Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Ingeniería de sensores de proteínas intracelulares en células de mamíferos

2.9K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/60878

⸱

28 de abril de 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la ingeniería de sensores-actuadores de proteínas intracelulares codificados genéticamente. El dispositivo detecta específicamente las proteínas diana a través de anticuerpos intracelulares (intracuerpos) y responde activando la salida transcripcional de genes. Se construye un marco general para reemplazar rápidamente los intracuerpos, lo que permite la detección rápida de cualquier proteína deseada, sin alterar la arquitectura general.

Resumen

Las proteínas pueden funcionar como biomarcadores de condiciones patológicas, como enfermedades neurodegenerativas, infecciones o síndromes metabólicos. La ingeniería de células para detectar y responder a estos biomarcadores puede ayudar a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a las patologías, así como a desarrollar nuevas terapias basadas en células. Si bien se han desarrollado varios sistemas que detectan proteínas extracelulares, faltaba un marco modular que pueda rediseñarse fácilmente para detectar diferentes proteínas intracelulares.

Aquí, describimos un protocolo para implementar una plataforma genética modular que detecta proteínas intracelulares y activa una respuesta celular específica. El dispositivo funciona con anticuerpos intracelulares o pequeños péptidos para detectar con alta especificidad la proteína de interés, desencadenando la activación transcripcional de los genes de salida, a través de un módulo de actuación basado en la proteasa TEV (TEVp). TEVp es una proteasa viral que escinde selectivamente péptidos afines cortos y es ampliamente utilizada en biotecnología y biología sintética por su alta ortogonalidad al sitio de escisión. Específicamente, diseñamos dispositivos que reconocen y responden a biomarcadores de proteínas de infecciones virales y enfermedades genéticas, incluida la huntingtina mutada, la serina-proteasa NS3, las proteínas Tat y Nef para detectar infecciones por la enfermedad de Huntington, el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), respectivamente. Es importante destacar que el sistema se puede adaptar a mano para obtener el resultado funcional deseado de entrada-salida, como lecturas fluorescentes para biosensores, estimulación de la presentación de antígenos para la respuesta inmunitaria o inicio de la apoptosis para eliminar células enfermas.

Introducción

El estudio y las modulaciones de las respuestas celulares a través de circuitos genéticos controlables son objetivos importantes en biología sintética 1,2,3 para el desarrollo de herramientas prospectivas con aplicaciones biológicas o médicas relevantes en cáncer 4, infecciones5, enfermedades metabólicas6 e inmunología7.

La reprogramación de las funciones celulares en respuesta a señales específicas requiere el diseño de interfaces inteligentes que vinculen la detección de cambios dinámicos extracelulares o intracelulares (entrada) con el procesamiento posterior, desencadenando una salida específica con fines de diagnóstico (es decir, genes reporteros) o para reconfigurar la respuesta celular (terapéutica). Las entradas detectadas por el módulo de detección pueden ser pequeños analitos8, proteínas 9,10,11 o microARN 11,12,13, específicos para el inicio o progresión de una enfermedad. Además, la regulación de circuitos complejos puede lograrse mediante el procesamiento de información de entrada múltiple, lo que aumenta el control estricto sobre la expresión de transgenes en respuesta a las condiciones definidas 14,15,16. Por ejemplo, los sensores basados en microARN pueden identificar tipos específicos de células, como las células cancerosas, induciendo su eliminación con la expresión de un gen apoptótico13. Dado que los microARN son fácilmente implementables en circuitos sintéticos de forma modular, representan un insumo ampliamente utilizado para los biosensores codificados genéticamente 12,13,17. Las proteínas también son un biomarcador válido para mutaciones genéticas, cáncer e infecciones, y de hecho se han descrito varios dispositivos de detección de proteínas extracelulares 18,19.

