Artículo de método

Imágenes en Vivo de las eficiencias de transducción del péptido de orientación cardíaca

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DOI:

10.3791/60895

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11 de junio de 2020

 , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

En este artículo

Resumen

Describimos protocolos para evaluar el grado de transducción mediante péptidos penetrantes celulares que utilizan sistemas de imágenes ex vivo seguidos de incrustación de parafina, sección y microscopía fluorescente confocal utilizando péptido de orientación cardíaca como ejemplo. En nuestro protocolo, un solo animal puede ser utilizado para adquirir ambos tipos de evaluación por imágenes de los mismos órganos, reduciendo así el número de animales necesarios para los estudios a la mitad.

Resumen

Desde la descripción inicial de los dominios de transducción de proteínas, también conocidos como péptidos penetrantes celulares, hace más de 25 años, ha habido un intenso interés en desarrollar estos péptidos, especialmente los específicos de las células, como vectores novedosos para la entrega de materiales diagnósticos y terapéuticos. Nuestro trabajo pasado con la visualización de fagos identificó un novedoso péptido de 12 aminoácidos de largo que denominamos péptido de orientación cardíaca (CTP) debido a su capacidad para transducir el tejido cardíaco normal in vivo con una absorción máxima vista en tan solo 15 minutos después de una inyección intravenosa. Hemos realizado estudios detallados de biodistribución mediante la inyección de CTP etiquetado con cianina fluorófora5.5, lo que le permite circular durante varios períodos de tiempo, y eutanasia, fijación y seccionamiento de múltiples órganos seguidos de imágenes de microscopía fluorescente. En esta publicación, describimos estos procesos, así como imágenes ex vivo de órganos cosechados utilizando en detalle un sistema de imágenes in vivo. Proporcionamos metodologías y prácticas detalladas para llevar a cabo estudios de transducción, así como de biodistribución utilizando CTP como ejemplo.

Introducción

La membrana plasmática celular es una barrera semipermeable que es esencial para la integridad celular y la supervivencia y sirve para regular el interior de la célula mediante el control del movimiento de sustancias en la célula. Aunque es vital para la supervivencia, también presenta una barrera para la entrega de carga a la célula. En 1988, se demostró que el transactivador de la proteína de transcripción (Tat) del virus de inmunodeficiencia humana entra en las células cultivadas y promueve la expresión génica viral1,,2, con los dominios responsables de esta transducción limitados a una región de 13 aminoácidos ricos en arginina y lisina de la tercera hélice3 Estos fueron así llamados péptidos penetrantes de células (CPP). Esto fue seguido por una investigación que muestra la capacidad del péptido Tat para llevar la gálatas funcional en múltiples tipos de células4. Desde la descripción inicial, el número de péptidos penetrantes de células ha aumentado drásticamente. Estos dominios de transducción son péptidos cortos sintéticos o de origen natural, típicamente de 6 a 20 aminoácidos de largo, que son capaces de transportar cargas funcionales a través de las membranas celulares. Estas cargas pueden variar desde otros pequeños péptidos, proteínas de longitud completa, ácidos nucleicos, nanopartículas, partículas virales, moléculas fluorescentes y radioisótopos5. Los CPP iniciales descritos no eran específicos de la célula, con Tat siendo tomado por múltiples tipos de células e incluso cruzando la barrera blood - brain4,por lo tanto limitando su potencial terapéutico. Con el fin de identificar los CPP específicos de las células, los investigadores han llevado a cabo la exhibición de fagos utilizando bibliotecas de fagos grandes disponibles comercialmente6. Nuestro propio trabajo utilizando una metodología de visualización de fagos combinatoria in vitro e in vivo llevó a la identificación de un CPP llamado péptido de orientación cardíaca (CTP)7, un 12 aminoácidos, péptido no naturalmente (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) que se dirige al corazón con absorción máxima a 15 minutos después de una inyección intravenosa periférica8. Utilizando la colocación inmunofluorescente con actina, un marcador intracelular y la exclusión de la laminina, un marcador de membrana celular, demostramos que la CTP se internaliza en cardiomiocitos de ratón después de una inyección intravenosa7. Además, incubamos cardiomiocitos de golpes de células madre de células madre inducidas por humanos con CTP de doble etiqueta, etiquetados con 6-carboxicfluoresceína en su C-terminus y rhodamine en su N-terminus a través de un enlace de éster que sólo podría ser cortado por esterasas intracelulares. Se observó una rápida acumulación de rhodamine en cardiomiocitos batidos en 15 min en microscopía confocal8.

