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Artículo de método

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

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DOI:

10.3791/60925

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2 de marzo de 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

En este artículo

Resumen

La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BBB) está formada por unidades neurovasculares (NFI) que protegen el sistema nervioso central (SNC) de una serie de factores que se encuentran en la sangre que pueden alterar la delicada función cerebral. Como tal, el BBB es un obstáculo importante para la entrega de terapias al SNC. La acumulación de evidencia sugiere que el BBB desempeña un papel clave en la aparición y progresión de las enfermedades neurológicas. Por lo tanto, existe una enorme necesidad de un modelo BBB que pueda predecir la penetración de fármacos dirigidos al SNC, así como dilucidar el papel de la BBB en la salud y la enfermedad.

Recientemente hemos combinado tecnologías de células madre pluripotentes (iPSC) de órgano en chip para generar un chip BBB totalmente personalizado para los seres humanos. Esta novedosa plataforma muestra propiedades celulares, moleculares y fisiológicas que son adecuadas para la predicción del transporte de fármacos y moléculas a través de la BBB humana. Además, utilizando chips BBB específicos del paciente, hemos generado modelos de enfermedad neurológica y demostrado el potencial para aplicaciones de medicina predictiva personalizada. Aquí se proporciona un protocolo detallado que demuestra cómo generar chips BBB derivados de iPSC, comenzando con la diferenciación de las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC (iBMECs) y dando como resultado cultivos neuronales mixtos que contienen progenitores neuronales, neuronas diferenciadas y astrocitos. También se describe un procedimiento para la sembración de células en el chip del órgano y el cultivo de los chips BBB bajo flujo laminar controlado. Por último, se proporcionan descripciones detalladas de los análisis de chip BBB, incluidos los ensayos de permeabilidad paracelulares para evaluar la permeabilidad de fármacos y moléculas, así como métodos inmunocitoquímicos para determinar la composición de los tipos de células dentro del chip.

Introducción

El BBB es una barrera altamente selectiva que separa el SNC de la sangre circulante. Protege las funciones cerebrales críticas de sustancias, factores y xenobióticos potencialmente disruptivos, al tiempo que permite la afluencia de nutrientes y otros metabolitos necesarios para mantener la homeostasis cerebral1. El BBB es un NVU multicelular en el que los procesos pericitados, los pies de los pies finales de la astrocitos y los neuronales contactan directamente con las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas interacciones permiten a los BMEC formar propiedades de barrera especializadas que son soportadas por cruces apretados y adheridos2,3. La formación de esta barrera limita el paso paracelular de moléculas, pero contiene transportadores polarizados para transportar activamente moléculas al SNC o de vuelta a la sangre1. Debido a estas propiedades únicas de barrera, el BBB constituye un obstáculo importante para la entrega de biofarmacéuticos en el cerebro, y se estima que menos del 5% de las moléculas pequeñas aprobadas por la FDA pueden llegar al SNC4.

Los modelos animales se han utilizado ampliamente para estudiar la penetración bBB y los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de BBB5. Mientras que los modelos animales representan fielmente el complejo entorno multicelular in vivo, las diferencias en la expresión y la actividad de los transportadores BBB, así como la especificidad del sustrato entre especies a menudo impiden la extrapolación precisa de los datos de los animales a los seres humanos6. Por lo tanto, los modelos basados en humanos son críticos para estudiar el BBB humano y para su uso en el desarrollo de fármacos diseñados para atacar el SNC. Esta necesidad se hace aún más evidente con el creciente dominio de los medicamentos biológicos específicos para el ser humano en el campo del desarrollo farmacéutico. La acumulación de evidencia sugiere que un BBB comprometido está asociado con una serie de trastornos graves del SNC, incluyendo tumores cerebrales y enfermedades neurológicas7,8,9. Los modelos humanos que reflejan fielmente estas enfermedades tienen el potencial de identificar dos vías novedosas que podrían ser dirigidas al desarrollo de fármacos y 2) predecir la penetración del SNC, reduciendo así el tiempo y los recursos en los estudios preclínicos y posiblemente disminuyendo la tasa de fracaso en los ensayos clínicos.

