Summary
O ensaio opsono-adesão é um método alternativo ao ensaio opsono-fagocítico de matar para avaliar as funções opsônicas dos anticorpos no desenvolvimento de vacinas.
Abstract
O ensaio opsono-adesão é um ensaio funcional que enumera o apego de patógenos bacterianos a fagocitos profissionais. Como a adesão é necessária à fagocitose e à matança, o ensaio é um método alternativo para ensaios de morte opsono-fagocítico. Uma vantagem do ensaio de adesão opsono é a opção de usar patógenos inativados e linhas celulares de mamíferos, o que permite a padronização em vários experimentos. O uso de um patógeno inativado no ensaio também facilita o trabalho com agentes infecciosos de nível 3 de biossegurança e outros patógenos virulentos. Em nosso trabalho, o ensaio opsono-adesão foi utilizado para avaliar a capacidade funcional dos anticorpos, desde soro de animais imunizados com uma vacina à base de cápsula de antraz, para induzir a adesão de Anthracis fixas de Bacillus a uma linha de células macrófagos do camundongo, RAW 264.7. A microscopia automatizada de fluorescência foi usada para capturar imagens de bacilos aderindo a macrófagos. O aumento da adesão foi correlacionado com a presença de anticorpos anti-cápsula no soro. Primatas não humanos que exibiam altas concentrações de anticorpos anti-cápsulas de soro foram protegidos do desafio do antraz. Assim, o ensaio opsono-adesão pode ser utilizado para elucidar as funções biológicas de anticorpos específicos de antígeno no Sera, avaliar a eficácia dos candidatos à vacina e outras terapêuticas, e servir como uma possível correlação de imunidade.
Introduction
Reconhecimento, adesão, internalização e degradação de um patógeno são parte integrante da fagocitose1, um caminho saliente na resposta imune inata hospedeira descrita pela primeira vez por Ilya Metchnikoff em 18832,3. Leucócitos fagocíticos, bem como outras células do sistema imunológico, são altamente discriminatórios em sua seleção de alvos; eles são capazes de distinguir entre "não-eu infeccioso" e "eu não infeccioso" através de padrões moleculares associados ao patógeno por seu repertório de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs)4,5. O reconhecimento hospedeiro de um patógeno também pode ocorrer com a vinculação de opsoninas hospedeiras, como complemento e anticorpos6. Esse processo, chamado opsonização, reveste o patógeno com essas moléculas, aumentando a internalização ao vincular-se a receptores opsônicos (por exemplo, receptores complementares e fc) em células fagocíticas6. Para que um patógeno adere a um fagocito, é necessária a ligação coletiva de múltiplos receptores com seus ligantes cognatos. Só então a adesão pode desencadear e sustentar cascatas de sinalização dentro da célula hospedeira para iniciar a internalização6.
Devido à importância da fagocitose no despejo de patógenos e prevenção de infecções, patógenos extracelulares desenvolveram inúmeras formas de subverter esse processo para prolongar sua sobrevivência. Uma estratégia de importância é a produção de uma cápsula polimérica aniônica (por exemplo, polissacarídeo ou poliaminoácido), que é anti-fagocítica em virtude de sua carga, é pouco imunogênica e protege moléculas no envelope bacteriano das PRRs6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae possuem cápsulas compostas de polímeros sacarídeos, enquanto staphylococcus epidermidis e algumas espécies de Bacillus produzem ácido poli-ɣ-glutamico (PGGA)7,8. No entanto, outros patógenos produzem cápsulas que se assemelham ao eu não infeccioso. Por exemplo, Streptococcus pyogenes e uma cepa patogênica de B. cereus têm uma cápsula de ácido hialurônico que não é apenas anti-fagocítica, mas que também pode não ser reconhecida como estrangeira pelo sistema imunológico9,10.