En este artículo, presentamos dos metodologías gratuitas que se pueden utilizar para realizar un seguimiento de la biodistribución y confirmar la internalización específica de los tejidos de los CPP utilizando CTP como ejemplo. Para estas metodologías, CTP fue sintetizado, etiquetado fluorescentemente en el N-terminus con cianina5.5 (CY5.5), y amida-capped en el C-terminus para una mayor estabilidad del péptido. Las dos metodologías utilizadas son sistemas de imágenes ópticas fluorescentes in vivo y microscopía fluorescente de secciones tisulares. Ambos métodos son muy útiles para estudiar la biodistribución, la absorción y la eliminación de CPP con etiqueta fluorescente. La ventaja de evaluar la biodistribución utilizando estos métodos sobre otros, como la tomografía por emisión de un solo fotón (SPECT) o la tomografía por emisión de positrones (PET), es que no hay necesidad de radioetiquetar el tiempo intensivo de los CPP en comparación con el etiquetado fluorescente, que es relativamente fácil y en uso rutinario en todas las instalaciones de síntesis de péptidos. El uso de imágenes in vivo produce rápidamente datos de biodistribución en el contexto de un sistema vivo, mientras que el seccionamiento proporciona una mayor información en profundidad sobre la absorción de péptidos y la localización dentro de las células a través de la preservación de detalles morfológicos. Este protocolo se puede aplicar a una amplia variedad de órganos y tejidos como el corazón, pulmón, hígado, riñón, cerebro, bazo, estómago, intestino grueso, intestino delgado, músculo esquelético, hueso, testículos / ovarios, y los ojos.

   

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh aprobó todos los protocolos de animales especificados en esta publicación antes de emprender cualquiera de estos experimentos con animales.

NOTA: Este protocolo detalla cómo realizar estudios de biodistribución ex vivo utilizando imágenes fluorescentes ópticas ex vivo seguidas de estudios de biodistribución in vivo mediante la inserción de los órganos en la parafina, la sección y la realización de microscopía fluorescente. Aunque CTP se utiliza como ejemplo, este método se puede aplicar a cualquier CPP con etiqueta fluorescente.

