Fabricación de construcción C-RPNI

  1. Retire el injerto muscular de la gasa humedecida salina y retire todo el tejido tendinoso central, así como un pequeño segmento central de epimisio. Deje intactos los extremos tendinosos.
  2. Uso de un 8-0 sutura de nylon, asegurar el epineumrium del extremo transecto del nervio CP a la zona del injerto muscular desprovisto de epimisio con dos puntos de sutura interrumpida a cada lado del nervio.
  3. Asegure el injerto muscular al periosteum del fémur con una sola puntada interrumpida de nylon 6-0 tanto proximalmente como diselectrónicamente con la unión nervio-músculo mirando lejos del fémur.
    NOTA: Asegure el músculo de modo que esté a una longitud relajada normal. Trate de no estirar el músculo significativamente o dejar demasiada laxitud al asegurar.
  4. Coloque un 8-0 punto de nylon en el margen inferior y central del epimisio del injerto muscular, asegurándolo al epineumrium nervioso CP de una manera que crea laxitud en el nervio dentro del injerto muscular y ayuda a aliviar cualquier tensión futura a la que pueda estar expuesto con la ambulación posterior.
  5. Retire el injerto de piel de la gasa humedecida con salina y colóquelo en el injerto muscular de tal manera que cubra completamente el nervio y la mayor parte del músculo. Asegúrese de que el margen profundo de la dermis está descansando sobre el músculo. Recortar cualquier dermis que se extiende más allá del borde del músculo.
  6. Asegure el injerto de piel al injerto muscular circunferencialmente usando 8-0 suturas interrumpidas de nylon. Típicamente, 4-8 suturas totales se utilizan dependiendo del tamaño de la construcción.
  7. Cierre el bíceps femoris fascia sobre la construcción de una manera de correr con 5-0 sutura cromática.
  8. Cierra la piel superpuesta con una sutura cromática 4-0 de moda.
  9. Swab el área quirúrgica con una almohadilla de alcohol y aplicar un unción antibiótica.
  10. Cese el anestésico inhalatoccional y permita que la rata se recupere con fuentes de alimentos y agua separadas de las compañeras de jaula.

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Resultados

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La fabricación de la construcción se considera infructuosa si las ratas desarrollan una infección o no sobreviven a la anestesia quirúrgica. Investigaciones anteriores han indicado que estas construcciones requieren aproximadamente tres meses para revascularizar y reinnervate2,3,17,36. Después del período de recuperación de tres meses, se pueden realizar pruebas...

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Discusión

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El C-RPNI es una construcción novedosa que proporciona amplificación simultánea de las señales eferentes motoras de un nervio objetivo con el suministro de retroalimentación sensorial aferente. En particular, el C-RPNI tiene una utilidad única para aquellos que viven con amputaciones proximales, ya que sus fascículos motores y sensoriales no se pueden separar mecánicamente fácilmente durante la cirugía. En su lugar, el C-RPNI utiliza las propiedades inherentes de reinnervación preferencial del nervio mismo para estimular...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen revelaciones.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Jana Moon por la asistencia técnica experta. Los estudios presentados en este documento fueron financiados a través de una subvención R21 (R21NS104584) a SK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#15 ScalpelAspen Surgical, IncRef 371115Cuchillas quirúrgicas de acero al carbono con respaldo acanalado (#15)
4-0 Sutura crómicaEthicon SKU# 1654GP-3 Aguja de corte inverso
5-0 Sutura crómicaEthicon SKU# 687GP-3 Aguja de corte inverso
6-0 Sutura EthilonEthicon SKU# 697GP-1 Aguja de corte inverso (sutura de nylon)
8-0 Sutura monofilamentoAROSurgialT06A08N14-13Sutura monofilamento de poliamida negra en aguja cónica roscada
Ratas experimentalesEnvigoF344-NH-sdLas ratas son Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorane)VetOne13985-528-40anestésico inhalatorio
con piedraMaestro mecánicomodelo 151369Herramienta rotativa de mano; El kit viene con múltiples piedras de grano fino
OxígenoGases criogénicosUN1072Bombonas de oxígeno estándar de grado médico
Cloruro de potasioAPP Pharmaceuticals63323-965-20Forma inyectable, 2 mEq/mL
Povidona Yodada USPMediChoice65517-0009-1Solución tópica al 10%, puede usar una botella para múltiples preparaciones quirúrgicas
Puralube Vet Ungüento OftalmicoDechra17033-211-38Pomada protectora corneal para usar durante el procedimiento
Rimadyl (Caprofen)Zoetis, Inc.NADA# 141-199Forma inyectable, 50 mg/mL
Microscopio estereoscópicoLeicamodelo M60El usuario puede ajustar el aumento a su preferencia
Instrumentos quirúrgicosHerramientas de ciencia finaVariosEl usuario puede elegir instrumentos de acuerdo con sus preferencias personales o de lo que está disponible actualmente en su laboratorio
Pomada antibiótica tripleMediChoice39892-0830-2El ungüento viene en paquetes estériles y desechables
VaporStick 3SurgivetV7015Torre de anestesia con espacio para bidón de isofluorano y oxígeno
Webcol Alcohol PrepCovidenRef 6818Toallitas de preparación con alcohol; use una toallita nueva para cada preparación
Taladro de alta velocidad con motor de micromotor

Referencias

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