A conjugação da cápsula para proteínas portadoras converte-os de antígenos pobres e independentes de T em antígenos altamente imunogênicos dependentes de T que podem induzir os anticorpos anti-cápsula de soro elevado11,12. Esta estratégia é empregada para vacinas licenciadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee meningite Neisseria11. As atividades opsônicas de anticorpos anti-cápsula têm sido comumente avaliadas por ensaios de morte opsono-fagocítico (OPKA)13,14,15,16. Estes ensaios testam se anticorpos funcionais podem desencadear fagocitose e matar14. No entanto, o uso de OPKA com patógenos infecciosos, como Agentes e Toxinas Biológicas de Nível 1 (BSAT), incluindo B. anthracis17,é perigoso e apresenta riscos à segurança; esses ensaios exigem um manuseio extensivo de um agente selecionado. O manuseio de agentes selecionados só pode ser feito em laboratórios de biossegurança restrito nível 3 (BSL-3); o trabalho nessas áreas exige procedimentos operacionais prolongados devido às inúmeras precauções de segurança e segurança que devem ser seguidas. Os laboratórios BSL-3 também normalmente não são equipados com os equipamentos especializados utilizados para o trabalho opka, como microscópios e citómetros. Assim, desenvolvemos um ensaio alternativo baseado no uso de bactérias inativadas18,19. Referimo-nos a isso como um ensaio opsono-adesão (OAA) que não depende da internalização e da morte como saídas de ensaio; em vez disso, a adesão de patógenos inativados opsonizados é usada como um índice de fagocitose. Mecanicamente, o OAA é um substituto adequado porque a adesão ocorre a priori e está intimamente entrelaçada com internalização e assassinato intracelular. Do ponto de vista da biossegurança, o OAA é preferido porque requer manuseio mínimo de um agente infeccioso, é experimentalmente de menor duração que o OPKA, e pode ser realizado em laboratórios BSL-2 depois que um estoque do patógeno inativado foi produzido e transferido.
Demonstramos a utilização da OAA para examinar a função opsônica de anticorpos anti-cápsula encontrados em soro de primatas não humanos (NHPs) vacinados com uma cápsula conjugada [ou seja, PGGA de B. antracracis conjugado ao complexo proteico da membrana externa (OMPC) de meningite neisseria]20. Bacilos opssonizados de soro foram incubados com uma linha de células macrófagos de camundongos aderentes, RAW 264.7. Após a fixação, a monocamada celular e bacilos aderentes foram imagens por microscopia de fluorescência. A adesão bacteriana aumentou quando os bacilos foram incubados com soro de NHPs vacinados com o conjugado da cápsula em comparação com o soro de controle20. Adesão correlacionada com a sobrevivência do desafio antraz20,21. Assim, o uso de OAA caracterizou a função de anticorpos anti-cápsula e facilitou muito o teste do nosso candidato à vacina.
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Protocol
Em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal, a política do Serviço Público de Saúde e outros estatutos e regulamentos federais relativos a animais e experimentos envolvendo animais, a pesquisa aqui descrita foi conduzida sob um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. A instalação onde esta pesquisa foi realizada é credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Laboratoriais de Animais, Internacional e adere aos princípios indicados no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Conselho Nacional de Pesquisa, 201124.
1. Cultura e manutenção da linha celular, RAW 264.7
NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados com técnicas assépticas.
- Aqueça o soro bovino fetal (FBS) em um banho de água de 56 °C por 30 minutos para inativar o complemento.
NOTA: O tempo de inativação de 30 min começa quando a FBS atinge 56 °C. Para monitorar a temperatura, aqueça um volume semelhante de água em um béquer no mesmo banho de água. Assim que a água atingir 56 °C, inicie a contagem regressiva de 30 minutos para fbs. Alternativamente, o FBS que foi inativado pelo calor também está disponível comercialmente. - Prepare o meio para células RAW 264,7 combinando 90% DMEM com alta glicose e 10% de FBS inativados de calor (v/v). Adicione L-glutamina a uma concentração final de 6 mM.
NOTA: O DMEM com alta glicose é formulado com L-glutamina de 4 mM. A suplementação de L-glutamina a 6 mM promove um crescimento celular consistente. Penicilina de 100 U/mL e estreptomicina de 100 μg/mL podem ser adicionadas para evitar contaminação. Outra linha celular murina comum, J774A.1, também pode ser usada e é cultivada em condições semelhantes. - Descongele um frasco congelado de células em um banho de água de 37 °C e retire do banho assim que derreter. Adicione o conteúdo asepticamente a 5 mL meio completo em um tubo cônico. Inverter o tubo cônico duas vezes e girar a 300 x g por 5 min para as células de pelota.