1. Imagen in vivo

  1. Sintetizar CTP utilizando técnicas de síntesis de fase sólida9,,10 de una instalación de síntesis de péptidos utilizando L-aminoácidos con un N-terminus etiquetado con Cy5.5 y C-terminus amida-capped para una mayor estabilidad.
    NOTA: Todos los CPP sintetizados deben caracterizarse utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y/o desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) antes de utilizar11.
  2. Hacer una solución de 1 mM o 10 mM de CTP en dimetil sulfóxido (DMSO), aliquot, y almacenar a -80 oC, protegido contra la luz.
    NOTA: Los péptidos se entregan como polvo liofilizado. El polvo liofilizado se puede almacenar a largo plazo (6 meses-2 años) en -20 oC, protegido contra la luz y en condiciones higroscópicas. Cuando se alícuota en DMSO y se almacena, se deben evitar los ciclos de congelación y descongelación.
  3. Pesar y anestesiar ratones hembra CD1 de 6 semanas de edad utilizando 2 l/g de peso tisular de una solución de ketamina/xiazina (100 mg/kg de ketamina y 20 mg/kg de xilazina) administrada por vía intramuscular (pata trasera) o intraperitonealmente (cuadrante inferior izquierdo).
    NOTA: Las soluciones de ketamina/xilazina deben ser frescas el día de su uso. La ketamina/xiazina no utilizada debe eliminarse adecuadamente y los volúmenes utilizados frente a los volúmenes registrados en un tronco, ya que la ketamina es una sustancia controlada. Se alcanzará un nivel adecuado de anestesia en 5-7 min, según se evalúe por falta de respuesta a un pellizco en la dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo.
  4. Calcular una dosis de 10 mg/kg de Cy5,5-CTP, diluir con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a no más de 200 l e inyectar ya sea retro-orbitalmente o a través de la inyección de vena de cola utilizando una jeringa de insulina (Figura 1A).
  5. Permita que el péptido circule durante el tiempo preespecificado, que va desde 15 min-6 h.
  6. Eutanasiar el ratón utilizando el método de inhalación deCO2 alto especificado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y abrir la cavidad torácica usando tijeras (Figura 1B).
  7. Utilice tijeras para colocar un pequeño pico en la pared lateral y libre de la aurícula derecha e inyecte 3 ml de fosfato de formalina tamponado al 10% utilizando una aguja de 26 G con el doble propósito de la perfusión de fijar los órganos del ratón y eliminar los glóbulos rojos(Figura 1C).
  8. Diseccionar el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones, el bazo, los intestinos gruesos, los intestinos delgados, la vejiga, los ovarios/testes, y el cerebro y colocarlos en pozos individuales de una placa de 12 pozos para imágenes ópticas ex vivo(Figura 1D).
  9. Inicie el software de adquisición de imágenes y haga clic en el botón Inicializar para preparar el sistema para las muestras de imágenes. Abra el asistente de imágenes, seleccione fluorescencia, luego filtre el par y, a continuación, seleccione el tinte Cy5.5 de la lista de tintes para aplicar filtros de excitación de 580 nm y de emisión de 620 nm. Seleccione los ajustes manuales para los parámetros de exposición y, a continuación, establezca la posición de la etapa en B, establezca el tiempo de exposición en 1 segundo, establezca el F/stop en 8 y establezca el binning en pequeño.
    NOTA: Los filtros de emisión de excitación variarán dependiendo de la etiqueta utilizada. La excitación y emisión de la etiqueta utilizada se puede introducir manualmente para que el software asigne filtros de excitación y emisión. Asegúrese de que las cuentas estén entre 600-60,000 para evitar la saturación. Dependiendo del sistema que se esté utilizando, la optimización automática de la adquisición podría estar disponible. Si el sistema tiene compensación para comparar imágenes adquiridas con diferentes ajustes, se pueden utilizar los ajustes automáticos. Si no hay ninguna compensación disponible, la configuración deberá determinarse, guardarse y utilizarse de forma coherente en todas las muestras.
  10. Cuando el sistema esté completamente inicializado, organice los órganos de interés en una placa de 12 pozos y colóquelo dentro de la cámara de imágenes ópticas, asegurándose de que las muestras estén dispuestas como se desee para las imágenes. Seleccione adquirir y, a continuación, seleccione una ubicación de guardado para las imágenes. La información sobre el ratón se puede escribir en la ventana emergente Editar etiquetas de imagen.
  11. Después de la toma de imágenes, retire las muestras de la cámara y guárdelas en fosfato de formalina tamponado al 10% en un volumen al menos 20 veces el volumen del tejido en viales de centelleo con protección de la luz a temperatura ambiente (RT).
  12. Cuantifique las imágenes estableciendo las unidades en Radiant Efficiency y luego seleccionando el ROI 4x3 y ajustando para encajar cada pozo en un cuadrado del ROI uniformemente, seguido de hacer clic en la medida. Abra la pestaña Mediciones de ROI de cuadrícula, seleccione exportar y guarde las medidas como un archivo .cvs.

2. Histología

NOTA: Siga los pasos 1.1 a 1.8 para obtener diferentes órganos. Alternativamente, los mismos órganos que fueron imageados se pueden colocar en formalina inmediatamente y se utilizan para la sección como se detalla a continuación.