Los modelos in vitro se han implementado ampliamente para estudiar las interacciones entre los BMEC y otras células de la NVU y realizar pantallas para posibles fármacos permeables a BBB10. Para recrear aspectos clave del BBB humano, los modelos in vitro deben mostrar propiedades fisiológicamente relevantes (es decir, baja permeabilidad paracelular y resistencia eléctrica transendotelial fisiológicamente relevante [TEER] a través de la monocapa endotelial). Además, el perfil molecular de un sistema in vitro debe incluir la expresión de sistemas de transporte funcional representativos. Típicamente, los modelos in vitro se componen de células endoteliales que se cultivan co-cultivo en una membrana semipermeable con combinaciones de otras células NVU para mejorar las propiedades BBB11. Este enfoque permite una evaluación simple y relativamente rápida de la funcionalidad de barrera y la permeabilidad de las moléculas. Estos modelos BBB basados en células se pueden establecer con fuentes celulares animales o humanas, incluyendo células aisladas de escisiones quirúrgicas o líneas BMEC inmortalizadas.

Recientemente, se introdujeron protocolos para diferenciar células pluripotentes humanas en BMECs como una fuente atractiva para los modelos BBB humanos in vitro12,13. Los BMEC derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son altamente escalables, demuestran características morfológicas y funcionales cruciales del BBB humano y llevan la genética del paciente. En el cultivo, los iBMEC forman una monocapa que expresa marcadores de unión apretados y muestra complejos de unión estrecha in vivo-como. Estas células también expresan marcadores BBB, incluyendo el transportador de glucosa BBB, transportador de glucosa 1 (GLUT1). Es importante destacar, y a diferencia de otras fuentes celulares alternativas para los MCC humanos, los iBMEC adquieren propiedades de barrera con valores tan altos como los medidos in vivo14,polarizan a lo largo del eje basolateral y expresan bombas de eflujo funcional. Además, el uso de iPSCs de diversas asignaturas tanto 1) acoge con beneplácito la oportunidad de probar aspectos de la BBB de manera personalizada y 2) proporciona una fuente flexible para generar tipos de células adicionales de la NVU. La generación de estas células a partir de una fuente celular isogénica para crear chips BBB personalizados también ayudaría a comprender las diferencias interindividuales en las respuestas a los medicamentos, que es una causa importante de resistencia o respuesta comprometida al tratamiento observado en estudios clínicos.

El uso de iBMECs como monocapas en un plato o en una plaquita transwell semi permeable representa un enfoque potente para el modelado BBB. Estos sistemas tienden a ser robustos, reproducibles y rentables. Además, los análisis funcionales como el TEER y la permeabilidad son relativamente fáciles de realizar. Sin embargo, los sistemas bidimensionales (2D) no recapitulan la naturaleza 3D del tejido in vivo, y carecen de las fuerzas fisiológicas de tensión de cizallamiento proporcionadas por la sangre circulante y las células sanguíneas. Esto limita la capacidad del endotelio vascular en estos modelos para desarrollar y mantener propiedades y funciones intrínsecas de BBB.

Los sistemas microingenieros forrados por células vivas se han implementado para modelar diversas funcionalidades de órganos en un concepto llamado órgano en chip. Al recrear arquitectura multicelular in vivo-como, interfaces tejido-tejido, microambientes fisicoquímicos y perfusión vascular, estas plataformas microingeniería generan niveles de funcionalidad de tejido y órgano sin ser posible con sistemas de cultivo 2D convencionales. También permiten una alta resolución, imágenes en tiempo real y análisis de perfiles bioquímicos, genéticos y metabólicos similares a las células vivas en el contexto del tejido in vivo y los órganos. Sin embargo, un desafío particular del órgano en chip es que el diseño, la fabricación y la aplicación de estos chips microingenieros requieren experiencia especializada en ingeniería que generalmente carece de laboratorios académicos orientados biológicamente.

Recientemente hemos combinado las tecnologías iPSC y organ-on-chip para generar un chip BBB personalizado modelo15,16. Con el fin de superar los desafíos tecnológicos descritos, el Chip-S1 disponible comercialmente se utiliza junto con el módulo de cultivo, un instrumento diseñado para automatizar el mantenimiento de los chips de una manera simple y robusta (Emulate Inc.). El chip BBB recrea interacciones entre células neuronales y endoteliales y logra valores TEER fisiológicamente relevantes, que se miden mediante chips de órgano hechos a medida con electrodos de oro integrados17. Además, el chip BBB muestra baja permeabilidad paracelular, responde a señales inflamatorias a nivel de órganos, expresa bombas de eflujo activo y exhibe transporte predictivo de biomarcadores solubles y biofarmacéuticos. En particular, los chips BBB generados a partir de varios individuos capturan las diferencias funcionales esperadas entre individuos sanos y pacientes con enfermedades neurológicas15.