Muchos de los circuitos que detectan proteínas extracelulares se basan en el uso de receptores modificados, que unen un factor de transcripción (TF) a la membrana, fusionado a un sitio de escisión (TCS) sensible a TEVp. Una ventaja importante del TEVp es la especificidad de la escisión y la falta de interferencia con el procesamiento de proteínas endógenas. En estos sistemas, TEVp se fusiona con un segundo péptido que interactúa con el receptor diseñado al unirse a las moléculas extracelulares. Por lo tanto, las entradas externas inducen la escisión mediada por TEVp y la liberación de TF. Los sistemas que funcionan con este mecanismo son Tango/TEVp18, light-induced20 y Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)19. A pesar de los avances en la detección de proteínas extracelulares, la tecnología para detectar proteínas intracelulares de forma modular nunca antes se había realizado, con la limitación de pasar por muchas iteraciones de construcción y prueba para dispositivos individuales que responden a una proteína específica.

Nuestro sistema es la primera plataforma para la detección de proteínas intracelulares21. La modularidad está garantizada por el uso de intracuerpos que definen la especificidad con respecto al objetivo, mientras que la reprogramación celular está mediada por TEVp. En concreto, un intracuerpo está unido a la membrana y fusionado con el C-terminal a una proteína fluorescente mKate, una TCS y una TF (proteína de fusión 1); el segundo intracuerpo se fusiona con el TEVp y se localiza en el citosol (proteína de fusión 2) (Figura 1).

Por lo tanto, la interacción entre dos intracuerpos y la proteína diana se produce en el citoplasma y conduce a la escisión de TCS por TEVp, lo que resulta en la translocación de TF al núcleo para activar la salida funcional. El dispositivo de detección y actuación se probó con éxito para cuatro proteínas intracelulares específicas de la enfermedad: la serina proteasa NS3 expresada por el virus del VHC22, las proteínas Tat y Nef de la infección por VIH23,24 y la huntingtina mutada (HTT) de la enfermedad de Huntington25. La expresión de salida incluye reporteros fluorescentes, gen apoptótico (hBax)26 e inmunomoduladores (XCL-1)27. Demostramos que el sistema también puede perjudicar la funcionalidad patológica de sus objetivos. Por ejemplo, el dispositivo que responde a Nef interfiere con la propagación de la infección viral al secuestrar la proteína objetivo y revertir la modulación negativa del receptor HLA-I en las células T infectadas24. La plataforma de detección-activación descrita es la primera de este tipo para la detección de proteínas intracelulares y puede implementarse potencialmente para detectar la expresión anormal de proteínas, modificaciones postraduccionales o epigenéticas, con fines diagnósticos y terapéuticos20.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Principios de diseño para la construcción y prueba del dispositivo sensor-actuador