  1. Almacene cada órgano individualmente en fosfato de formalina tamponado al 10% durante un mínimo de 48 horas antes del procesamiento para histología.
  2. Cuando los órganos estén suficientemente fijados después de 48 h, transfiera los órganos al procesamiento de tejidos y la incrustación de casetes y colóquelos en una máquina de procesamiento de tejidos (Figura 1E).
  3. Establecer la máquina de procesamiento para deshidratar el tejido en 70% etanol durante 30 min, seguido de 80% etanol durante 30 min, 95% etanol para 30 min, 95% etanol durante 30 min, 100% etanol durante 15 min, 100% etanol durante 20 min, y finalmente 100% etanol durante 20 min.
  4. Limpie el tejido en xileno 2x, con 30 min para cada tratamiento de xileno.
  5. Infiltrar el tejido despejado con cera de parafina 4x a 60oC durante 30 min con cada tratamiento.
  6. Incrustar en parafina utilizando moldes metálicos. Llene el molde con parafina fundida (mantenida a 65 oC) y transfiera a una placa fría. A medida que la parafina en la parte inferior del molde comienza a solidificarse, coloque el órgano en la parafina (Figura 1F).
  7. Coloque un cassette etiquetado en la parte superior del molde como un respaldo y rellene en exceso con parafina fundida. Dejar enfriar hasta que quede sólido. A continuación, guarde el bloque en un congelador de -20 oC durante la noche, lo que permite que la cera se encoja aún más para facilitar la extracción de los moldes.
    NOTA: Los bloques ahora se pueden almacenar en RT con protección lumída.
  8. Preparar un baño de agua a 38oC con agua destilada. Configure el microtomo con un ángulo de hoja de 6o y un espesor de sección de 10 m.
  9. Monte los bloques de tejido en el microtoma y comience a cortar hasta obtener secciones que contengan tejido. A continuación, coloque los bloques boca abajo en el agua durante 5 minutos o hasta que el tejido haya absorbido algo de humedad (por ejemplo, cuando aparezca un contorno blanco delgado del tejido en el bloque [Figura 1G]).
    NOTA: La cuchilla debe reemplazarse con frecuencia para garantizar la calidad de las secciones.
  10. Coloque el tejido sobre un bloque de hielo plano durante 10 minutos, luego devuélvalo al microtomo en la misma orientación que en el paso 2.9. Comience a tomar secciones y permita que las secciones truncadas formen cintas largas de 6 a 10 secciones cada una. Deseche cintas de parafina subóptimas hasta que se produzca una cinta de alta calidad de longitud suficiente para cubrir una diapositiva. Optimice el corte ajustando las velocidades de corte, la hidratación de los tejidos y la temperatura del baño de agua para evitar la cizalladura o arrugas de las secciones del tejido.
    NOTA: Se deben desechar las secciones que tienen agujeros donde el tejido se cayó, rasgaduras en el tejido o arrugas y pliegues apretados en el tejido.
  11. Escoja cuidadosamente la cinta de calidad de elección con fórceps de borde romo y flote en la superficie del baño de agua de 38 oC. Deje que las secciones se sienten en la superficie hasta que se alisen, teniendo cuidado de no dejarlas demasiado tiempo para evitar que la parafina se desintegre y destroce la sección.
  12. Flotar las secciones aplanadas sobre la superficie de los portaobjetos de vidrio limpio. Colocar los portaobjetos en un horno de 65 oC durante 30 minutos para derretir la cera.
    NOTA: Estas diapositivas se pueden almacenar en RT con protección lumíta.
  13. Desparafinar los portaobjetos en xileno 3x, 10 min para cada tratamiento.
  14. Rehidratar el tejido en etanol 100% durante 5 min, seguido de etanol 95% durante 5 min, 70% de etanol durante 5 min, 50% etanol durante 5 min, y finalmente 1x solución salina tris-buffered (TBS) durante 5 min (Figura 1H). Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche.
    NOTA: Estas diapositivas se pueden almacenar a largo plazo en RT siempre y cuando estén protegidas contra la luz.
  15. Montar las correderas con cubreobjetos utilizando 125 l de soporte de montaje que contiene 4o,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), una sonda fluorescente nuclear (Figura 1I). Diapositivas secas durante la noche en RT, protegidas contra la luz.
    NOTA: Los portaobjetos secos se pueden almacenar a largo plazo a 4 oC, protegidos contra la luz.
  16. Diapositivas de imagen mediante microscopía fluorescente.
    NOTA: Las imágenes saturadas deben evitarse, ya que no son cuantitativamente útiles. El ajuste de los ajustes de exposición y ganancia se puede reducir para evitar la saturación. Tenga cuidado de usar la misma configuración en las muestras que se comparan. Evite el blanqueo del tejido limitando los tiempos de exposición.