El protocolo detallado a continuación describe un método confiable, eficiente y reproducible para la generación de chips BBB basados en iPSC humanos en condiciones de flujo dinámico. Se proporciona orientación sobre el tipo de ensayos y análisis de punto final que se pueden realizar directamente en el chip BBB o a partir de efluentes de muestreo. Por lo tanto, el protocolo demuestra el espectro de técnicas que se pueden aplicar para evaluar las propiedades y respuestas biológicas y funcionales en un modelo relevante para el ser humano.

Aquí se proporciona una breve descripción del chip BBB basado en iPSC. Los iPSC humanos se diferencian y propagan inicialmente en matraces de cultivo de tejidos como agregados flotantes libres de progenitores neuronales, llamados esferas EZ. El canal superior del Chip-S116,18,19 está sembrado con esferras EZ disociadas que forman el "lado cerebral" del chip, ya que las células se diferencian durante 7 días en un cultivo mixto de células progenitoras neuronales (iNCAP), iAstrocytes e iNeurons. Los iPSC humanos también se diferencian en placas de cultivo de tejidos en iBMECs. El canal inferior del chip se sembra con iBMECs para formar el "lado de la sangre" a medida que se desarrollan para formar un tubo endotelial (Figura 1). La membrana recubierta de matriz extracelular porosa (ECM) que separa los canales superior e inferior 1) permite la formación de interacciones de célula a célula entre los canales y 2) permite al usuario ejecutar ensayos de permeabilidad y células de imagen en cualquiera de los canales utilizando un microscopio de luz convencional.

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Protocolo

1. Generación de células progenitoras neuronales derivadas de iPSC (iNPC)

  1. Producir EZ-esferas a partir de colonias iPSC como se describe a continuación y como se publicó anteriormente20,21,22.
    1. Cultivo de colonias iPSC para confluencia en 6 placas de pozores recubiertos con matriz de membrana de sótano (0,5 mg/placa) en mTESR1 u otros medios comerciales (ver Tabla de Materiales).
    2. Retire el medio iPSC y sustitúyalo por 2 ml de medio EZ-sphere [ESM; DMEM:F12 7:3 complementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico de 100 ng/ml (bFGF), factor de crecimiento epidérmico de 100 ng/ml, 5 g/ml de heparina y 2% de suplemento B27].
    3. Raspa la parte inferior de cada pozo de confluente con la parte posterior de una punta estéril de pipeta de 1000 ml o un rascador de células.
    4. Recoger todas las células y colocar en un matraz T25 de unión ultrabajo para permitir la formación espontánea de esferas flotantes. Incubar durante la noche a 37oC.
    5. Alimentar las esferas cada 2-3 días cuando el medio se vuelve amarillo reemplazando la mitad del medio con ESM fresco. Esto permite que las esferas permanezcan en medio acondicionado, lo que es muy importante para su crecimiento y mantenimiento.
      1. Incline el matraz en un estante de tubo y deje que las esferas se asienten por gravedad durante 1-2 minutos hasta la esquina del matraz.
      2. Una vez asentado, aspirar la mitad del sobrenadante con una pipeta serológica de 5 ml o 10 ml y reemplazarla con UN ESM fresco y precalentado.
    6. Pasaje EZ-esferas semanalmente cortando esferas a 200 m de diámetro como se describió anteriormente23,20,21. Las esferas EZ se pueden mantener durante un máximo de 25 pasajes y son ideales cuando se utilizan entre los pasajes 8–25.
  2. Preparar la suspensión de una sola célula de iNCAP:
    1. Para inducir la diferenciación neuronal, disocia la esfera EZ en células individuales.
    2. Recoger las esferas de 3 a 4 días después de cortar desde un matraz T75 y transferir en un cónico de 15 ml, a continuación, dejar reposar durante 2 minutos o hasta que todas las esferas se asentar en la parte inferior.
    3. Retire lentamente el ESM con una pipeta de 5 ml sin interrumpir las esferas asentadas. Añadir 1 mL de solución de disociación (ver Tabla de Materiales)e incubar durante 10 min a 37oC.
    4. Gire la solución de disociación y las esferas después de 5 minutos de incubación para asegurarse de que se traten las esferas asentadas.
    5. Retire lentamente la solución de disociación. Añadir 1 ml de medio de diferenciación neuronal [NDM; DMEM: F12 con 2% B27 menos vitamina A, 1% N2 suplemento, y factor neurotrófico derivado del cerebro humano (hBDNF, 20 ng/mL)].
    6. Tritura las esferas en células individuales pipeteando utilizando una pipeta de 1 ml seguida de una pipeta de 200 ml, hasta que todas las esferas se hayan disociado. Evite la formación de burbujas durante el procedimiento de trituración.
    7. Cuente las células disociadas usando un hemocitómetro y diluya las células a una densidad final de 1 x 106 células/ml. Es posible cambiar la densidad dependiendo de la aplicación.
      NOTA: Se recomiendan densidades más altas (hasta 6 x 106 celdas/ml) para cultivos a corto plazo de hasta 3 días, y se recomiendan densidades más bajas para aplicaciones a largo plazo de hasta 3 semanas.
      NOTA: Las células ahora están listas para sembrar en el canal superior del chip para formar el "lado del cerebro".