- Aspirar o meio usando uma tubulação pasteur estéril presa a um vácuo para remover o agente de congelamento. Pelota de célula resuspenda em 5 mL de meio fresco.
- Transfira a suspensão para um frasco ou prato tratado de cultura de tecido. Adicione meio suficiente para cobrir completamente a parte inferior do frasco e redemoinho para distribuir uniformemente as células. Indicar número de passagem começando com "1".
- Incubar células a 37 °C na presença de 5% de CO2 e umidade até 95% a 100% de confluência é atingida. Verifique as células diariamente sob o microscópio começando com o segundo dia de incubação. Não permita que as células atinjam >100% de confluência, pois isso fará com que as células decolem e morram.
NOTA: O tempo necessário para alcançar a confluência depende de quantas células vivas foram banhadas e da área de crescimento do frasco. Assim, é prudente verificar as células diariamente. - Células de subcultura raspando e diluindo o estoque celular em meio fresco permitindo pelo menos dois dias de crescimento entre raspagens. Aumente o número de passagem em 1 com cada subcultura.
NOTA: A passagem e raspagem imediata no dia seguinte resultará em uma perda mais rápida da adesão geral das células ao longo do tempo. As células RAW 264.7 só devem ser utilizadas até aproximadamente a passagem 15. - Para emplacar células RAW 264.7 para o ensaio OAA, substitua por meio fresco e use um raspador de células para raspar suavemente as células do frasco. Pipeta para cima e para baixo para quebrar os aglomerados celulares para uma contagem celular mais fácil.
NOTA: O método tradicional para subculturar RAW 264.7 é raspando. Em nossa experiência, o uso da trippsina faz com que as células RAW 264.7 percam a adesão ao longo do tempo mais rápido do que com a raspagem. - Para contar células, diluir volumes iguais de células e solução azul trypan. Carregue 10 μL em um hemótmetro. Observe e conte o número de células vivas que excluem o corante usando um microscópio composto invertido com uma lente objetiva de 10x.
- Placa 1.4 x 104 células viáveis por poço em uma placa de fundo plana de vidro de 96 bem 0,15 μm de espessura (Placa #1). Permitir que as células cresçam por 3 dias. Substitua o meio gasto um dia antes de realizar o OAA.
NOTA: Após 3 dias de incubação, o número de células deve ser de aproximadamente 5 x 104/bem.
2. Cultura bacteriana e Preparações
NOTA: A espécie bacteriana utilizada neste protocolo é uma cepa virulenta encapsulada, B. anthracis Ames. Todas as manipulações com esta espécie requerem biossegurança e autorizações de segurança adequadas e devem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica classe II ou Classe III localizado em um laboratório BSL-3. Seguir os procedimentos operacionais institucionais para o trabalho BSL-3 e para uso de equipamentos de proteção individual no manuseio de bactérias.
- Prepare o caldo de Infusão do Coração Cerebral (BHI) dissolvendo 37 g de pó BHI em 1 L de água e autoclaving a 121 °C por 15 min. Armazene caldo à temperatura ambiente.
- Prepare 8% de solução de bicarbonato de sódio na água e esterilize usando uma seringa de filtro de 0,20 μm. Armazene a solução a 4 °C e use dentro de 1 dia.
- Misture 8 g de caldo de nutrientes, extrato de levedura de 3 g e 15 g de ágar em 1 L de água para preparar placas de ágar NBY. Autoclave a 121 °C por 15 min. Despeje em pratos de petri e deixe solidificar. Armazenar placas a 4 °C.
NOTA: As placas de ágar NBY podem ser feitas com ou sem bicarbonato de sódio. A adição de bicarbonato de sódio a placas de caldo e ágar induz o crescimento de colônias mucoides constituídas por bacilos encapsulados. A concentração final de bicarbonato de sódio em mídia líquida e sólida é de 0,8%. - Prepare o caldo de cultura para B. anthracis misturando caldo BHI 50%, 40% FBS e 10% solução de bicarbonato de sódio (v/v).