Resultados

Usando este protocolo, tratamos a tres ratones con una dosis de 10 mg/kg de Cy5.5-CTP a través de una inyección retro-orbital(Figura 1A). Después de permitir que el péptido circulara durante 15 minutos, los ratones fueron eutanasiados usando una cámara de CO2, el pecho se abrió a través de una incisión de esternotomía mediana, la aurícula derecha fue arrancada, y la perfusión de ratones se fijó usando 3 ml de formalina tamponada 10% fosfato (Figura 1B,C). Después de la fijación, el corazón, los pulmones, el hígado, el riñón, el bazo y el cerebro fueron diseccionados y dispuestos en una placa de 12 pozos para imágenes fluorescentes ópticas ex vivo(Figura 1D y Figura 2A). Tres ratones de control sin inyecciones también fueron perfundidos, diseccionados y con imágenes(Figura 1B-D y Figura 2B). Los datos de fluorescencia adquiridos para cada conjunto de órganos se pueden comparar debido a los recuentos que se convierten en eficiencia radiante, la unidad de fluorescencia relativa del software de imágenes. Estos datos pueden cuantificarse para producir tanto imágenes cualitativas como datos cuantitativos para cada órgano en cuestión (Figura 2C) en diferentes puntos de tiempo para estudios de biodistribución. La autofluorescencia de diferentes órganos en respuesta a diferentes longitudes de onda de excitación se demuestra en la Figura 3A-E. Las longitudes de onda de excitación más cortas, como la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), se asocian con una mayor autofluorescencia, especialmente en el hígado y el cerebro, que las longitudes de onda de excitación de color rojo lejano (Cy5.5) o casi infrarroja (Cy7) (Figura 3). Los órganos con imagen se fijaron en formalina tamponada de 10% de fosfato en RT durante un mínimo de 48 h, seguida de una transferencia al procesamiento de tejidos y la incrustación de casetes(Figura 1E). Los órganos fueron procesados y parafinados en una máquina de procesamiento de tejidos, colocados en moldes llenos de parafina, congelados en una etapa de -20 oC, y almacenados durante la noche a -20 oC(Figura 1F). Las muestras fueron seccionadas (Figura 1G) y tratadas con intercambios de soluciones para rehidratar el tejido (Figura 1H). Las guías preparadas se montaron entonces con medio de montaje fluorescente DAPI(Figura 1I). Una vez secas, generalmente durante la noche, las diapositivas fueron imágenes usando microscopía fluorescente. Las imágenes representativas de cada órgano de un ratón se muestran en la Figura 4A. Las imágenes de diferentes órganos se adquirieron utilizando ajustes idénticos para permitir la comparación entre ratones, y para permitir la cuantificación (Figura 4B).

