El objetivo de este artículo es describir un método refinado de intubación del ratón de laboratorio. El método no es invasivo y, por lo tanto, ideal para estudios que requieren monitorización en serie de la función respiratoria y/o inscripción de tratamientos en el pulmón.
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Artículo de método
Intubación orotraqueal repetida en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La literatura describe varios métodos para la intubación del ratón que requieren la visualización de la glotis a través de la cavidad oral o la incisión en el cuello ventral para la confirmación directa de la colocación de cánulas en la tráquea. La dificultad relativa o el trauma tisular inducido al sujeto por tales procedimientos puede ser un impedimento para la capacidad de un investigador para realizar estudios longitudinales. Este artículo ilustra una técnica en la que la manipulación física del ratón después del uso de un depilatorio para eliminar el vello del cuello ventral permite la visualización transcutánea de la tráquea para la intubación orotraqueal independientemente del grado de piel Pigmentación. Este método es inocuo para el sujeto y se logra fácilmente con una comprensión limitada de la anatomía murina. Este enfoque refinado facilita la intubación repetida, que puede ser necesaria para controlar la progresión de la enfermedad o la instilación de los tratamientos. El uso de este método puede resultar en una reducción del número de animales y la habilidad técnica necesaria para medir la función pulmonar en modelos de ratón de enfermedad respiratoria.
Introducción
El ratón de laboratorio es un modelo animal común para las enfermedades respiratorias humanas. Por lo tanto, existen varios métodos publicados para la intubación de ratones con el fin tanto de instanición de tratamientos y medición de la mecánica respiratoria. La mayoría de los procedimientos descritos requieren la visualización de la glotis a través de la cavidad oral con equipos especializados como un laringoscopio o fuente de luz de fibra óptica1,2,3,4,5,6,7. Sin embargo, esto puede ser difícil cuando se requiere una cánula relativamente grande, ya que puede oscurecer la visión del investigador. 8 han abordado esta preocupación con un método de intubación en el que se realiza una pequeña incisión cutánea a lo largo de la línea media del cuello ventral que permite la visualización de la tráquea. Después del procedimiento, la incisión se cierra con adhesivo tisular.
Para los estudios que requieren intubaciones repetidas frecuentes, la incisación sucesiva y el cierre de este sitio requiere el desbridamiento de los márgenes de la piel y traumatismos tisulares en el cuello ventral. El propósito del enfoque de visualización traqueal transcutánea a la intubación oral es proporcionar una técnica refinada y no invasiva específicamente adecuada para estudios de intubación repetida, así como eventos de intubación individual en ratones.
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Protocolo
Todas las actividades de animales descritas aquí han sido aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio y se llevaron a cabo en instalaciones acreditadas por AAALAC.
1. Preparación del procedimiento
- Construir la plataforma de intubación. Para lograr la pendiente de plataforma adecuada, utilice un aglutinante de tres pulgadas (7,6 cm) de 3 anillos. Doble una longitud de 15 a 20 cm de seda u otro material de rosca por la mitad y adhiera los extremos de la rosca a la parte superior de la plataforma inclinada con cinta para crear un bucle de suspensión(Figura 1).
- Seleccione una cánula del tamaño y la longitud adecuados.
NOTA: Para un ratón de 20 a 30 g, se puede utilizar un catéter de 1 a 1,5 pulgadas (2,5 x 3,8 cm) de largo de hasta 18 G. Para este estudio, se utilizaron hembras DE 18 semanas de edad en BALB/c y ratones C57BL/6 de 10 semanas (n.o 3 de cada cepa). Una funda de catéter blanco opaco proporciona la mejor visualización transcutánea. - Corte un bisel en la punta distal del catéter y alise la superficie cortada con papel abrasivo para crear una punta de bisel redondeada. Cree suavemente una ligera curvatura en la cánula aproximadamente a 1 cm del bisel(Figura 2).
NOTA: Se debe utilizar un nuevo catéter para cada ratón. - Anestetizar el ratón con ketamina (5,4 mg/g de peso corporal) y xilazina (16 g/g de peso corporal) administrados por vía intraperitoneal. Aplique pomada ofthalimática estéril en los ojos.
NOTA: La profundidad anestésica adecuada se logra por falta de respuesta del ratón a un pellizco de dedo del dedo del pecho firme. - Suspenda el ratón en posición supina en la plataforma de intubación enganchando los incisivos superiores alrededor del hilo de seda en la parte superior de la superficie en ángulo(Figura 3). Una vez que el ratón está posicionado al cuadrado en la recumbencia dorsal, agarre suavemente la base de la cola y retraiga la cola hacia la mesa. Coloque un trozo de cinta sobre la base de la cola para fijar el ratón.
- Aplicar crema depilatoria(Tabla de Materiales)en la región cervical ventral durante 30 a 45 s y luego retirar toda la crema depilatoria de la región cervical usando una gasa seca. Repita el proceso de solicitud si es necesario. Enjuague bien la piel con agua salina o destilada para eliminar cualquier residuo y luego seque.
2. Procedimiento de intubación
- Utilice fórceps rectos y planos en la mano no dominante para retraer suavemente la lengua de una manera que abra suficientemente la boca para la introducción de la cánula.
NOTA: Los fórceps del diente de rata no se deben utilizar, ya que esto dañará la lengua. - Con la mano dominante, avanzar la cánula en la boca de tal forma que el extremo que es distal a la ligera curva está contra el techo de la boca del sujeto.
