Artículo de método

Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

DOI:

10.3791/60912

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9 de febrero de 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este documento, mostramos un método eficiente para la purificación de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos que se puede utilizar para experimentos de cocultivo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el sistema nervioso central, los oligodendrocitos son bien conocidos por su papel en la mielinización de axón, que acelera la propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria. Por otra parte, un número creciente de informes sugieren que los oligodendrocitos interactúan con las neuronas más allá de la mielinización, en particular a través de la secreción de factores solubles. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite la purificación de células de linaje oligodendroglial de cultivos celulares gliales que también contienen astrocitos y células microgliales. El método se basa en el temblor nocturno a 37 oC, que permite el desprendimiento selectivo de las células oligodendrogliales y microglia superpuestas, y la eliminación de la microglia por adhesión diferencial. A continuación, describimos el cultivo de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM). También proporcionamos la cinética del tratamiento OCM u oligodendrocitos adición a las neuronas hipocampales purificadas en experimentos de cocultivo, estudiando interacciones oligodendrocitos-neuronas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los oligodendrocitos (OL) son células gliales del sistema nervioso central (SNC) que generan envoltura de mielina alrededor de los axones. Los OL s originan a partir de células precursoras de oligodendrocitos (OPO) que proliferan dentro de las zonas ventriculares del SNC embrionario y luego migran y diferencian en OLs completamente maduras (es decir, células formadoras de mielina)1. Los OPO son abundantes durante el desarrollo temprano, pero también persisten en el cerebro adulto donde representan la mayor población celular proliferativa2. Un solo OL envuelve múltiples axones en secciones no excitables (es decir, internodos), y el borde de cada bucle de mielina se une al axón formando el dominio paranodal que es crucial para las propiedades aislantes de la mielina1,3. Entre los paranodos hay pequeños huecos no mielinizados llamados los nodos de Ranvier. Estos nodos son ricos en canales de sodio (Nav) cerrados por voltaje, lo que permite la regeneración y rápida propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria4. Esta estrecha interacción también permite el apoyo de la energía axonal a través de la toma neuronal de lactato de OLs5,6.

La maduración de las células de linaje oligodendroglial y el proceso de mielinización están estrechamente regulados por sus interacciones con las neuronas7. De hecho, los OL y los OPO, también llamados células NG2, expresan una serie de receptores de neurotransmisores, y pueden recibir información de las neuronas excitatorias e inhibitorias, lo que les permite sentir la actividad neuronal que puede desencadenar su proliferación y / o diferenciación en las células mielinizadoras2. A su vez, los OPO/OLs secretan microvesículas y proteínas en el espacio extracelular que solo o sinérgicamente median las funciones neuromoduladoras y neuroprotectoras8,9,10,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan los múltiples modos de interacciones entre las células de linaje oligodendroglial y las neuronas aún no se han descifrado completamente.

Por otra parte, en varias condiciones patológicas del SNC, los OLs se ven afectados principalmente, lo que perturba su interacción con las neuronas. Por ejemplo, en la Esclerosis Múltiple (EP), la disfunción neurológica es causada por la desmielinización focal en el SNC, secundaria a la pérdida de OLs que puede conducir a daño axonal y acumulación de discapacidad relacionada. La remielinización puede tener lugar, aunque insuficientemente en la mayoría de los casos13. Los progresos en la última década, debido al desarrollo de inmunoterapias, han reducido la tasa de recaídas, pero la promoción de la remielinización sigue siendo hasta la fecha una necesidad insatisfecha. Como tal, una mejor comprensión del papel, las funciones y las influencias de los ostales es de particular interés para el desarrollo de nuevas terapias para un amplio espectro de condiciones del SNC.

Aquí, describimos los métodos de purificación y cultivo de OLs. Esto permite un examen preciso de los mecanismos intrínsecos que regulan su desarrollo y biología. Además, estos cultivos de OLs altamente enriquecidos permiten la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM), que se puede agregar a los cultivos de neuronas purificadas para obtener información sobre el impacto de los factores secretos por OLs en la fisiología neuronal y la conectividad. Además, describimos cómo implementar un sistema de cocultivo in vitro donde se combinan oligodendrocitos y neuronas purificados, lo que permite abordar los mecanismos que regulan (re)mielinización.

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Protocolo

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El cuidado y uso de ratas en este experimento se ajusta a las políticas y directrices institucionales (UPMC, INSERM y la Directiva 86/609/CEE del Consejo de la Comunidad Europea). El siguiente protocolo se establece para una camada estándar de 12 cachorros.

1. Preparación de los matraces (5 min)

NOTA: Realice los siguientes pasos el día antes de la disección en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.