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Figura 1: Cosecha de órganos de ratón para imágenes y secciones fluorescentes ópticas ex vivo. (A) Ratón de tipo salvaje inyectado retro-orbitalmente con CTP-Cy5.5. (B) Ratón diseccionado con el pecho abierto, la aurícula derecha recortada, para la fijación de perfusión. (C) Corazón inyectado con 3 ml de fosfato de formalina tamponado al 10% para la fijación por perfusión del animal. (D) Órganos de interés cosechados y dispuestos en una placa de 12 pozos para imágenes ópticas fluorescentes. (E) Corazón cargado en un cassette y procesado con un procesador de tejidos. (F) Corazón incrustado en parafina. (G) Corazón seccionado en un microtoma. (H) Diapositivas desparafinadas a través de una serie de intercambios de soluciones. (I) Secciones montadas con cubreobjetos utilizando DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes representativas de órganos tratados y de control. (A) Órganos de un ratón tratados con 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Órganos de un ratón de control no tratado. (C) Cuantificación de la fluorescencia para cada conjunto de órganos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Los órganos de ratón no tratados se muestran en diferentes longitudes de onda de emisión de excitación para demostrar cómo las longitudes de onda más largas producen menos autofluorescencia. (A) Cy7: 740-790. (B) Cy5.5: 660-710. (C) Cy5: 620-670. (D) Cy3: 520-570. (E) EGFP: 480-520. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Transducción del corazón, pulmón, hígado y riñón después de la inyección intravenosa en ratones. Los ratones de tipo salvaje se inyectaron con 10 mg/kg de Cy5.5-CTP, o un péptido aleatorio (RAN-Cy5.5), y se eutanasiaron en los puntos de tiempo indicados. (A) Se observó una transducción máxima del tejido cardíaco a 15 min con una disminución constante de la fluorescencia con el tiempo. Se observó cierta absorción capilar en los pulmones con transducción robusta en el hígado, así como en los capilares glomerulares renales, este último implicando un mecanismo renal de excreción. (B) La cuantificación de la intensidad fluorescente muestra un aumento significativo de la absorción cardíaca de CTP-Cy5.5 sobre RAN-Cy5.5. Barra de escala a 500 m. Esta cifra ha sido modificada de Zahid et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los modelos animales son esenciales para el desarrollo de fármacos preclínicos en todas las etapas del proceso, desde la identificación de nuevos CPP, estudios de biodistribución, mecanismo de transducción, hasta pruebas en última instancia de la eficacia de la carga entregada utilizando estos nuevos CPP como vectores. Hay muchos métodos comúnmente utilizados disponibles para evaluar la biodistribución, como la histología, las imágenes de medicina nuclear (SPECT y PET) y las imágenes ópticas in vivo12. Los métodos de imagen nuclear pueden ser engorrosos debido a la disponibilidad limitada de sistemas SPECT y PET para animales pequeños, así como a la capacidad de producir conjugados radioetiqueta-drogas, que requieren la experiencia de un radioquímico. Por el contrario, las etiquetas fluorescentes son mucho más simples y pueden ser rentables para trabajar con. El protocolo descrito en este documento permite un análisis rápido de la biodistribución utilizando múltiples métodos. La imagen óptica fluorescente de órganos enteros ex vivo permite la comparación inmediata de la fluorescencia en diferentes tejidos y grupos de tratamiento y puede identificar la absorción de órganos y el tiempo para la absorción máxima en órganos de interés de una manera semicuantitativa. La histología cuantitativa de tejidos requiere un procesamiento más extenso para tratar, sección, imagen y analizar tejidos, pero proporciona más datos a nivel microscópico y es una técnica estándar actual. Vale la pena observar que la comparación directa y cuantitativa entre las dos técnicas no es posible, porque la autofluorescencia observada con cada técnica para diferentes órganos y longitudes de onda de excitación varía significativamente.