- Suelte la lengua y deslice el borde plano de los fórceps cerrados caudalmente a lo largo del cuello ventral hasta que se alcance el manubrio. Este movimiento desplaza lateralmente las glándulas salivales y aplana el músculo que cubre la tráquea. La tráquea aparece transcutáneamente como una línea blanca(Figura 3A). Si es necesario, gire los fórceps en una dirección craneodorsal mientras mantiene la tensión en la piel en una dirección caudal para hacer que las glándulas salivales desplazadas lateralmente alcancen su punto máximo. Esta maniobra crea más contraste alrededor de la tráquea(Figura 3B).
NOTA: Evite la fuerza excesiva en el cuello ventral, ya que puede colapsar la tráquea y afectar la respiración. - Avance la cánula mientras se angling simultáneamente la punta distal de la cánula ventralmente por la supinación de la mano dominante con flexión simultánea de la muñeca.
- La colocación adecuada de la cánula se indica mediante la visualización de la cánula opaca en la tráquea(Figura 4B,D). Si la cánula se ha avanzado más allá del nivel del origen del músculo maseter y la visualización de la cánula en la tráquea no se ha confirmado, retirar la cánula y volver a intentar la maniobra.
- Confirme la colocación adecuada de la cánula conectando una bombilla de inflado pulmonar a la cánula y observando la expansión torácica con depresión simultánea del dispositivo.
- Sin desplazar la cánula, desenganche cuidadosamente los incisivos del ratón de la plataforma de intubación. Mueva el ratón a una plataforma horizontal(Tabla de materiales)e inserte la cánula en el adaptador del ventilador. Después de la inflación profunda, ventilar el ratón durante 60 s y luego medir la resistencia respiratoria.
3. Recuperación
- Una vez completado el procedimiento, mueva el ratón a una plataforma calentada. Proporcionar estimulación constante a través de pellizcos de dedo del dedo del dedo de la luz o cola para fomentar la respiración espontánea.
- La extubación puede ocurrir cuando el ratón comienza a masticar. Sujete la cánula a la altura del cubo y tire suavemente del tubo cranealmente y lejos del ratón hasta que la cánula se retire completamente de la boca del sujeto.
NOTA: Es preferible proporcionar soporte de las vías respiratorias con la cánula rígida durante el mayor tiempo posible durante el proceso de recuperación. - Una vez extubado, transfiera el ratón a una jaula de recuperación limpia con soporte térmico. Supervise continuamente el ratón hasta que esté completamente ambulatorio y la recuperación se haya completado.
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Resultados
Monitorización en serie de la función pulmonar basal
Las hembras de dieciocho semanas de edad BALB/c y los ratones C57BL/6 de 10 semanas de edad (n.o 3 de cada cepa) fueron intubados utilizando el método descrito los días 0, 3, 10 y 17. Después de la intubación en cada día, el sujeto se conectó a un respirador mecánico suministrado con 100% de oxígeno(Tabla de Materiales). La resistencia respiratoria (Rrs) se midió utilizando la técnica de oscilación forzada durante 60 s tras una infl...
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Discusión
La intubación mediante la técnica de visualización traqueal transcutánea ofrece un enfoque refinado al método de incisión cutánea estándar. Con especial atención a varios pasos clave, la intubación se puede lograr fácil y rápidamente. El animal debe colocarse directamente en la reclinación dorsal en la plataforma de intubación con el ratón asegurado en una suave retracción. Esto extenderá al animal en la alineación vertical y el posicionamiento adecuado para la intubación. Además, la crema depilatoria no debe permanecer ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph y Lindsey Ferguson por su asistencia técnica y el Laboratorio Universitario de Recursos Animales por su apoyo al cuidado animal. Este trabajo está financiado por NIH T35OD010977 y R01-HL102469.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Catéter intravenoso de 18 G x 1 1/4", Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cánula para intubación |
| 70% etanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cánula de limpieza |
| Papel abrasivo (papel de lija) | Porter-Cable | 74001201 | Preparación de la cánula |
| AnaSed (solución estéril de xilacina) inyección (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | anestesia |
| (0.5 pulgadas x 14 yardas) | Fisher Scientific | 15966 | Sujeción en la plataforma de intubación |
| Sutura de seda trenzada sin aguja, no estéril, (3-0) | Henry Schein | Artículo #1007842 | Plataforma de intubación |
| Almohadilla isotérmica Deltaphase | Braintree Scientific | 39DP | Termorregulación y recuperación del ratón |
| Deltaphase Funcionamiento Placa | Braintree Scientific | 39OP | Recuperación del ratón (antes de la extubación) |
| Agua destilada | ThermoFisher | 15230253 | Limpieza del ratón después de la depilación |
| Tijeras oculares, anguladas, afiladas/afiladas | Aparato Harvard | 72-8437 | Preparación de cánulas |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Registre los datos de la función pulmonar (no es necesario para realizar el procedimiento, se utiliza en este estudio para validar el procedimiento) |
| Esponjas de gasa | Fisher scientific | 13-761-52 | Depilación |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring-Ring View Binders | Grapas | 24690CT | Plataforma de intubación |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Software de análisis estadístico |
| Jeringa de insulina (0,5 cc, U100) | Fisher Administración | de | anestesia |
| científica Inyección de ketamina HCl, USP (100 mg/mL) | Lista de Laoratorios Llyod | No. 4871 | Anestesia |
| Bombilla de inflado pulmonar Aparato | Harvard | 72-9083 | Confirmar la colocación de la cánula |
| Micro Pinzas, Curvas, Lisas | Aparato Harvard | 72-0445 | Retraiga la lengua y cree tensión en el cuello para la visualización de |
| la cánulaNair (loción depilatoria), botella de 9 oz | Church & Dwight | 42010440 | Depilación Suero |
| fisiológico estéril (0,9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anestesia, limpieza de la piel después de la depilación |
Referencias
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179(1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107(2013).
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Reimpresiones y permisos