NOTA: Este caldo é formulado para produzir cadeias curtas de bacilos encapsulados. - Prepare uma placa mestre de B. anthracis, espalhando-a para isolamento em uma placa de ágar NBY de um estoque de esporos um dia antes de cultivar em caldo. Incubar a 37 °C.
- Inocular 30 mL de caldo de cultura em um frasco ventilado de 250 mL com várias colônias de B. anthracis.
NOTA: Uma proporção específica de volume para superfície do caldo, conforme especificado aqui, é necessária para produzir bacilos encapsulados ao máximo. - Agite a cultura do caldo a 125 rpm, 37 °C com 20% de CO2 e umidade para 18-24 h.
NOTA: O crescimento de B. antracracis a temperaturas superiores a 37 °C pode inibir a produção de cápsulas. - Use manchas negativas com tinta índia para garantir encapsulamento suficiente e que os bacilos estejam em cadeias curtas (1-5 bacilos/cadeia) antes da fixação (ver seção 3).
- Para determinar unidades de formação de colônias (UFC), diluir em série 100 μL de cultura 1:10 em solução salina tampão fosfato (PBS) e diluições de cultura de placas de ágar de ovelha. Incubar por 12-18 h a 37 °C. Conte CFUs e determine o número de bactérias por mL de cultura.
NOTA: A contagem também pode ser realizada usando um hemótmetro sob o microscópio uma vez que as bactérias tenham sido fixadas. No entanto, isso não é recomendado porque os bacilos são difíceis de ver sob baixa ampliação. - Adicione 16% de paraformaldeído (PF) a todo o volume da cultura bacteriana em uma concentração final de 4% da PF para fixar os bacilos. Agitar lentamente em um agitador à temperatura ambiente por 7 dias.
NOTA: Sete dias de incubação em 4% A PF baseia-se no procedimento operacional padrão institucional usamriid para fixação de bacilos vegetativos. - Para remover o fixador e testar a esterilidade, lave três vezes 4 mL (10% de volume) de suspensão bacteriana fixa em um tubo cônico de 50 mL por centrifugação a ≥3000 x g por 45 min e utilizando uma lavagem de 30 mL/lavagem com PBS. Armazene a amostra restante em 4% PF a 4 °C.
NOTA: Após a pelota, a pelota bacteriana é macia devido à presença de cápsula. Tome cuidado para não perturbar a pelota durante a lavagem. É necessário remover todos os fixativos para que não interfira nos testes de viabilidade. Se necessário, aumente o número de lavagens. - Para testes de viabilidade, inocular 40 mL de um meio de crescimento bacteriano (por exemplo, caldo BHI) com 4 mL de suspensão lavada (≤ 10% do volume do caldo) e incubar a 37 °C por 7 dias. Verifique a densidade óptica em 600 nm antes e depois de 7 dias para medir a turbidez.
- Após 7 dias de incubação na cultura do caldo, a placa ≥100 μL de caldo em uma placa de ágar e incubar por mais 7 dias. Se não for observado aumento da turbidez e nenhum crescimento nas placas, a cultura original é considerada estéril e pode ser transferida para um laboratório BSL-2.
NOTA: O Programa federal de Agente Seleto22 determina que a anthracis inativada só pode ser transferida dos laboratórios BSL-3 após demonstrar a completa esterilidade da amostra. O teste de viabilidade para b. anthracis inativado consiste em culcular 10% da amostra em caldo por 7 dias seguido de cultivo em meio sólido por mais 7 dias22,23. Siga as diretrizes institucionais para receber a aprovação da transferência assim que a esterilidade for estabelecida.
3. Coloração negativa e microscopia de luz para observar encapsulamento e cadeias bacilos
- Misture 5 μL de suspensão bacteriana com 2 μL de tinta da Índia em um slide de microscópio. Coloque um copo de cobertura de 1 ou 1,5 μm de espessura em cima da suspensão sem criar bolhas.
NOTA: O esmalte pode ser usado para selar o vidro de cobertura na lâmina. - Observe a suspensão bacteriana usando uma lente objetiva de óleo de 40x a 100x em um microscópio leve. Certifique-se de que os bacilos sejam encapsulados observando uma zona de desembaraço (a cápsula exclui a tinta da Índia) ao redor de cada bactéria e que as cadeias de bacilos são curtas.