  1. Recubrir los matraces de 150 cm2 (T150) con tapa de filtro (1 matraz para 2 cachorros) utilizando 5 ml de polietilenimina (PEI, 100 mg/L, ver protocolo en el archivo suplementario 1).
  2. Almacene los matraces a 4oC durante la noche.
  3. Enjuague los matraces recubiertos 3 veces con agua destilada estéril el día de la disección.

2. Preparación de medios (10 min)

NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.

  1. Preparar 500 ml de medio de cultivo, compuesto por el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con el 10% del suero fetal de la pantorrilla (FCS) y la penicilina-estreptomicina (100 UI/ml).
  2. Preparar 20,6 ml del medio de digestión enzimática en un tubo de 50 ml, que consiste en 20 ml de DMEM, 200 ml de DNase (50 g/ml), 200 ml de papaína (30 U/ml) y 200 ml de L-cisteína (0,24 mg/ml).
  3. Filtrar-esterilizar el medio utilizando un filtro de 0,22 m.
  4. Mantenga el medio en la campana de flujo laminar a temperatura ambiente (RT) hasta la disección.

3. Preparación para la disección (10 min)

NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.

  1. Preparar 100 ml de solución salina con fosfato sin calcio y magnesio (PBS; 1x). Filtrar-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 m.
  2. Preparar 50 ml de solución de PS p.PBS 1x en frío suplementada con 750 ml de glucosa al 45%. Filtrar-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 m.
  3. Llene una placa Petri de 100 mm con 1 x PBS para instrumentos de limpieza y tres platos Petri de 60 mm con PBS-glucosa helada para la cosecha de tejidos. Ponga los platos de petri en hielo hasta la disección.

4. Disección

NOTA: La disección se realiza a partir de cachorros de ratas Wistar masculinos y femeninos en el día postnatal (P) 2.

  1. Con el fin de proporcionar un ambiente estéril, asegúrese de limpiar el banco con 100% etanol. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas con 100% de etanol.
  2. Rocíe suavemente el cuello del cachorro con un 70% de etanol.
  3. Use tijeras quirúrgicas grandes para decapitar al animal y colocar la cabeza en un plato Petri de 100 mm que contenga PBS-glucosa helada.
  4. Utilice fórceps curvos para mantener la cabeza del animal a nivel de los ojos. Use pequeñas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión en la base del cráneo y cortar el cráneo siguiendo la línea media del cerebro.
  5. Usa fórceps para despegar suavemente las dos partes del cráneo de la línea media.
  6. Use una cuchara quirúrgica pequeña para extraer el cerebro de la cavidad de la cabeza. Ponga el cerebro en un plato Petri de 60 mm que contenga PBS-glucosa helada en hielo.
  7. Viendo bajo un esterosmicroscopio, usa fórceps finos para eliminar el cerebelo, el tronco encefálico y los bulbos olfativos de los hemisferios cerebrales.
  8. Usa fórceps finos para separar los dos hemisferios cerebrales. Usa fórceps finos para despegar las meninges. Ponga los córtices cerebrales en un plato de 60 mm-petri sobre hielo.
    NOTA: El PBS helado es fundamental para la eliminación correcta de las meninges.

5. Disociación de tejidos

NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.

  1. Usa un bisturí afilado para cortar finamente los córticos cerebrales. Transfiera el tejido picado a un tubo de 50 ml que contenga un medio de digestión enzimática.
  2. Incubar durante 30 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% co2.
  3. Utilice una micropipeta p1000 para eliminar suavemente el medio de digestión enzimática mientras se asegura de que el tejido cortical permanezca en la parte inferior del tubo de 50 ml.
  4. Utilice un micropita p1000 para agregar 1 ml de DMEM-10% FCS y triturar suavemente el tejido.
  5. Utilice un filtro de 70 m y un pistón de una jeringa de 1 ml para filtrar el tejido cortical en un tubo de 50 ml.
    NOTA: Se puede enjuagar el tejido residual en la pared del tubo interno varias veces con DMEM-10% FCS.
  6. Llene el tubo de 50 ml con DMEM-10%FCS. Centrífuga a 423 x g durante 5 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 2 ml de DMEM-10%FCS.
  7. Triturar suavemente el pellet celular con un micropita p1000 y luego con un micropita p200. Diluir la suspensión celular con el volumen adecuado de DMEM-10%FCS.
    NOTA: Dos cerebros, uno, uno, uno, 5 ml de DMEM-10%FCS.
  8. Placa 5 ml de la suspensión celular en un T150 a una densidad de 1 x 105 células/cm2. Agregue 20 mL de DMEM caliente-10%FCS a cada T150. Incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
  9. Renovar la mitad del medio de cultivo después de 6 días in vitro (DIV) con cálido DMEM-10%FCS.

