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Un método de detección para la identificación de medicamentos que promueven la heterocromatina utilizando Drosophila

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DOI:

10.3791/60917

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12 de marzo de 2020

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1Department of Medicine, University of California San Diego

En este artículo

Resumen

Drosophila es un modelo experimental ampliamente utilizado adecuado para la detección de medicamentos con posibles aplicaciones para la terapia oncológica. Aquí, describimos el uso de fenotipos de color ocular variegados Drosophila como un método para el cribado de compuestos de moléculas pequeñas que promueven la formación de heterocromatina.

Resumen

La drosofilia es un excelente organismo modelo que se puede utilizar para detectar compuestos que podrían ser útiles para la terapia oncológica. El método descrito aquí es un método in vivo rentable para identificar compuestos que promueven la heterocromatina mediante el uso de Drosophila. La cepa DX1 de la Drosophila, con un fenotipo de color de ojos variado que refleja las extensiones de la formación de heterocromatina, proporcionando así una herramienta para una prueba de drogas que promueve la heterocrocina. En este método de cribado, la variegación ocular se cuantifica en función de la superficie de pigmentación roja que ocupa partes del ojo y se puntua en una escala de 1 a 5. El método de cribado es sencillo y sensible y permite probar compuestos in vivo. La detección de medicamentos con este método proporciona una manera rápida y económica de identificar medicamentos que promueven la heterocromatina que podrían tener efectos beneficiosos en las terapias contra el cáncer. La identificación de compuestos que promueven la formación de heterocromatina también podría conducir al descubrimiento de mecanismos epigenéticos del desarrollo del cáncer.

Introducción

La heterocrocritina es una forma condensada de ADN que desempeña un papel central en la expresión génica, en la regulación de la segregación cromosómica durante la división celular y en la protección contra la inestabilidad del genoma1. Se ha considerado que la heterocromía es un regulador de la represión génica y para proteger la integridad cromosómica durante la mitosis celular2,3. Se asocia con la di- y trimetilación de la histona H3 lisina 9 (H3K9me) durante el compromiso de linaje4,5. Además, el reclutamiento de proteínas cromodominio de la proteína 1 de la heterocromía (HP1) también se considera asociado con la heterocromía y la represión epigenética de la expresión génica6. Estas proteínas son componentes esenciales y marcadores de la formación de heterocromatina.

Dado que la inestabilidad genómica permite a las células adquirir alteraciones genéticas que promueven la carcinogénesis, la heterocrocina es cada vez más reconocida en el desarrollo del cáncer y puede ser dirigida para el tratamiento del cáncer7,8. Actualmente, no hay medicamentos que estén bien establecidos para ayudar a la formación de heterocromatina. Aquí, presentamos un método simple y rápido pero eficiente para el cribado de compuestos de moléculas pequeñas que promueven la formación de heterocromatina. El cribado se realiza mediante el tratamiento de Drosophila con una biblioteca de fármacos de moléculas pequeñas. Este método aprovecha un fenotipo de color de ojo variado en la cepaDrosophila DX1que está influenciado por los niveles de heterocromatina. Las moscas DX1 contienen una matriz en tándem de siete transgenes P[lac-w], que tienen la expresión/depresión variada dependiendo de la heterocromatización, por lo tanto, el grado de variegación en el color de los ojos refleja el nivel de heterocrocromatina. Específicamente, el aumento de la heterocromatina podría ser detectado por la creciente proporción de color ocular variado (ojo blanco). Por el contrario, la disminución de la heterocrocina se detectaría por la creciente proporción de la expresión transgénica P[lac-w] (ojo rojo)9,10,11,12.

Por lo tanto, aprovechamos este sistema de transgénesis Drosophila que produce un fenotipo de color ocular variado ya que su expresión está directamente correlacionada con la cantidad de heterocrocina presente. Tras el descubrimiento de compuestos que se sospecha que promueven la formación de heterocromatina, podemos confirmar esta sospecha utilizando otros métodos como la mancha occidental. Estas sustancias promotoras de heterocromatina pueden desarrollarse aún más para ensayos clínicos en pacientes en el futuro.

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Protocolo

1. Preparación de la biblioteca de medicamentos

  1. Identificar y preparar una biblioteca de medicamentos para ser examinado utilizando el disolvente adecuado a la concentración deseada (por ejemplo, 10 mM en DMSO).
    NOTA: Un ejemplo específico de una biblioteca de medicamentos es el Programa de Terapéutica del Desarrollo (DTP) Set III del Instituto Nacional del Cáncer (NCI). Los compuestos de este conjunto se proporcionan como 20 l a 10 ml en 100% DMSO en dos placas de fondo en U de 96 pocillos y se almacenan a -20 oC. Los mapas de la placa NCI, y los datos químicos básicos de cada medicamento se pueden encontrar en los siguientes sitios web:
    Número de placa NCI 4740
    Número de placa NCI 4741