4. Rotulagem FITC de bactérias
- Dissolver isothiocyanato fluoresceína (FITC) em sulfóxido de dimetil a uma concentração de 2 mg/mL.
- Meça o volume de estoque bacteriano inativado.
- Lave o estoque 3x em PBS para remover fixação.
- Adicione a solução FITC a uma concentração final de 75 μg/mL. Agitar lentamente a mistura por 18-24 h a 4 °C.
- Lave três vezes as bactérias pelo menos em ≥3000 x g, 45 min e usando 30 mL PBS/wash para remover o excesso DE FITC. Certifique-se de que a pelota macia não seja perturbada durante a lavagem. Resuspend os bacilos em PBS no mesmo volume inicial.
- Aliquot e armazene os bacilos em microtubos a -20 °C até usar. Não congele/descongele bacilos várias vezes, pois os bacilos podem perder cápsula.
5. Opsonização Bacteriana
- O calor inativa um pequeno volume de sera de teste (de NHPs) a 56 °C por 30 min em um bloco de calor.
- Descongele e lave bactérias com pbs 2x por pelotização a 15000 x g por 3-5 min. Resuspend em PBS no mesmo volume inicial.
- Em uma placa inferior bem redonda de 96 (placa #2), teste de diluição serial em meio celular. Em outra placa inferior bem redonda (placa #3), adicione 10 μL de sera de teste diluído em cada poço.
NOTA: Em cada placa, PBS e sera macaco normal foram incluídos no lugar de sera teste diluído como controles negativos. Também escolhemos um soro de teste como um controle positivo para gerar uma curva padrão para normalizar todos os ensaios feitos em dias diferentes. O soro positivo do teste de controle foi arbitrariamente escolhido porque era abundante. - Para emplacar #3, adicione 10 μL recém-reconstituído complemento de coelho bebê.
NOTA: Uma vez reconstituído, descarte o complemento restante do coelho bebê; não descongelar e descongelar. - Para emplacar #3, adicione o volume apropriado de bacilos rotulados pelo FITC para uma multiplicidade de infecção de 1:20. Por exemplo, adicione o volume que contém 5 x 104 x 20 bacili para 5 x 104 células. Cubra cada poço em #3 de placa com o volume adequado de meio celular para totalizar 105 μL.
NOTA: A placa #1, que contém células, recebe 100 μL de bactérias opssonizadas com os 5 μL restantes como o volume vazio. Testamos cada diluição do teste de soro em duplicata. - Incubar placa #3 a 37 °C por 30 min na presença de 5% de CO2 com umidade para opsonizar bacilos.
6. Ensaio de adesão e rotulagem fluorescente de células mamíferas
- Mantenha todos os reagentes a 37 °C antes de usar.
- Coloque #1 de placa, que contém células aderentes, em um bloco de calor de 37 °C.
- Use um pipettor multicanal para remover o meio gasto dos poços e substitua rapidamente por 100 μL de bactérias opssonizadas da placa #3. Certifique-se de que não foram geradas bolhas nos poços durante a pipetação. A placa incubada #1 a 37 °C com 5% de CO2 e umidade por 30 min para adesão.
- Lave cada poço 5x com 150 μL PBS em cima de um bloco de calor de 37 °C para remover bacilos não ligados.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que as células não sejam acidentalmente dispersas durante a lavagem. - Diluir 16% pf com PBS 1:4 para fazer 4% PF. Fixar células com 4% pf por 1h adicionando 150 μL a cada poço. Lave células 2x com PBS.
- Misture 2 μL HCS (triagem de alto conteúdo) Mancha de célula laranja em PBS de 10 mL. Adicione 150 μL desta solução de coloração a células fixas e incubar por 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lave os poços 2x com PBS.
- Armazene a 4 °C até a microscopia.