2. Diferenciación de iPSCens en iBMECs

  1. Pasaje de iPSCs de un solo pozo de confluente de una placa de 6 pozos en una proporción de 1:6 en una placa recubierta de matriz de membrana de sótano de 6 pozos. Deje que las células se adhieran durante 24 h. Cambie el medio iPSC diariamente.
  2. Cuente las células diariamente usando un hemocaquímetro.
  3. Cuando las células alcancen una densidad de 1,5–3,0 x 105 células/pozo, reemplace el medio iPSC por 3 ml de medio no acondicionado sin bFGF [DMEM:F12 1:1, con 10% de reemplazo sérico de knockout (KOSR), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 0,5% de suplemento de glutamina (Tabla de Materiales)y 100 m de mertocaptoetanol]. Reemplace el medio diario durante 6 días24.
  4. En el día 6, sustituya el medio por un medio de células endoteliales (EC) [medio libre de suero endotelial humano (hESFM) complementado con un 1% de suero bovino derivado del plasma pobre en plaquetas, 20 ng/ml bFGF y ácido retinoico (RA) todo trans de 10 m]. Dejar medio durante 2 días.
  5. Retire el medio EC y añada 1 ml de solución de disociación por poca. Incubar a 37oC durante 35 min.
    NOTA: Si bien esto se considera un largo tiempo de incubación en la solución de disociación utilizada aquí, los iBMEC pueden soportar este tratamiento con una viabilidad celular superior al 90%.
  6. Separe las células del pozo pipeteando suavemente la suspensión celular y recogiendo todas las células en un tubo cónico de 15 ml.
    NOTA: Evite el pipeteo áspero. Si las células no se separan fácilmente, incubar durante 5 min adicionales.
  7. Añadir 1 volumen de medio EC en la cónica de 15 ml para inactivar Accutase, centrifugar a 200 x g durante 5 min, eliminar el medio y reemplazar por 1 mL de medio EC (sin bFGF y RA).
  8. Cuente las células usando un hemocitómetro y ajuste la densidad celular a 14–20 x 106 células/ml.
    NOTA: Las celdas ahora están listas para ser sembradas en el canal inferior del chip para formar el "lado de la sangre".

3. Microfabricación del chip de órgano

  1. Utilice un chip de órgano para el modelo de chip BBB y su producción como se hizo anteriormente16,18,19. El chip de órgano de canal alto (ver Tabla de Materiales)está fabricado a partir de un elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) altamente flexible que contiene dos canales microescala superpuestos y paralelos separados por una membrana porosa flexible. Los tamaños de microcanal superior e inferior son 1 mm x 1 mm y 1,0 mm x 0,2 mm, respectivamente. Los dos canales están separados por una membrana porosa flexible hecha portuosa de PDMS de 50 m de espesor, que contiene poros de 7 m de diámetro con un espaciado de 40 m. La superficie de la membrana porosa que separa los canales es de 0,171 cm2.