  1. Selecciona una proteína que te interese.
    NOTA: Diseñamos un sistema para proteínas localizadas en el citoplasma o que se desplazan entre el citoplasma y otros compartimentos.
  2. Seleccione dos intracuerpos que se unan a diferentes epítopos de la proteína diana. En nuestro estudio seleccionamos proteínas para las cuales los intracuerpos ya estaban desarrollados y probados 28,29,30,31. Cuando no se dispone de intracuerpos, estos deben ser de nuevo desarrollo.
    NOTA: Una alternativa a los intracuerpos pueden ser otras moléculas que interactúen con la proteína de interés. Por ejemplo, el dispositivo de detección Nef incluye un intracuerpo (sdAb19) y el dominio SH3 de una proteína tirosina quinasa32 p59fyn.
  3. Diseño in silico de los plásmidos con secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión.
    NOTA: El software para el diseño de plásmidos está disponible de forma gratuita o se puede comprar.
    1. Genere secuencias que incluyan los siguientes módulos: etiqueta de membrana, marcador fluorescente (p. ej., mKate), intracuerpo, TCS y TF para la proteína de fusión 1, e intracuerpo y TEVp para la proteína de fusión 2.
      NOTA: La construcción de una nueva arquitectura basada en la interacción de varios componentes requiere atención a los parámetros que pueden maximizar la activación de la señal cuando se detecta la proteína objetivo. En concreto, nos centramos en la actividad de TEVp y la flexibilidad de las proteínas quiméricas para facilitar la interacción proteína-proteína (Tabla 1). Todas estas características se especifican en los siguientes puntos.
    2. Inserte un dominio enlazador (LD) flexible de glicina-serina entre el TCS intracorporal y/o el TEVp-intracorporal. La LD puede ser de longitud variable (0, 10 o 15 aminoácidos-AA).
    3. Proteína de fusión 1: Diseñe variantes que incluyan la TCS (S) de alta afinidad o la TCS (L) de baja afinidad para regular la actividad de escisión de TEVp. La expresión de este constructo es impulsada por un promotor constitutivo. Incluir el factor de transcripción GAL4VP16 en el C-terminal de TCS para permitir la translocación al núcleo tras la escisión de TEVp.
      NOTA: Utilizamos el promotor hEF1a, pero se pueden elegir otros promotores constitutivos.
    4. Proteína de fusión 2: utilice un promotor constitutivo (hEF1a) o inducible por doxiclicina (pTET) para ajustar la transcripción de TEVp. Utilice un dominio de degradación (DD) regulado por el escudo de molécula pequeña para modular la estabilidad de la proteína.
      NOTA: Se pueden elegir otros sistemas inducibles que ajusten la expresión de proteínas.
    5. Salida: Colocar un gen reportero aguas abajo del promotor de UAS que responde a GAL4VP16 factor de transcripción. Elija la salida de acuerdo con la aplicación del dispositivo (es decir, proteína fluorescente, citocina, etc.).
  4. Realice la clonación con cualquier estrategia preferida. Aquí, construimos plásmidos con tecnologías de puerta dorada o puerta de enlace.
  5. Pruebe las diversas configuraciones del dispositivo en las líneas celulares deseadas mediante transfección transitoria. Co-transfectar las células con los plásmidos obtenidos para las proteínas de fusión 1 y 2 y el gen reportero fluorescente, como UAS-EYFP. La proteína de fusión 1 incluye una proteína fluorescente roja (mkate) utilizada como marcador de transfección.
    NOTA: Comience con líneas celulares fáciles de transfectuar, como células HEK293FT para probar los dispositivos.
    1. Transfección en células HEK293FT. Siembre 2 x 105 células en una placa de 24 pocillos con 500 μL de DMEM. Transfectar células con 300 ng de ADN total utilizando reactivo de transfección, agitar la mezcla e incubar en RT durante 20 minutos.
      1. Coloque las células en una incubadora de CO2 a 37 °C/5%. Agregue el medio de cultivo fresco 24 h después de la transfección.
    2. Transfección en celdas de Jurkat. Utilice 3 x 105 celdas en 500 μL de medio de cultivo celular RPMI para una placa de 24 pocillos. Realice la electroporación siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice 2-4 μg de ADN total para cada muestra. Añadir 500 μL de medio de cultivo celular fresco 24 h después de la transfección.
      1. Durante la electroporación, coloque las células y la mezcla de ADN en hielo. A continuación, coloque las células en la incubadora de CO2 a 37 °C/5%.
        NOTA: Se pueden elegir diferentes líneas celulares y métodos de transfección de acuerdo con la aplicación específica del dispositivo.
  6. Adquirir imágenes de microscopio para obtener una comprensión cualitativa de la funcionalidad del dispositivo. Confirmar la localización de la membrana de la proteína de fusión 1 mediante la detección de la señal fluorescente (mkate) en las proximidades de la membrana celular. Visualizar la salida fluorescente (EYFP) en presencia o ausencia (control negativo-NC) de la proteína diana.
    1. Utilice el sistema de imágenes celulares equipado con cubos de luz Tx Red y GFP para detectar las proteínas fluorescentes mKate y EYFP. Utilice el objetivo 10x o 20x.
      NOTA: Utilice células no transfectadas para asegurarse de que no haya autofluorescencia.
  7. Analizar la transfección con citometría de flujo (FACS).
    NOTA: Consulte el Protocolo 2 para la preparación de muestras.
    1. Evalúe los dispositivos en presencia de la proteína diana. Crear una matriz experimental que combine variantes de la proteína de fusión 1 y 2, modulando TEVp con (i) promotor constitutivo de hEf1a, (ii) promotor de TET inducible por doxiciclina y (iii) escudo para la estabilidad de la proteína. Añadir doxiciclina y blindar a concentraciones (0-1000 nM).
    2. Realizar análisis FACS para comparar la inducción de pliegues de EYFP entre muestras con o sin proteína de interés.
      NOTA: La inducción de pliegue más alta corresponde a la mayor sensibilidad de entrada en el modo ON (presencia de la proteína objetivo) en comparación con el modo OFF (ausencia de la proteína objetivo).
  8. Pruebe la funcionalidad del dispositivo con respecto a las aplicaciones deseadas.
    1. Realice análisis FACS para medir los niveles de proteínas de salida o apoptosis, u otros ensayos relevantes.
    2. Realice el análisis RT PCR si la parte de salida del dispositivo regula los niveles de expresión de los genes objetivo. Calcule 2-ddCT con respecto al gen de mantenimiento (GAPDH o equivalente) y compare el cambio de pliegue de la expresión de salida en los modos ON y OFF.