7. Microscopia
NOTA: Em geral, um microscópio automatizado de fluorescência de alto rendimento facilitará a imagem para o OAA. Se um sistema automatizado não estiver disponível, imagens fluorescentes de bacilos aderentes podem ser tiradas manualmente21. Nesteestudo, 20,bacilos aderentes e monocamadas de células foram imagens utilizando o sistema de microscopia de escaneamento a laser Zeiss 700 com equipamento especializado; nosso sistema era composto pelo microscópio invertido Zeiss Axio Observer Z1 equipado com um estágio automatizado, o módulo Foco Definitivo, objetivo 40 x NA 0.6, câmera Axio Cam HRc e software Zen 2012 (Blue Edition). As imagens adquiridas são imagens de campo largo, não imagens confocal. O protocolo a seguir destina-se a uma configuração básica de microscópio que é aplicável a uma variedade de sistemas automatizados de microscopia.
- Incubar placa #1 à temperatura ambiente por 30 minutos. Ligue o microscópio e os equipamentos relacionados.
NOTA: A aclimatação à temperatura ambiente impede a condensação de se formar na placa de vidro durante a imagem. Além disso, evita o desfoco devido à mudança de temperatura. - Coloque a placa no palco e foque nas células usando campo brilhante ou contraste de fase.
- Selecione 96 bem formato como a configuração da placa. Selecione as configurações do canal.
NOTA: O comprimento de onda de pico e excitação da FITC é de 495/519 nm; a mancha de célula laranja do HCS é de 556 e 572 nm. Outros fluoroforos podem ser usados dependendo dos filtros disponíveis no microscópio. - Selecione a configuração para o modo Tile. Indique o número de imagens a serem adquiridas.
NOTA: A função de revestimento permite a captura de vários locais em uma amostra bem e pode ser definida para adquirir imagem em um revestimento ou um formato aleatório. Nós imagemmos 10 áreas aleatórias por poço. - Mude o modo de aquisição para "preto e branco" ou "monocromático" e binning ≥ 2x2.
NOTA: A definição do binning de 1x1 para 2x2 ou 4x4 aumentaria a velocidade da microscopia, mas também resultaria em menor resolução da imagem. Para o OAA, basta usar essas configurações, pois o ensaio enumera tanto os macrófagos quanto as bactérias aderentes. - Ligue o foco automático ou o módulo de foco. Indique com que frequência a função de foco automático deve ser realizada. Ligue a função pilha Z, se estiver disponível. Indique o número de pilhas Z que capturarão a espessura da monocamada celular e bacilos aderentes.
NOTA: O número de pilhas Z escolhidas aumentará o tempo de microscopia, mas garantirá que uma imagem com o foco correto seja tirada em cada pilha Z. - Designe uma pasta de arquivo para salvar imagens. Execute o programa de imagem automatizado.
8. Coleta e Análise de Dados
- Conte o número de bacilos aderentes e células mamíferas por imagem. Conte cada cadeia de bacilos como uma bactéria.
- Plote os bacilos/células do soro e do titulador do teste de controle positivo (por exemplo, diluição 1:10 é de 10 unidades de titer) para gerar uma curva padrão em um programa estatístico apropriado.
- Analise o soro do teste de controle positivo usando o encaixe da curva de regressão não linear. Em seguida, analise as amostras restantes usando a curva padrão do soro de teste de controle positivo para determinar os títulos correspondentes.
NOTA: É geralmente mais preciso escolher as diluições amostrais perto do meio da curva padrão ao determinar os títulos. - Calcule a média geométrica das amostras de cada grupo de vacinas. Calcule os valores P dos títulos transformados em log por uma análise ANOVA de diferença menos significativa.
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Representative Results
Esta seção mostra micrografias representativas coletadas durante um experimento OAA, juntamente com resultados mostrando que o OAA pode ser usado para examinar a função biológica dos anticorpos. Aqui, o ensaio foi usado com sucesso para avaliar a eficácia de um candidato à vacina contra antraz. É fundamental verificar o estado de encapsulamento nos bacilos tão pouco ou nenhum encapsulamento faz com que eles aderam às células hospedeiras, produzindo um alto fundo. Figura 1 é uma imagem de B. anthracis Ames manchada negativamente com tinta da Índia para examinar o encapsulamento. OAA requer vários campos de visão adjacentes para serem iluminados e se a microscopia confocal for usada, várias pilhas ou seções. Assim, é necessário verificar se os bacilos não são nem muito escuros nem foto-branqueados muito rapidamente. Figura 2 é uma imagem dos bacilos rotulados com FITC. A Figura 3 mostra imagens máximas de projeção de B. anthracis Ames anexadas às monocamadas celulares. Estes são campos de visão representativos que foram contados e pontuados para o OAA. O aumento da fixação de bacilos incubados com antiserum PGGA-OMPC deve-se à presença de anticorpos anti-cápsula que opssonizaram os bacilos. A Figura 4 mostra que os títulos de soro de NHPs vacinados com PGGA-OMPC de 10 e 50 μg são significativamente maiores do que os títulos apenas para OMPC e PGGA.
