Detallamos un método simple para producir películas de lapso de tiempo de alta resolución de enjambres Pseudomonas aeruginosa que responden al bacteriófago (fago) y estrés antibiótico utilizando un escáner de documentos de base plana. Este procedimiento es un método rápido y sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y puede adaptarse para estudiar la motilidad y el crecimiento de otras especies bacterianas.
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Artículo de método
Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés
En este artículo
Resumen
Resumen
El enjambre es una forma de motilidad superficial observada en muchas especies bacterianas incluyendo Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Aquí, las poblaciones densas de bacterias se mueven a grandes distancias en comunidades características en forma de zarcillo en el transcurso de horas. El enjambre es sensible a varios factores, incluyendo humedad media, humedad y contenido de nutrientes. Además, la respuesta al estrés colectivo, que se observa en P. aeruginosa que se estresa con antibióticos o bacteriófagos (fago), repele que los enjambres se acerquen a la zona que contiene el estrés. Los métodos descritos aquí abordan cómo controlar los factores críticos que afectan al enjambre. Presentamos un método sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y la respuesta de tensión colectiva con alta resolución temporal usando un escáner de documentos de base plana, y describimos cómo compilar y realizar un análisis cuantitativo de enjambres. Este método simple y rentable proporciona una cuantificación precisa y bien controlada del enjambre y puede extenderse a otros tipos de ensayos de crecimiento a base de placas y especies bacterianas.
Introducción
El enjambre es una forma colectiva de motilidad bacteriana coordinada que aumenta la resistencia a los antibióticos y la producción de factores de virulencia en el huésped1,2,3. Este comportamiento multicelular ocurre en superficies semisólidas que se asemejan a las de las capas mucosas que cubren las membranas epiteliales en los pulmones4,5. Los biosurfactantes son comúnmente producidos por poblaciones enjambres para superar la tensión superficial en las superficies y la producción de estos está regulada por complejo....
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Protocolo
1. Preparación de placas de agar enjambre para P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Preparar 1 L de 5x M8 medios mínimos en una botella de vidrio añadiendo 64 g de Na2HPO4•7H2O, 15 g de KH2PO4y 2,5 g de NaCl en agua de doble destilación de 500 ml (ddH2O). Ajuste el volumen final a 1 L con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar y almacenar medios líquidos a temperatura ambiente.
- Preparar 100 ml de 1 M MgSO4 (sulfato de magnesio) en una botella de vidrio añadiendo 24,6 g de MgSO4•7H2O en 50 ml ddH2O. Ajuste el vo....
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Resultados
Los pasos para cultivar P. aeruginosa, estresar las células e imaginar las placas de agar enjambre se representan en la Figura 1. Inoculamos una sola colonia de cepas de tipo salvaje P. aeruginosa UCBPP-PA14 a partir de una placa de agar LB en 2 ml de caldo LB durante la noche a 37 oC y nos detectamos 5 oC en el centro de la placa de agar enjambre. Las imágenes de lapso de tiempo de esta placa revelan el crecimiento inicial en forma de colonia en el centro y luego la propagación de zarc.......
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Discusión
Este protocolo se centra en minimizar la variabilidad en las placas de agar enjambre y proporcionar un método simple y de bajo costo para adquirir imágenes de lapso de tiempo de P. aeruginosa enjambre y responder al estrés. Este procedimiento se puede extender a la imagen de otros sistemas bacterianos mediante la adaptación de la composición de los medios y las condiciones de crecimiento. Para P. aeruginosa,aunque M9 o FAB medio mínimo se puede utilizar para inducir enjambre16
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
J.-L.B., A.S., y N.M.H-K. escribió y revisó el manuscrito. Todos los autores diseñaron los experimentos. J.-L.B. realizó los experimentos y análisis. Este trabajo fue apoyado por el premio NIH K22AI112816 y la concesión R21AI139968 a A.S. y por la Universidad de California. N.M.H-K. fue apoyado por las Becas Lundbeck R220-2016-860 y R251-2017-1070. Los funderos no tuvieron ningún papel en la decisión de presentar la obra para su publicación. No tenemos intereses que declarar.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| enjambre | |||
| D-Glucosa | Fisher Chemical | D16500 | Dextrosa. Para medios de enjambre |
| Sal disódica de fosfomicina Industria | química de Tokio | F0889 | Concentración de existencias: 200 mg/mL. Disuelto en ddH2O |
| sulfato de gentamicina | Sigma-Aldrich | G1914 | Concentración de stock: 3 mg/mL. Disuelto en ddH2O |
| Sulfato de kanamicina | Sigma-Aldrich | 60615 | Concentración de existencias: 100 mg/mL. Disuelto en ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | Para caldo LB y placas de agar LB |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Sigma-Aldrich | 230391 | Para enjambre de medios |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma-Aldrich | P0662 | Para 5 medios M8 |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S9888 | Para 5 medios |
| M8Fosfato de sodio dibásico heptahidratado | Fisher Chemical | S373 | Para 5x M8 media |
| Cepas | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 cepa |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriófago |
| < strong>Supplies | |||
| Papel de lija de óxido de aluminio | 3M | 150 Fine | Para tapas negras Tela |
| negra Joann | PRD7089 | Tela negra Pintura | |
| aerosol negra | Krylon | 5592 Negro mate | Para tapas negras |
| Matraz Erlenmeyer | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Botellas de vidrio | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| Bridas de 8 pulgadas | Gardner Bender | E173770 | tela mate negra |
| (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | placas de poliestireno de 100 mm x 15 mm |
| Palos de madera | Fisher | 23-400-102 | Para rayar e inocular bacterias |
| Equipo | |||
| Mercado de autoclaves | Forge Industries | STM-E | Para reactivos esterilizantes |
| Pipeta de 25 mL | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | Para pipetear 20 mL para enjambre de placas de agar |
| Deshumidificador | Frigidaire | FAD704DWD 70 pintas | Para mantener la humedad relativa de la habitación en aproximadamente 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software para el análisis de imágenes |
| Incubadora | VWR | 89032-092 | Para el crecimiento de bacterias a 37 ° C |
| Baño de agua Isotemp | Fisher | 15-462-21Q | Para enfriar medios hasta 55 ° C |
| Campana de flujo laminar | The Baker Company | SG603A | Para placas de secado |
| Pipeta P-20 | Gilson | F123601 Manchado en placas de agar de enjambre | |
| Controlador de pipetas | BrandTech | accu-jet | Para pipetear 20 mL para enjambre de placas de agar |
| Tambor de rodillo | New Brunswick | TC-7 | Para el crecimiento de bacterias a 100 rpm |
| Escáner | Epson | Epson Perfection V370 | Photo Scanner para placas de imagen Software de |
| automatización de escáner | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | Para imágenes internas de 30 minutos Software de |
| adquisición de imágenes de escáner | Epson | v9.9.2.5US | Software para placas de imagen |
Referencias
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.
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Reimpresiones y permisos
