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Artículo de método
Aquí, presentamos un protocolo para la ingeniería de sensores-actuadores de proteínas intracelulares codificados genéticamente. El dispositivo detecta específicamente las proteínas diana a través de anticuerpos intracelulares (intracuerpos) y responde activando la salida transcripcional de genes. Se construye un marco general para reemplazar rápidamente los intracuerpos, lo que permite la detección rápida de cualquier proteína deseada, sin alterar la arquitectura general.
Las proteínas pueden funcionar como biomarcadores de condiciones patológicas, como enfermedades neurodegenerativas, infecciones o síndromes metabólicos. La ingeniería de células para detectar y responder a estos biomarcadores puede ayudar a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a las patologías, así como a desarrollar nuevas terapias basadas en células. Si bien se han desarrollado varios sistemas que detectan proteínas extracelulares, faltaba un marco modular que pueda rediseñarse fácilmente para detectar diferentes proteínas intracelulares.
Aquí, describimos un protocolo para implementar una plataforma genética modular que detecta proteínas intracelulares y activa una respuesta celular específica. El dispositivo funciona con anticuerpos intracelulares o pequeños péptidos para detectar con alta especificidad la proteína de interés, desencadenando la activación transcripcional de los genes de salida, a través de un módulo de actuación basado en la proteasa TEV (TEVp). TEVp es una proteasa viral que escinde selectivamente péptidos afines cortos y es ampliamente utilizada en biotecnología y biología sintética por su alta ortogonalidad al sitio de escisión. Específicamente, diseñamos dispositivos que reconocen y responden a biomarcadores de proteínas de infecciones virales y enfermedades genéticas, incluida la huntingtina mutada, la serina-proteasa NS3, las proteínas Tat y Nef para detectar infecciones por la enfermedad de Huntington, el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), respectivamente. Es importante destacar que el sistema se puede adaptar a mano para obtener el resultado funcional deseado de entrada-salida, como lecturas fluorescentes para biosensores, estimulación de la presentación de antígenos para la respuesta inmunitaria o inicio de la apoptosis para eliminar células enfermas.
El estudio y las modulaciones de las respuestas celulares a través de circuitos genéticos controlables son objetivos importantes en biología sintética 1,2,3 para el desarrollo de herramientas prospectivas con aplicaciones biológicas o médicas relevantes en cáncer 4, infecciones5, enfermedades metabólicas6 e inmunología7.
La reprogramación de las funciones celulares en respuesta a señales específicas requiere el diseño de....
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1. Principios de diseño para la construcción y prueba del dispositivo sensor-actuador
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Una arquitectura para la detección modular de proteínas intracelulares
Como se muestra en la Figura 1, el dispositivo está compuesto por: 1) intracuerpo 1 conectado al marcador fluorescente anclado a la membrana (mKate) y al sitio de escisión de TEVp (TCS), seguido de un activador de transcripción GAL4VP16 (TF); 2) intracuerpo 2 fusionado a la proteasa TEV (TEVp), libre en el citosol; 3) un promotor sintético que responde a GAL4VP16, impulsando la expresión de un gen repo.......
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Hasta hace poco, el interrogatorio de células basado en el entorno intracelular se realizaba con sistemas desarrollados de novo para objetivos específicos. El presente protocolo describe un ejemplo del enfoque de ingeniería celular más reciente para la detección y actuación de proteínas en un dispositivo, que se puede adaptar rápidamente a los nuevos biomarcadores deseados.
Este sistema pionero detecta proteínas intracelulares y proporciona una salida específi.......
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Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Este trabajo contó con el apoyo del Istituto Italiano di Tecnologia.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AlexaFluor 647 ratón antihumano clon de anticuerpos HLA-A, B, C W6/32 | Biolegend | 311414 | Anticuerpos |
| Anexina V | LifeTechnologies | A35122 | Marcador de apoptosis |
| Attractene | Qiagen | 301005 | Reactivo de transfección |
| BD Falcon Tubos de fondo redondo | BD Biosciences | 352053 | Tubos FACS |
| Doxiciclina | Clonetech | - | Cultivo Celular: Medicamentos |
| Dulbecco's modificado Eagle medium | Cellgro | 10-013-CM | Cultivo Celular: Medio |
| Evos Sistema de Imagen Celular | Life Technology | EVOS M5000 | Sistemas de Imagen; Clones moleculares infecciosos |
| Software FACSDiva8 | BD Biosciences | 659523 | software FACS |
| Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4385612 reacción de qPCR | |
| FBS (Suero Bovin Fetal) | Atlanta BIO | S11050 | Cultivo celular: medio |
| Gateway Sistema | Technologies-Construcción | de plásmidos | |
| Golden Gate Sistema | de construcción interna | de | plásmidos |
| HEK 293FT | Invitrogen | R70007 | Cultivo celular: |
| Células Sistema de clonación por infusión | Clonetech | 638920 | Construcción de plásmidos |
| Reactivo JetPRIME Polyplus | transfección Polyplus 114-15 | Reactivo de transcfección | |
| Jurkat Cells | ATCC | TIB-152 | Cultivo celular: Células |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | Cultivo celular: |
| Lipofectamina LTX media con reactivo Plus | Reactivo de transfección | Thermo Fisher Scientific | 15338030 |
| LSR Citómetro de flujo Fortessa (405, 488 y 561 láseres nm) | BD Biosciences | 649225 | Citómetro de flujo |
| MicroAmp Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos (0.1 mL) | ThermoFisher Scientific | 4346907 | reacción de qPCR |
| Sistema de transfección de neón | Life Technologies | MPK10025 | Reactivo de transfección |
| Aminoácidos no esenciales | HyClone | SH3023801 | Cultivo celular: Medio |
| Opti-MEM I medio de suero reducido | Life Technologies | 31985070 | Medio de transfección |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | Cultivo celular: Medio |
| QuantiTect Kit de transcripción inversa | Qiagen | 205313 | Rev Transcriptasa |
| kit RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | kit de extracción de ARN |
| RPMI-1640 | ATCC | ATCC 30 2001 | Cultivo celular: Medium |
| Shield | Clonetech | 632189 | Cultivo celular: Medicamentos |
| SpheroTech RCP-30-5-A perlas | Spherotech | RCP-30- 5A-2 Configuración de | compensación |
| StepOnePlus 7500 Máquina rápida | Biosystems aplicados | 4351106 | reacción de qPCR |
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