Una parte importante de este protocolo es seleccionar el fluoróforo adecuado para etiquetar los CPP candidatos para los experimentos. Un problema potencial es la superposición de espectros, que puede ser problemático cuando se necesitan varios fluoróforos. Los medios de montaje fluorescentes DAPI y Cy5.5 no tienen espectros superpuestos. Sin embargo, para ciertas aplicaciones en las que se necesitan múltiples fluoróforos, el riesgo de superposición espectral debe ser considerado cuidadosamente. Dependiendo del sistema que se esté utilizando, la selección de fluoróforos puede ser limitada. Por lo tanto, el conocimiento de las capacidades del sistema es clave. Los sistemas ópticos fluorescentes se utilizan mejor con fluoróforos de infrarrojo lejano o cercano debido a la alta absorción de tejido de longitudes de onda más cortas13. Los fluoróforos en el rango de proteína fluorescente verde mejorada tienen una limitación importante, porque hay una autofluorescencia de órganos significativa vista en su longitud de onda de excitación, específicamente en el cerebro y el tejido hepático. Dependiendo de las condiciones de un experimento, algunos fluoróforos se evitan mejor. Algunos fluoróforos orgánicos solubles en agua tienen una fuerte interacción con las bicapas lipídicas, que pueden causar falsos positivos. Por lo tanto, tomar medidas para determinar si un fluoróforo tiene una fuerte afinidad con el tejido de interés es aconsejable14. Otro factor a tener en cuenta es la selección del método adecuado de conjugación de fluoróforos, que puede ser un parámetro importante que afecta a los resultados. Los CPP se pueden etiquetar fluorescentemente en el N- o C-terminus a través de un enlace covalente entre el N-terminus del péptido y el grupo carboxilo del tinte como Cy5.5-NHS. Se debe tener cuidado, porque el mecanismo de transducción de la mayoría de los CPP no se entiende en detalle y la conjugación en un extremo puede afectar el mecanismo de absorción más que en el otro extremo. Otra posibilidad para etiquetar los CPP es a través de biotiniloating el N-terminus para la conjugación a la estreptavidina etiquetada fluorescentemente. El uso de esta estrategia tiene la conveniencia de permitir el uso de diferentes conjugados fluorescentes de estreptavidina. Sin embargo, una posible limitación de esta estrategia es que un complejo de biotina-streptavidina es una construcción grande, que potencialmente podría interferir con la transducción.

Los sistemas de imágenes ópticas fluorescentes son una estrategia eficaz para generar la comparación de la fluorescencia entre diferentes órganos y tratamientos de manera eficiente, pero son incapaces de producir una medida cuantitativa de concentraciones absolutas en el tejido. Esto se debe a los efectos de dispersión de la luz dentro del tejido, que se agrava aún más por la variedad natural en tamaños de tejidos y densidades, y diferencias en la vascularización, con dispersión variable de fluorescencia. La autofluorescencia tisular también puede ser un factor, debido a fuentes bioquímicas naturales como el colágeno, o fuentes dietéticas como la clorofila en los alimentos13.

La histología es el método más utilizado para medir la biodistribución y se puede utilizar potencialmente para medir y comparar con precisión la absorción en diferentes tejidos a lo largo del tiempo. Los problemas de dispersión de la luz se evitan utilizando este método porque todos los tejidos se seccionan al mismo grosor15. Una de las principales ventajas de este método es la capacidad de incluir etiquetas fluorescentes adicionales postsección para la inmunohistoquímica. Aunque la adición de otro fluoróforo podría hacer que las imágenes sean más difíciles, el uso de etiquetas fluorescentes puede ser útil para la localización de un CPP a compartimentos intracelulares particulares, como lisosomas o mitocondrias. Un anticuerpo podría utilizarse en un experimento de microscopía confocal para determinar si un candidato transducido se coloca con una estructura de interés, que puede mostrar el potencial de un CPP como agente de administración. Una limitación de este método es que la preparación de diapositivas a partir de muestras de órganos puede llevar mucho tiempo, mucho trabajo y ser propensa al error humano12,,15. Cuando se deslizan por imágenes, se debe tener cuidado de no imaginar el mismo lugar durante demasiado tiempo para evitar el fotoblanda. Algunos fotoblanquidos serán inevitables, dependiendo de la sensibilidad del fluoróforo. Se debe tener cuidado en cada paso de este protocolo para proteger las muestras de la luz ambiental y almacenarlas correctamente16. Recomendamos que las diapositivas se almacenen a 4 oC, protegidas contra la luz, para futuras imágenes.

