Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser

Resumen

Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.

Resumen

Las técnicas de micropatrón se han utilizado ampliamente en la biología celular para estudiar los efectos del control de la forma y el tamaño de las células en la determinación del destino celular a una sola resolución de celda. Las técnicas actuales de micropatrón de una sola célula de última generación implican litografía suave e impresión de microcontacto, que es una tecnología poderosa, pero requiere habilidades de ingeniería entrenadas y cierto soporte de instalaciones en microfabricación. Estas limitaciones requieren una técnica más accesible. Aquí, describimos un método simple y libre de litografía alternativo: patrón de células únicas basado en plantillas. Proporcionamos procedimientos paso a paso que incluyen diseño de plantillas, fabricación de hidrogel de poliacrilamida, incorporación de proteínas a base de plantillas y chapado y cultivo celular. Este método simple se puede utilizar para patrones de una matriz de hasta 2.000 celdas. Demostramos el patrón de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos únicos (hiPSC) con formas celulares distintas, de un cuadrado 1:1 a un rectángulo adulto similar a 7:1. Este patrón de una sola célula basado en plantillas es libre de litografía, técnicamente robusto, conveniente, barato y, lo que es más importante, accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado.

Introducción

La llegada de los hiPSC y el posterior desarrollo de protocolos para su diferenciación dirigida en diferentes tipos de células han hecho posible el estudio del desarrollo y la enfermedad a nivel molecular y específico del paciente, utilizando específicamente cardiomiocitos iPSC derivados del paciente (iPSC-CM) para modelar cardiomiopatías^1,,2. Sin embargo, una limitación importante para estudiar el desarrollo y la fisiología utilizando el sistema iPSC y otros modelos in vitro es la ausencia de un microambiente estructurado. In situ, las celdas se someten a las restricciones de la matriz extracelular (ECM), así....

Protocolo

1. Fabricación de plantillas basadas en poliimida de patrón negativo

1. Genere un patrón(figura 2A) en formato .dxf utilizando software de diseño asistido por ordenador (por ejemplo, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
   1. Genere un círculo (diámetro de 22 mm) para delinear el borde de la plantilla.
   2. Dibuje una forma llena de sólido o el patrón deseado.
   3. Incluya una letra quiral (por ejemplo, R) para marcar la parte frontal de las plantillas.
      NOTA: Por ejemplo, se genera una matriz de cuadrados y rectángulos para patrones iPSC-CM en niveles de una sola celda y de par de celdas. Los archivos ....

Resultados

Se ha demostrado la fabricación de plantillas que contienen una matriz de cuadrados o rectángulos (Figura 4A). Siguiendo este protocolo, obtuvimos islas proteicas de matriz de patrones(Figura 4B y Figura 5A)y células (Figura 4C). La concentración de la solución de proteína de matriz subóptima dio lugar a patrones subóptimos(Figura 5B). Es fundamental utilizar la parte front.......

Discusión

Describimos un método de micropatrón basado en plantillas libre de litografía que permite un patrón eficaz de las células adherentes. En este protocolo, demostramos el patrón de hiPSC-CM en diferentes relaciones longitud-anchura mediante el micropatrón de islas de proteína de matriz de membrana de sótano en hidrogeles de poliacrilamida con rigidez tisular fisiológica o patológicamente relevante o sustratos de elastómero a base de silicio. Este método es relativamente simple y altamente accesible para cualquier investigad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (polvo)	Sigma-Aldrich	516155
solución de acrilamida 40% (solución)	Sigma-Aldrich	A-4058-100mL
Lámpara UV de banco UVP UVP 365 nm	UVP	UVP 95-0042-07, XX-15L
placa de cultivo BioFlex	FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC		Placa de 6 pocillos con sustrato de elastómero de silicona
Solución de bis-acrilamida al 2% (solución)	Sigma-Aldrich	M1533-25mL
Corning cubrevasos cuadrados, n.º 2, W × L 22 mm y veces; 22 mm	Sigma	CLS285522
Irgacure (2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona) (polvo)	Sigma-Aldrich	410896
Matrigel Corning		356231	solución de proteínas de matriz de membrana basal
Metil sulfóxido, 99.7+%, Extra Seco, AcroSeal, ACROS Organics	Filtro Acros Organics	326881000
Millex (13mm) unidad con Membrana Durapore	Millipore SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µ m)	Fisher Scientific	SCGP00525
Stencils	Potomac	diseño
Sulfo-SANPAH	ThermoFisher Scientific	22589
TrypLE Select 10x	ThermoFisher Scientific	A1217702	Enzima utilizada para la limpieza de plantillas