6. Preparación de agitación

  1. Realice la preparación de agitación el día antes de agitar en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
  2. Renovar la mitad del medio de cultivo añadiendo un medio de cultivo fresco y cálido al matraz e incubar a 37oC por debajo del 5% deCO2.

7. Temblor

  1. Recubrir tres platos Petri de 100 mm con PEI. Guárdelos a 4oC durante la noche.
  2. Cubra la tapa de los frascos con película de parafina y coloque los matraces en una bolsa de plástico. Agitar los matraces que contengan células gliales durante la noche a 250 rpm a 37 oC.
    NOTA: El primer temblor se realiza a 8 DIV y se pueden realizar hasta tres temblores diferentes (consulte la figura 1 para la sincronización).

8. Células de linaje OL cosechay cultivo

NOTA: Estos pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.

  1. El día después del temblor, preparar el medio Bottenstein-Sato (BS) según la Tabla 1.
  2. Enjuague los platos Petri recubiertos 3 veces con agua destilada estéril.
  3. El sobrenadante de los matraces de cosecha que contiene principalmente células de linaje OL, pero también algunas células microgliales y lo clomanan en platos Petri de 100 mm no recubiertos.
    NOTA: Este paso permite la eliminación de células microgliales a través de una adhesión rápida diferencial en la superficie del plato.
  4. Incubar los platos de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
  5. Llenar cada matraz T150 con 25 ml de medio de cultivo recién preparado y incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2 hasta el segundo temblor.
  6. Transfiera el sobrenadante de los platos Petri a nuevos platos Petri de 100 mm no recubiertos para permitir la adhesión de células microgliales residuales.
  7. Incubar los platos de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
  8. Retire el sobrenadante, que contiene células de linaje OL no adherentes, y transfieralo a tubos de 50 ml (sobrenadante de 2 platos De Petri para un tubo de 50 ml). Deseche los platos de Petri chapados con microglia.
  9. Centrifugar el sobrenadante durante 5 min a 423 x g. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular con 1 ml de medio de BS. Piscina todos los pellets en un tubo común de 50 ml y ajuste el volumen a 10 ml con medio BS.
  10. Determinar la densidad celular contando células bajo un microscopio.
    NOTA: Se debe obtener una densidad de celda entre 3 x 105/mL y 5 x 105/mL.
  11. Agregue 20 ml de BS si la densidad de celda es mayor o igual que 4 x 105/mL para obtener un volumen final de 30 ml, o agregue solo 10 ml de BS si la densidad de celda es inferior a 4 x 105/mL para obtener un volumen final de 20 ml.
  12. Placa dos o tres platos Petri pre-revestidos de 100 mm con 10 ml de suspensión celular. Incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
  13. Limpie los escombros de los platos de Petri refrescando todo el medio BS 2 h más tarde.
    NOTA: Examine el cultivo bajo el microscopio antes y después de limpiar para verificar la densidad celular y la eficiencia de la eliminación de escombros.
  14. Incubar durante 2 días en soporte bis en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
    NOTA: Examine el cultivo bajo el microscopio. La confluencia debe ser del 70% al 80%.

9. Producción de OCM

NOTA: Realice estos pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.

  1. Preparar el medio NB-B27low según el Cuadro 2.
  2. Renovar medio de cultivo con 10 mL de medio cálido NB-B27low. Incubar durante 2 días en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
  3. Cosecha el OCM, es decir, sobrenadante que contiene factores secretos de OL. Filtrar-esterilizar OCM utilizando un filtro de 0,22 m.
    NOTA: Almacene OCM a 4oC durante un máximo de 2 meses.

10. Adición de OCM

NOTA: Los pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. OCM se puede añadir a cultivos de neuronas hipocampales purificadas preparados de acuerdo con el siguiente protocolo14,y obtenido según la adición, 24 h después del aislamiento, los agentes antimitóticos uridina y 5- fluorodeoxiruridina (5 m) durante 36 h.

  1. A 3 DIV, retire todo el medio de cultivo de neuronas que contenga agentes antimitoticos y agregue 500 l de OCM caliente fresco.
  2. Renueva la mitad del medio cada 3 días con el nB-B27 recién hecho y caliente.
    NOTA: Estas culturas se pueden mantener hasta 21 DIV.

11. Adición de OL al cultivo purificado de neuronas hipocampales

NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. Los OLs se pueden añadir a los cultivos de hipocampo purificados obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente.