Figura 1. Uma imagem de tinta da Índia de B. anthracis Ames fixo. Observe a zona de desembaraço ao redor dos bacilos devido à presença de cápsula. Barra = 10 μm. A imagem foi tirada no sistema de microscopia automatizada EVOS FL com lente objetiva de óleo de abertura numérica 100 x 1,4 (NA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens do FITC rotulado b. anthracis Ames fixo. (Esquerda) Imagem de contraste de interferência diferencial; imagem fluorescente pseudocolorida em verde (meio); fundido (à direita). Barra = 10 μm. As imagens confocal foram tiradas na Zeiss 700 LSM Confocal Microscopia com lente objetiva de óleo 40 x 1,3 NA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens fluorescentes de B. anthracis Ames aderiram a monocamadas de células RAW 264.7. Os bacilos foram opssonizados com soro de teste de NHPs vacinados e impulsionados apenas com (A) 10 μg PGGA-OMPC, (B) 50 μg PGGA-OMPC, (C)50 μg PGGA sozinho, ou (D) OMPC sozinho. Verde = B. anthracis Ames, vermelho = RAW 264,7 células. Barra = 20 μm. Imagens de campo largo foram tiradas no microscópio Zeiss Axio Observer Z1 com lente objetiva 40 x 0,6 e a câmera HRc Axio Cam. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os títulos de adesão opsono de NHPs vacinados com 10 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA sozinho, ou somente OMPC. Os meios geométricos de 5 animais por grupo são gráficos. As barras de erro indicam SEM. *p ≤ 0,001 em comparação apenas com PGGA. Os valores p foram calculados utilizando-se a ANOVA com teste pós-doutorado LSD. Os dados foram publicados originalmente em Chabot, et al., 201620. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vacinas à base de cápsulas têm se mostrado eficazes contra numerosos patógenos bacterianos, e muitas são licenciadas para uso em humanos25,26,27. Essas vacinas funcionam gerando anticorpos voltados para a cápsula e muitos desses estudos utilizam o OPKA para mostrar as funções opsono-fagocíticas dos anticorpos13,14,16,28,29. Devido a preocupações com a biossegurança e à facilidade de trabalho, desenvolvemos um OAA para avaliar anticorpos de animais vacinados com conjugados da cápsula B. anthracis. A presença de cápsula em B. anthracis previne a adesão e fagocitose30,mas a opssonização de bacilos com soro de animais vacinados induz a apego aos macrófagos20,21.
Para a OAA, a atividade de adesão, não a internalização e a matança, é usada para quantificar a atividade opsônica. Isso proporcionou ao OAA várias vantagens. Fomos capazes de utilizar paraformaldeído morto, fluorescentemente rotulado bacilo encapsulado em vez de organismos vivos. Alterações na superfície bacteriana da fixação de aldeídos e rotulagem fluorescente não alteraram a adesão geral da bactéria aos macrófagos; bacilos fixos e rotulados não eram mais aderentes do que bacilos vivos (dados não mostrados). O grau de encapsulamento pode variar de cultura para cultura e afetar a adesão geral, apesar das condições de crescimento semelhantes. Assim, o uso de um único estoque bacteriano inativado permite a padronização entre experimentos realizados em dias diferentes e em diferentes conjuntos de experimentos. Isso foi valioso para comparar sera dos 20 NHPs utilizados neste trabalho e sera que serão gerados em nossos próximos estudos. Por último, a maioria dos macrófagos, incluindo as células RAW 264.7, são sensíveis à toxina letal do antraz produzida pelo patógeno vivo31, tornando o uso de bacilos vivos inerentementeproblemáticos.
