En este documento, mostramos un método eficiente para la purificación de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos que se puede utilizar para experimentos de cocultivo.
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Artículo de método
Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura
En este artículo
Resumen
Resumen
En el sistema nervioso central, los oligodendrocitos son bien conocidos por su papel en la mielinización de axón, que acelera la propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria. Por otra parte, un número creciente de informes sugieren que los oligodendrocitos interactúan con las neuronas más allá de la mielinización, en particular a través de la secreción de factores solubles. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite la purificación de células de linaje oligodendroglial de cultivos celulares gliales que también contienen astrocitos y células microgliales. El método se basa en el temblor nocturno a 37 oC, que permite el desprendimiento selectivo de las células oligodendrogliales y microglia superpuestas, y la eliminación de la microglia por adhesión diferencial. A continuación, describimos el cultivo de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM). También proporcionamos la cinética del tratamiento OCM u oligodendrocitos adición a las neuronas hipocampales purificadas en experimentos de cocultivo, estudiando interacciones oligodendrocitos-neuronas.
Introducción
Los oligodendrocitos (OL) son células gliales del sistema nervioso central (SNC) que generan envoltura de mielina alrededor de los axones. Los OL s originan a partir de células precursoras de oligodendrocitos (OPO) que proliferan dentro de las zonas ventriculares del SNC embrionario y luego migran y diferencian en OLs completamente maduras (es decir, células formadoras de mielina)1. Los OPO son abundantes durante el desarrollo temprano, pero también persisten en el cerebro adulto donde representan la mayor población celular proliferativa2. Un solo OL envuelve múltiples axones en secciones no excitables (es decir, interno....
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Protocolo
El cuidado y uso de ratas en este experimento se ajusta a las políticas y directrices institucionales (UPMC, INSERM y la Directiva 86/609/CEE del Consejo de la Comunidad Europea). El siguiente protocolo se establece para una camada estándar de 12 cachorros.
1. Preparación de los matraces (5 min)
NOTA: Realice los siguientes pasos el día antes de la disección en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Recubrir los matraces de 150 cm2 (T150) con tapa de filtro (1 matraz para 2 cachorros) utilizando 5 ml de polietilenimina (PEI, 100 mg/L, ver protocolo en el archivo suplem....
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Resultados
En este protocolo, las células de linaje OL se purifican de cultivos gliales sacudiendo astrocitos y microglia. La pureza y el examen fenotípico de los cultivos de OL se pueden evaluar mediante inmunomancha con marcadores gliales15. El análisis de la expresión de diferentes marcadores indicó que los cultivos de OL eran en su mayoría pre-OLs con 90% - 4% de O4+ células, 85% - 7% NG2+ células, y 4.7% a 2.1% de PLP+ células, mientras q.......
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Discusión
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para obtener cultivos celulares de linaje oligodendroglial altamente enriquecidos a partir de cultivos glialmixtos, adaptados a partir de un método publicado previamente16,y la posterior producción de medio condicionado por OL. Esta técnica de agitación no es costosa, se puede repetir tres veces y es óptima para obtener una gran cantidad de obsturas purificadas, ya que proliferan las células cultivadas en el medio Bottenstein-Sato (BS) que contiene PDGF........
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene intereses en conflicto o en conflicto.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a Rémi Ronzano por su sabio consejo en la edición de manuscritos. Este trabajo fue financiado por iCM, INSERM, la fundación ARSEP a NSF, y el precio Bouvet-Labruyére.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-fluorodesoxiuridina | Sigma | F0503 | |
| B27 | suplemento ThermoFisher | 17504044 | |
| solución de D-(+)-Glucosa | Sigma | G8769 | |
| DNasa (desoxirribonucleasa I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Etanol 100% | Sigma | 32221-M Etanol | |
| 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Suero fetal de ternera | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cisteína | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher 21103049 | ||
| Papaína | Worthington | LS003126 | |
| Penicilina-Estreptomicina | ThermoFisher | 15140122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polietilenimina (PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborato decahidratado | Sigma | B9876 | |
| Tripsina | Sigma | Sigma | |
| Uridina | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin humano | Sigma | T1147 | |
| BSA (Albúmina sérica bovina) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicilina-Estreptomicina | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | |
| Pincrédulo de putrescina | Sigma | P5780 | |
| Selenito de sodio | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio) | Sigma | T6397 | |
| T4 ( L-tiroxina) | Sigma | T1775 | |
| Medios de cocultivo | |||
| apo-Transferrina humana | Sigma | T1147 | |
| B27 suplemento | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotina | Sigma | B4639 | |
| BSA (Albúmina sérica bovina) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmina | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hidrocortisona | Sigma | H4001 | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| N-acetil-L-cisteína | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicilina-estreptomicina | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | |
| Putrescina | Sigma | P5780 | |
| CNTF humano recombinante | Sigma | 450-13 | |
| Selenito de sodio | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio) | Sigma | T6397 | |
| Vitamina B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µ m filtro | Sartorius | 514-7010 | |
| Jeringa de 1 mL | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Placa de Petri | Dutscher | 193100 | |
| Tubo de 15 mL | Corning Life Science | 734-1867 | |
| Tubo de 50 mL | Corning Life Science | 734-1869 | |
| Placa de Petri de 60 mm | Dutscher 067003 | ||
| 70 & micro; m filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Microscopio binocular | Olympus | SZX7 | |
| Pinza curva | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Pinzas finas | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Tijeras quirúrgicas grandes | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Bisturí | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Tijeras quirúrgicas pequeñas Fine | Science Tools | 91460-11 | |
| Cuchara quirúrgica pequeña | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 matraz con tapón de filtro | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar | rata Janvier | RjHAn:WI |
Referencias
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Broph....
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Reimpresiones y permisos