2. Pantalla para detectar medicamentos que promueven la heterocromatina usando Drosophila

  1. Drosophila Estrategia de cría (Figura 1A)
    1. Día 1: Cruz tres w1118/Y; DX1/CyO moscas macho y tres o más moscas vírgenes w1118 hembra en un vial de alimentos de 25 mm x 95 mm con 9 ml de medios alimenticios Drosophila estándar (receta Bloomington). Configure tres viales de réplica para cada medicamento y un control para la pantalla.
      NOTA: Las moscas DX1 fueron amablemente proporcionadas por James Birchler (Universidad de Missouri)9,13.
    2. Día 2 y Día 3: Permita que las moscas pongan huevos durante 2 días a temperatura ambiente (22oC).
    3. Día 4: Use una ráfaga corta deCO2 de gas para anestesiar a las moscas madre y deshacerse de las moscas principales en una "morgue de moscas" (una botella que contiene 70% de alcohol).
  2. Alimente los medicamentos a Drosophila para su detección.
    1. Diluir cada compuesto de fármaco de la población original (20 ml a 10 mM en DMSO 100% en placas de fondo u de PP de 96 pocillos) a una concentración final de 10 M con 33% de DMSO en agua. Use 33% DMSO en agua sin ningún medicamento como control.
      NOTA: Algunos medicamentos son poco solubles en agua y se disolvieron en DMSO. 100% DMSO es tóxico para las moscas. El 33% es tolerable.
    2. Día 4: Pipeta de 60 ml de una solución de drogas de 10 m o control sobre la parte superior de los alimentos con mosca. En este punto, asegúrese de que las moscas madre han sido removidas y hay huevos de mosca y larvas de primera estrella arrastrándose en la comida.
    3. Día 6: Repetir el pipeteo de 60 ml de la misma solución de medicamentos de 10 m al vial de alimentos.
      NOTA: Dado que se añadieron medicamentos en los alimentos con mosca, el alimento de la superficie superior contiene una concentración de casi 10 m y el alimento inferior no se pudo penetrar completamente. Todas las moscas ponen huevos en la parte superior de la comida y comen la parte superior de la superficie de los alimentos.
  3. Observe y puntúe los cambios de color de los ojos.
    1. Dos días después de que las moscas F1 emergen (aproximadamente en el día 14), examine las moscas. Utilice una ráfaga corta de CO2 para anestesiar las moscas F1 y retire las moscas de su vial en una almohadilla de disección porosa con CO2 sin sumergir desde debajo de un papel de filtro.
    2. Inspeccione las moscas de esta almohadilla bajo un microscopio de disección. Examine toda la mosca e identifique todo w1118/Y; DX1/+ machos heterocigotos por su falta del fenotipo dominante de ala rizada CyO.
    3. Puntuar el color de los ojos de cada uno de los w1118/Y; DX1/+ macho heterocigoto vuela en una escala de 1 a 5(Figura 1B). El porcentaje de color de ojos blancos se calificó de la siguiente manera:
      1. <5% rojo área de superficie total del ojo disperso
      2. 6% - 25% manchas rojas manchas manchas superficie total
      3. 26% - 50% manchas rojas manchas manchas superficie total
      4. 51% - 75% manchas rojas manchas manchas superficie total
      5. >75% manchas rojas de la superficie total del ojo
      NOTA: Alternativamente, homogeneice las cabezas volantes en 100% de metanol y utilice un espectrómetro para medir la pigmentación ocular a 450 nm. Seleccione sólo machos porque PEV es más pronouced en DX1 machos. Puntuar más de 10 machos en cada vial.
    4. Calcular el índice de color medio de todos los machos de cada vial puntuado. Realizar triplicados para cada compuesto(Figura 1C).
      NOTA: Dado que el color de los ojos varía según la edad, este es un paso sensible al tiempo. El color de los ojos debe calcularse a la misma edad – 2 días de edad. Por lo general >10 moscas deben ser puntuados en cada vial.
    5. Para confirmar que los compuestos efectivamente promueven la formación de heterocromatina, utilice una técnica diferente como la hincha occidental para validar (Figura 1G).

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Resultados

Este protocolo se utilizó con éxito para detectar compuestos que promueven la formación de heterocrofina en Drosophila,que es un sistema in vivo eficiente y de bajo costo para el desarrollo de fármacos(Figura 1). Hemos examinado una biblioteca de fármacos de molécula pequeña, Oncology Set III, que se compone de 97 medicamentos oncológicos autorizados por la FDA, utilizando la cepa DX1 de Drosophila melanogaster (Figura 1B

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Discusión

La heterocrocrotina es una forma condensada de ADN que desempeña un papel central en la regulación de la expresión génica. Cada vez es más reconocido en el cáncer y puede servir como un objetivo potencial para la terapia oncológica15,16,17,18. Compuestos de molécula pequeña se utilizan comúnmente en el desarrollo de fármacos debido a las ventajas en la fabricación, preservación, y el metabolism...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a J. Birchler, E. Bach y el Bloomington Drosophila Stock Center por varias cepas drosophila; el Programa de Terapéutica del Desarrollo del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) para la Biblioteca de fármacos de moléculas pequeñas; Estudiantes de pregrado de la UCSD incluyendo Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza y Alex Chávez. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por una beca de investigación de la American Thoracic Society a J.L. y financiación de NIH: R01GM131044 a W.X.L.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DrosophilaDX1 cepaDX1 fueron amablemente proporcionadas por James Birchler (Universidad de Missouri)
Drosophila medios alimentariosUCSD cocina de moscas
MethotrexateNCI biblioteca
de medicamentos Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650
Etilo alcoholSigmaE7023-500ML
Las moscas

Referencias

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