2. Preparación de la muestra para el análisis por citometría de flujo

  1. Realizar análisis cuantitativos de dispositivos de proteínas con citómetro de flujo (FACS) 48 h después de la transfección.
    1. Aspire el medio DMEM y lave las células HEK293FT con 300 μL de PBS. Añadir 100 μL de tripsina y dejar en la incubadora deCO2 a 37 °C/5% durante 2-4 minutos.
      NOTA: Las células Jurkat no requieren tripsina.
    2. Añadir 400 μL de medio DMEM sin rojo fenol y resuspender las células para evitar la formación de grumos. Transferencia en tubos FACS.
    3. Utilice un citómetro de flujo equipado con láseres de 405, 488 y 561 nm.
    4. Recopile entre 30.000 y 100.000 eventos seleccionados de la población de células vivas utilizando las siguientes configuraciones de citómetro: láser de 488 nm y filtro de paso de banda de 530/30 nm para EYFP/EGFP, láser de 561 nm y filtro de 610/20 nm para mKate, y láser de 405 nm, filtro de 450/50 para EBFP.
      NOTA: Para configurar el citómetro de flujo, incluya células no transfectadas y células transfectadas con proteínas fluorescentes individuales.
    5. Realice el análisis de las muestras recolectadas utilizando el software preferido (por ejemplo, el software DIVA, Flowjo o el método TASBE33).

3. Caracterización del dispositivo sensor-actuador del VHC

  1. Seleccione los intracuerpos para detectar la proteína NS3. scFv35 y scFv162 se unen a dos epítopos diferentes y, por lo tanto, se eligieron.
  2. Diseño y prueba de variantes del dispositivo que responde a NS3 siguiendo el razonamiento descrito en el paso 1.3 (por ejemplo, proteína de fusión 1: etiqueta de membrana, mKate, fragmento de cadena única intracuerpo scFv35, LD0, TCS-L y TF GAL4VP16; Proteína de fusión 2: fragmento de cadena única intracorporal scFv162, LD0 y TEVp; Salida: UAS-EYFP o UAS-hBax (apoptosis); NS3 (ver Tabla 2)).
  3. Pruebe las construcciones en HEK293FT celdas.
    NOTA: Para cada experimento, establezca un control negativo que sea la entrega del dispositivo y la cuantificación de salida en ausencia de la proteína de interés.
    1. Pruebe los dispositivos para TEVp bajo un promotor constitutivo en presencia o ausencia de NS3. Realice la transfección de la proteína de fusión 1 (paso 1.3.3), la proteína de fusión 2 (paso 1.3.4) y el paso de salida de EYFP (1.3.5) en células HEK293FT como se describe en el paso 1.5.1. Analizar las muestras 48 h post-transfección midiendo el reportero fluorescente (EYFP) por citometría de flujo (Protocolo 2).
    2. Evaluar la interacción intracuerpo-NS3 por mKate y la colocalización de BFP utilizando la proteína de fusión BFP-NS3. Transfectar células con proteína de fusión 1 que incluye mKate, y con una BFP-NS3. 48 h después de la transfección, observe las células en el microscopio confocal (objetivo 63x) para probar la colocalización de proteínas fluorescentes.
      NOTA: Utilice un BFP (no fusionado con NS3) como control negativo. En esta condición, BFP debe mostrar una localización celular difusa y no debe colocalizarse con el mKate unido a la membrana.
    3. Pruebe los dispositivos para TEVp bajo el promotor pTET en presencia o ausencia de NS3. Comparar EYFP en ausencia y presencia de NS3. Co-transfecte células con la proteína de fusión 1 (paso 1.3.3), la proteína de fusión 2 (paso 1.3.4) y la salida de EYFP (paso 1.3.5) utilizando el protocolo descrito en el paso 1.5.1. Las transfecciones se realizan en presencia o ausencia de NS3. Analizar las muestras 48 h post-transfección midiendo el reportero fluorescente (EYFP) por citometría de flujo (Protocolo 2).
  4. Eliminación de células de prueba impulsada por el dispositivo NS3.
    1. Reemplace la salida de EYFP con el gen apoptótico hBax.
    2. Repita el paso 3.3.3. Recoja las células 48 h después de la transfección y lávelas con PBS antes de comenzar el ensayo.
    3. Realizar el ensayo de apoptosis con anexina V conjugada con azul del Pacífico. Tinción de células con marcador apoptótico anexina V (conjugado con 2,5 μL de azul del Pacífico) diluido en tampón aglutinante (relación de volumen 1:20) durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Analice las células por citometría de flujo. Calcule el nivel de apoptosis dentro de la población como el número de células positivas de Pacific-Blue (Anexina V).