4. Preparación de virutas

  1. Los chips de órgano se suministran preenvasados dentro del portador de virutas, eliminando la necesidad de perturbar o distorsionar la alineación de la viruta durante la manipulación. Además, el portador de chip se conecta de forma segura a un módulo portátil ("Pod") que actúa como interfaz entre el módulo de cultivo y el chip.
    1. Rocíe el embalaje de las virutas con 70% de etanol y traiga al gabinete de bioseguridad (BSC).
    2. Abra el embalaje y auna el chip del órgano en un plato estéril de Petri. Manipule el portador de la viruta solo por los lados para evitar el contacto directo con el chip.
    3. Asegúrese de que la pestaña del portador esté orientada hacia la derecha(Figura 2)y cuando utilice varios chips, alinee todos ellos en la misma orientación.
    4. Etiquete cada chip en la pestaña portadora (la preparación completa del chip y el flujo de trabajo se muestran en la Figura 3).

5. Activación de la superficie y recubrimiento ECM

  1. Preparación de la solución de activación superficial
    1. El reactivo de emulado 1 (ER-1), suministrado en un vial que contiene 5 mg, es sensible a la luz. Prepare la nueva solución ER-1 inmediatamente antes de su uso. La integridad del ER-1 es crucial en la preparación exitosa de los chips.
    2. Apague la luz del BSC cuando manipule ER-1.
      NOTA: Er-1 es un irritante para los ojos y debe manipularse en el BSC con guantes y protección ocular adecuados.
    3. Permita que los reactivos ER-1 y ER-2 se equilibren a temperatura ambiente (RT) antes de su uso.
    4. Proteja la solución de la luz envolviendo un tubo cónico estéril vacío de 15 ml con papel de aluminio.
    5. En el BSC, toque brevemente el vial ER-1 para ajustar el polvo en la parte inferior.
    6. Añadir 1 ml de tampón ER-2 al vial, y transferir inmediatamente su contenido a la parte inferior del tubo cónico envuelto de 15 ml. No pipetear para mezclar. El color de la solución transferida al tubo cónico será rojo.
    7. Repita el paso 5.1.6 3x. En la última ronda, tapar el vial ER-1 e invertir para recoger cualquier polvo restante de la tapa, luego transferir la solución al tubo cónico; esto llevará el volumen total a 4 ml de la solución ER-1.
    8. Añadir 6 ml de solución ER-2 a los 4 ml de solución ER-1 en el tubo cónico de 15 ml a una concentración final de 0,5 mg/ml. Er-1 debe disolverse completamente dentro de la solución ER-2.
  2. Activación de la superficie
    1. Utilizando una pipeta P200 y una punta de pipeta filtrada estéril de 200 l, ocupa 200 ml de mezcla ER-1.
    2. Coloque la pipeta en la entrada inferior y empuje 20 ml de mezcla DE ER-1 a través del canal inferior hasta que la mezcla comience a fluir fuera de la salida del canal inferior.
    3. Agregue aproximadamente 50 s de mezcla ER-1 y colóquela en la entrada del canal superior. Empuje la mezcla a través del canal superior hasta que comience a salir de la salida del canal superior.
    4. Retire todo el exceso de mezcla ER-1 de la superficie del chip por aspiración suave. Asegúrese de que la mezcla ER-1 sólo se elimina de la superficie de la viruta y no de los canales.
    5. Compruebe que los canales estén libres de burbujas de aire antes de la activación ultravioleta (UV). Si se detectan burbujas de aire, retire las burbujas lavando el canal con la mezcla ER-1.
    6. Coloque el plato abierto que contiene los chips en la caja de luz UV (proporcionado por Emulate Inc.).
    7. Ajuste el interruptor en la parte posterior de la caja de luz UV al ajuste "Consistente". Encienda la alimentación e inicie la activación UV. Deje las virutas bajo luz UV durante 20 min.
      NOTA: Evite la exposición del personal a la luz UV.
    8. Retire la mezcla ER-1 de ambos canales.
    9. Lave cada canal con 200 ml de solución ER-2.
    10. Retire el ER-2 de ambos canales.
    11. Lave cada canal con 200 ml de solución salina con fosfato (DPBS) en frío estéril de Dulbecco.
    12. Deje DPBS frío dentro de los canales hasta que pase al siguiente paso.
  3. Preparación y recubrimiento de matriz extracelular (ECM)
    1. Prepare la solución de ECM combinando los componentes individuales de ECM con DPBS frío, agua u otro disolvente con las concentraciones finales de trabajo. La solución de ECM debe prepararse fresca cada vez que se utilice.
    2. Recubrir los canales superior e inferior del chip con ECM, con la composición determinada por el tipo de celda a ser sembrada. La mezcla de ECM debe mantenerse en hielo hasta su uso.
    3. Utilice laminina (50 g/ml) para recubrir el "lado del cerebro", y colágeno IV y fibronectina mezclados en una proporción de 4:1 (320:80 g/ml) para recubrir el "lado de la sangre" como se describe en la sección 5.6.
  4. Preparación de alícuotas ECM
    1. Diluir 1 mg/ml de lamininen en DPBS en frío a una concentración final de 50 g/ml. Aliquot y conservar a -20oC hasta su uso.
    2. Disolver el colágeno IV en 0,1% de ácido acético a una concentración de 1 mg/ml. Incubar la solución a 2-8 oC durante la noche o a RT durante 1-3 h o hasta que se disuelva por completo.
    3. Preparar una mezcla de 1 ml de colágeno IV:fibronectina (320 ml de colágeno IV, 80 ml de fibronectina, 600 ml de h2O estéril de doble destilado). La mezcla se puede almacenar a -20 oC.
  5. Recubrimiento de las virutas con ECM
    1. Aspirar completamente el DPBS frío de ambos canales. Establezca una pipeta P200 para que tome 100 ml de solución de colágeno IV:fibronectina.
    2. Introducir la solución a través de la entrada del canal inferior hasta que se forme una pequeña gota en la salida. Deje una gota pequeña en la entrada después de retirar la punta de la pipeta.
    3. Introducir la solución de laminina a través de la entrada del canal superior hasta que se forme una pequeña gota en la salida. Deje una gota pequeña en la entrada después de retirar la punta de la pipeta.
    4. Observe atentamente los canales para asegurarse de que no haya burbujas presentes. Si hay burbujas, lave el canal con la solución de ECM adecuada hasta que se retiren todas las burbujas.
    5. Repita los pasos 5.5.1–5.5.4 para cada chip.
    6. Añadir 1,5 ml de DPBS a la tapa de un tubo cónico de 15 ml. Coloque la tapa DPBS en el plato de cultivo de 150 mm con las virutas para proporcionar humedad adicional y sellar el plato con parafilm. Para obtener los mejores resultados, incubar los chips a 4 oC durante la noche.
      NOTA: Si se desea, las células se pueden sembrar el mismo día que la activación de la viruta y el recubrimiento DeCM, aunque se prefiere la incubación durante la noche. Las fichas pueden estar listas para la sembración 4 h después de añadir el ECM y incubar chips a 37 oC.