  1. Preparar el medio de cocultivo según la Tabla 3.
  2. Recupere la cultura de OL al 70% a 80% de confluencia. Enjuagar con 2 ml de 1x PBS caliente.
  3. Para separar las células, agregue 2 ml de trippsina al 0,25% a una placa Petri de 100 mm.
  4. Incubar durante 5 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5%co2.
  5. Añadir 2 mL de DMEM-10% FCS para bloquear la reacción enzimática. Cosecha el sobrenadante que contiene células de linaje OL.
  6. Centrífuga a 423 x g durante 5 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cocultivo cálido para obtener una concentración de 1,25 x 105 células/ml.
  7. Agregue OL al cultivo purificado de neuronas del hipocampo eliminando 200 éL de medio de cultivo de neuronas y agregando 200 s de suspensión celular por pozo (2,5 x 104 células/pozo) de una placa de 24 pocillos.
  8. Refrescar la mitad del medio de cocultura cada 2-3 días.
    NOTA: Los cocultivos se pueden mantener hasta 24 DIV.

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Resultados

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En este protocolo, las células de linaje OL se purifican de cultivos gliales sacudiendo astrocitos y microglia. La pureza y el examen fenotípico de los cultivos de OL se pueden evaluar mediante inmunomancha con marcadores gliales15. El análisis de la expresión de diferentes marcadores indicó que los cultivos de OL eran en su mayoría pre-OLs con 90% - 4% de O4+ células, 85% - 7% NG2+ células, y 4.7% a 2.1% de PLP+ células, mientras q...

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Discusión

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Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para obtener cultivos celulares de linaje oligodendroglial altamente enriquecidos a partir de cultivos glialmixtos, adaptados a partir de un método publicado previamente16,y la posterior producción de medio condicionado por OL. Esta técnica de agitación no es costosa, se puede repetir tres veces y es óptima para obtener una gran cantidad de obsturas purificadas, ya que proliferan las células cultivadas en el medio Bottenstein-Sato (BS) que contiene PDGF....

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Divulgaciones

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Ninguno de los autores tiene intereses en conflicto o en conflicto.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores quieren agradecer a Rémi Ronzano por su sabio consejo en la edición de manuscritos. Este trabajo fue financiado por iCM, INSERM, la fundación ARSEP a NSF, y el precio Bouvet-Labruyére.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-fluorodesoxiuridinaSigmaF0503
B27suplemento ThermoFisher17504044
solución de D-(+)-GlucosaSigmaG8769
DNasa (desoxirribonucleasa I)WorthingtonLS002139
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
Etanol 100% Sigma32221-M Etanol
70%VWR Chemicals83801.360
Suero fetal de terneraThermoFisher10082147
L-cisteínaSigmaC7352
NeurobasalThermoFisher 21103049
PapaínaWorthingtonLS003126
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher15140122
Solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesioThermoFisherA1285601
Polietilenimina (PEI)SigmaP3143
Tetraborato decahidratadoSigmaB9876
TripsinaSigmaSigma
UridinaSigmaU3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin humanoSigmaT1147
BSA (Albúmina sérica bovina)SigmaA4161
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
InsulinaSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher15140122
ProgesteronaSigmaP8783
Pincrédulo de putrescinaSigmaP5780
Selenito de sodioSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio)SigmaT6397
T4 ( L-tiroxina)SigmaT1775
Medios de cocultivo
apo-Transferrina humanaSigmaT1147
B27 suplementoThermoFisher17504044
BiotinaSigmaB4639
BSA (Albúmina sérica bovina)SigmaA4161
CeruloplasminaSigma239799
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
HidrocortisonaSigmaH4001
InsulinaSigmaI5500
N-acetil-L-cisteínaSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher15140122
ProgesteronaSigmaP8783
PutrescinaSigmaP5780
CNTF humano recombinanteSigma450-13
Selenito de sodioSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio)SigmaT6397
Vitamina B12SigmaV6629
Tools
0.22 µ m filtroSartorius514-7010
Jeringa de 1 mLTerumo1611127
100 mm Placa de PetriDutscher193100
Tubo de 15 mLCorning Life Science734-1867
Tubo de 50 mLCorning Life Science734-1869
Placa de Petri de 60 mmDutscher 067003
70 & micro; m filterMiltenyi Biotec130-095-823
Microscopio binocularOlympusSZX7
Pinza curvaFine Science Tools11152-10
Pinzas finasFine Science Tools91150-20
Tijeras quirúrgicas grandesFine Science Tools14008-14
BisturíSwann-morton233-5528
ShakerInfors HT
Tijeras quirúrgicas pequeñas FineScience Tools91460-11
Cuchara quirúrgica pequeñaBar Naor LtdBN2706
T150 cm2 matraz con tapón de filtroDutscher190151
Animal
P2 Wistar rata JanvierRjHAn:WI

Referencias

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