4. Caracterización del dispositivo sensor-actuador del VIH sensible a Nef

  1. Seleccione los intracuerpos que se unen a Nef. Se eligieron sdAb19 y SH3 intracuerpo de un solo dominio, ya que se unen a diferentes epítopos.
    NOTA: SH3 no es un intracuerpo, sino un dominio de la proteína tirosina quinasa p59fyn que interactúa fisiológicamente con Nef.
  2. Diseño y prueba de variantes de dispositivos sensibles a Nef siguiendo la lógica descrita en el paso 1.3 (por ejemplo, Proteína de fusión 1: etiqueta de membrana, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L y GAL4-VP16; Proteína de fusión 2: SH3, LD0 y TEVp; Salida: UAS-EYFP; Nef (ver Tabla 3)).
  3. Pruebe los dispositivos en las células T HEK293FT y Jurkat.
    NOTA: Para cada experimento establecemos un control negativo que es la entrega del dispositivo y la cuantificación de salida en ausencia de la proteína de interés
    1. Transfección de HEK293FT: Siga el procedimiento descrito en el paso 1.5.1 en presencia o ausencia de Nef.
    2. Transfección de linfocitos T Jurkat: Siga el procedimiento descrito en el paso 1.5.2 en presencia o ausencia de Nef.
    3. 48h después de la transfección, analizar las muestras con citómetro de flujo como se describe en el Protocolo 2.
  4. Infectar células Jurkat con cepas LAI del VIH para la detección del VIH.
    1. Prepare las cepas virales al menos 48 h antes del experimento. Use el virus obtenido de la transfección de células HEK-293T con clones moleculares infecciosos (programa de reactivos para el SIDA de los NIH) y reactivos comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante. Concentrar el virus después de 40 h por ultracentrifugación durante 1 h, 64,074 x g, 4 °C en sacarosa al 20% para evitar proteínas virales sin partículas. Titulación de stocks virales con HIV-1 p24 ELISA.
    2. Infectar células con cepas de VIH-1 con 500 ng de inóculo p24. 40 h post-infección cuantificar el porcentaje de células infectadas mediante la detección de la proteína viral p24 con el anticuerpo conjugado KC57-FITC y la realización de análisis de citometría de flujo.
    3. Tiñir las células con el clon de anticuerpos conjugados W6/32 de AlexaFluor 647 contra HLA-A, B, C. Fije las células y analícelas en un citómetro de flujo. Modulación descendente mediada por Nef de HLA-I en células T Jurkat en presencia o ausencia del dispositivo sensor de proteínas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Una arquitectura para la detección modular de proteínas intracelulares
Como se muestra en la Figura 1, el dispositivo está compuesto por: 1) intracuerpo 1 conectado al marcador fluorescente anclado a la membrana (mKate) y al sitio de escisión de TEVp (TCS), seguido de un activador de transcripción GAL4VP16 (TF); 2) intracuerpo 2 fusionado a la proteasa TEV (TEVp), libre en el citosol; 3) un promotor sintético que responde a GAL4VP16, impulsando la expresión de un gen repo...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Hasta hace poco, el interrogatorio de células basado en el entorno intracelular se realizaba con sistemas desarrollados de novo para objetivos específicos. El presente protocolo describe un ejemplo del enfoque de ingeniería celular más reciente para la detección y actuación de proteínas en un dispositivo, que se puede adaptar rápidamente a los nuevos biomarcadores deseados.