O uso de células RAW 264.7 também facilitou a padronização. Inicialmente usamos uma linha celular comumente usada em células OPKA, HL-60. No entanto, encontramos dificuldades em diferenciá-los aos granulócitos com dimetil-formameto, como relatado por outros28,32. As células RAW 264.7 têm a vantagem de não precisarem ser quimicamente diferenciadas e serem aderentes e, portanto, mais favoráveis ao OAA baseado em microscopia. Esta linha celular tem sido utilizada em numerosos estudos de fagocitose com patógenos intracelulares33,34, bem como B. anthracis31. O uso de células RAW 264.7, que são derivadas do camundongo, também é vantajoso porque os receptores de Fc do rato são promíscuos em sua especificidade de ligação para IgG derivado de outras espécies35. Isso nos permitiu avaliar os anticorpos anti-cápsulas de NHPs com uma linha celular murina.
O antraz, embora raro, é endêmico em algumas regiões do mundo e nos EUA. Uma preocupação é que o FBS usado, originário dos EUA, já pode conter anticorpos anti-cápsula como resultado do animal ser exposto a esporos b. antracracis ou outros micróbios produtores de PGGA no solo. Para resolver esse problema, o lote FBS que usamos foi pré-testado. Verificou-se que a adição de FBS inativados por calor aumentou a adesão em relação apenas ao DMEM (dados não apresentados). No entanto, não aumentou a adesão em comparação com o calor inativado sera normal de cobaia, macaco, rato ou humano (dados não mostrados). Assim, o lote FBS que usamos não continha anticorpos anti-cápsula como resultado da exposição. Além disso, também não conteria anticorpos anti-cápsula como resultado da vacina do animal com a antracosa não encapsulada Sterne, uma cepa que carece do plasmídeo pXO2 necessário para a produção da cápsula. O lote FBS testado foi utilizado para todos os OAA subsequentes.
Uma limitação da técnica é a tarefa de contar bacilos e células por pessoal de laboratório, o que levou enorme tempo e esforço. Isso pode ser corrigido com o uso de software que tenha esse tipo de análise; este software não estava disponível para nós na época. No entanto, como a contagem manual era necessária, um passo crítico era a remoção ou lavagem de bacilos estranhos e não ligados para facilitar a tarefa. Também foi necessário testar reagentes que levaram a ruídos de fundo mais baixos. OAA requer uma fonte de complemento porque melhora a opsonização36. Por isso, testamos uma variedade de fontes complementares, incluindo cobaia, complemento humano e coelho bebê. Escolhemos o complemento do coelho bebê para o nosso ensaio porque descobrimos que ele não tem atividades fracas e multiespecíficas contra antígenos heterofilos, é comumente usado em estudos OPKA14,15,37, e está prontamente disponível comercialmente.
Achamos que o OAA é quantitativo e altamente reprodutível. Usamos-no para complementar estudos envolvendo ensaios de ligação de ligantes, como os ELISAs, que apenas quantifica os níveis totais de IgG, mas não distingue entre anticorpos funcionais e não funcionais. OAA pode ser usado para complementar outros ensaios funcionais (por exemplo, atividade bactericida séum e ensaios de neutralização de toxinas) para mostrar a funcionalidade diferente dos anticorpos gerados pela vacina16,38. O desenvolvimento da OAA aumentou nosso repertório de estudos de imunogenicidade para avaliar vacinas e terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não possuem uma associação comercial ou outra que possa representar um conflito de interesses.
Acknowledgments
J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander projetaram os procedimentos descritos no manuscrito. J. Chua e T. Putmon-Taylor realizaram os experimentos. D. Chabot realizou análise de dados. J. Chua escreveu o manuscrito.
Os autores agradecem a Kyle J. Fitts pela excelente assistência técnica.
O trabalho contou com o apoio da Agência de Redução de Ameaças de Defesa da CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plano número 921175.
Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são dos autores e não são necessariamente endossadas pelo Exército dos EUA. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Defesa, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam o endosso do Governo dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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