Hay una variedad de métodos disponibles para medir la biodistribución de un CPP candidato que requieren equipos especializados y pueden producir resultados comparables, aunque pueden requerir un etiquetado CPP más complejo. El protocolo descrito en este documento utiliza dos métodos compatibles para producir de manera eficiente datos de biodistribución en el contexto de un sistema vivo, al tiempo que permite la adquisición de una mayor información en profundidad sobre la internalización de péptidos dentro de las células de la misma muestra, reduciendo así el número de animales necesarios para un estudio a la mitad. Estos métodos se utilizaron para generar los datos anteriores, que demuestran que ambos métodos se pueden utilizar secuencialmente en el mismo animal, y la calidad de los datos generados por cada uno. Nuestros resultados también ponen de relieve la incapacidad de correlacionar directamente los resultados entre las dos técnicas de manera cuantitativa.

Divulgaciones

M.Z. y Paul D. Robbins (Universidad de Minnesota, Minnesota, MN, EE. UU.) poseen una patente sobre el uso de péptido de orientación cardíaca como vector cardíaco (dominio de focalización de proteínas específicos del cardíaco, serie de serie de patentes de EE. UU. No. 9,249,184). M.Z. también se desempeña como Director Científico y forma parte del Consejo de Administración de la startup Vivasc Therapeutics Inc. y posee una equidad futura sustancial en ella.

Agradecimientos

M.Z. y K.S.F. cuentan con el apoyo del American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, y por una subvención otorgada bajo el Pitt Innovation Challenge (PInCh®), a través del Clinical and Translational Science Institute de la Universidad de Pittsburgh.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fosfato de formalina tamponado al 10 %ThermoFisherSF100-4
10x solución salina tamponada Tris (TBS)ThermoFisherBP2471-1
Placa de cultivo celular de 12 pocillosThermoFisher353043
1x TBS La solución10x TBS se diluye 1:10 con agua desionizada. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente.
Viales de centelleo de 20 ml AgujasWheaton334173
26GBecton Dickinson305110
28G 0.5ml Jeringas de insulinaBecton Dickinson 329461
3mL JeringaBecton Dickinson309657
CD1 Ratones CharlesRiver022Ratones albinos de 6 a 12 semanas de edad hembras
CubreobjetosThermoFisher12-544-14
Cy5.5-CTP-amidaPreparado por síntesis de péptidos, conjugado con fluoróforo Cy5.5 y purificado mediante HPLC. El polvo liofilizado se reconstituye en DMSO a una concentración de 10 mM. Después de reconstituir, almacene a -80 ° C.
Dapi Fluoromount GSouthernBiotech0100-20
Dumont #5 PinzasHerramientas de Ciencia Fina99150-20
Etanol
Tijeras Bonn Extra FinasHerramientas de Ciencia Fina14084-08
Ketamina HCl 100mg/mLKetaVedNDC 50989-161-06
Solución de Ketamina/XilacinaLa ketamina HCl se mezcla con xilacina 1:1 para producir una solución madre que contiene 50 mg/mL de ketamina y 10 mg/mL de xilacina. Esta solución se refresca antes de cada uso.
Leica RM2235 Microtomo rotatorioLeicaRM2235
Portaobjetos de microscopioThermoFisherB9992000TN
Paraplast X-TRASigmaP3808-1KG
Perkin Elmer Lumina S5 IVISPerkin Elmer ElmerCLS148588
Sparkle Limpiador de lentes ópticosThermoFisherNC0090079
Tissue-Tek Processing/ Casetes de incrustaciónThermoFisherNC9499605
Tissue-Tek VIP Máquina de procesamientoTissue-TekVIP 5A-F1
Xilacina 20 mg/mLAnaSedNDC 59399-110-20
XilenosThermoFisherX5-4

Referencias

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