Este sistema pionero detecta proteínas intracelulares y proporciona una salida específi...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Istituto Italiano di Tecnologia.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AlexaFluor 647 ratón antihumano clon de anticuerpos HLA-A, B, C W6/32Biolegend311414Anticuerpos
Anexina VLifeTechnologiesA35122Marcador de apoptosis
AttracteneQiagen301005Reactivo de transfección
BD Falcon Tubos de fondo redondoBD Biosciences352053Tubos FACS
DoxiciclinaClonetech-Cultivo Celular: Medicamentos
Dulbecco's modificado Eagle mediumCellgro10-013-CMCultivo Celular: Medio
Evos Sistema de Imagen CelularLife TechnologyEVOS M5000Sistemas de Imagen; Clones moleculares infecciosos
Software FACSDiva8BD Biosciences659523software FACS
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612 reacción de qPCR
FBS (Suero Bovin Fetal)Atlanta BIOS11050Cultivo celular: medio
Gateway SistemaTechnologies-Construcciónde plásmidos
Golden Gate Sistemade construcción internadeplásmidos
HEK 293FTInvitrogenR70007Cultivo celular:
Células Sistema de clonación por infusiónClonetech638920Construcción de plásmidos
Reactivo JetPRIME Polyplustransfección Polyplus 114-15Reactivo de transcfección
Jurkat CellsATCCTIB-152Cultivo celular: Células
L-glutaminaSigma-AldrichG7513-100MLCultivo celular:
Lipofectamina LTX media con reactivo PlusReactivo de transfecciónThermo Fisher Scientific15338030
LSR Citómetro de flujo Fortessa (405, 488 y 561  láseres nm)BD Biosciences649225Citómetro de flujo
MicroAmp Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos (0.1  mL)ThermoFisher Scientific4346907reacción de qPCR
Sistema de transfección de neónLife TechnologiesMPK10025Reactivo de transfección
Aminoácidos no esencialesHyCloneSH3023801Cultivo celular: Medio
Opti-MEM I medio de suero reducidoLife Technologies31985070Medio de transfección
Penicilina/EstreptomicinaSigma-AldrichP4458-100MLCultivo celular: Medio
QuantiTect Kit de transcripción inversaQiagen205313Rev Transcriptasa
kit RNeasy Mini KitQiagen74106kit de extracción de ARN
RPMI-1640ATCCATCC 30­ 2001Cultivo celular: Medium
ShieldClonetech632189Cultivo celular: Medicamentos
SpheroTech RCP-30-5-A perlasSpherotechRCP-30- 5A-2 Configuración decompensación
StepOnePlus 7500 Máquina rápidaBiosystems aplicados4351106reacción de qPCR
Life

Referencias

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, Clifton, N.J. 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, New York, N.Y. 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , New York, N.Y. 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477(2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364(2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881(2018).
  22. Lin, C. HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232(2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448(2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852(2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93(2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, London, England : 1993. 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Proteasa TEVplataforma genéticadetección basada en anticuerposreconocimiento de péptidosactivación transcripcionalenfermedad de Huntingtonvirus de la hepatitis Cdetección del VIH

Este artículo ha sido publicado

Video próximamente

Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.