6. Sembrar el canal del "lado del cerebro" y diferenciar las esferas EZ en cultivos neuronales mixtos

  1. Lleve el plato que contiene las fichas preparadas al BSC. Lave suavemente ambos canales con 200 ml de NDM.
  2. Evitando el contacto con los puertos, aspirar cuidadosamente gotas de medios excedentes de la superficie del chip. Agitar suavemente la suspensión celular antes de sembrar cada chip para asegurar una suspensión celular homogénea
  3. Sembrar los iNCO en el canal superior para generar el "lado del cerebro"
    1. Sembrar las células (1 x 106 celdas/ml) en el canal superior del chip. Agregue una punta P200 que contenga 30–100 l de suspensión de células a la entrada del canal superior y suelte suavemente la punta de la pipeta. Tome una pipeta P200 vacía, presione el émbolo, inserte en la salida del canal superior y tire cuidadosamente de la suspensión de las células individuales a través del chip.
    2. Cubra el plato y transfiera al microscopio para comprobar la densidad de semillas y la distribución homogénea de las células dentro del canal superior. Retire suavemente la punta de la pipeta de los puertos de entrada y salida de la viruta.
    3. La densidad de sembrado debe aparecer como una cobertura del 20%. Si la densidad de sembrado es mayor o menor de lo esperado o desigual, devuelva las virutas al BSC, lave el canal 2x con 200 ml de medio fresco y repita el paso 6.3.1.
    4. Después de confirmar la densidad celular correcta, coloque inmediatamente las virutas en la incubadora durante 2 h a 37 oC después de sembrar cada lote de virutas. Lave las células que no se adhieren con NDM fresco.
    5. Mantenga las células bajo condiciones estáticas a 37 oC con un reemplazo diario de NDM por al menos 48 h antes de iniciar el flujo. Los iBMEC se pueden sembrar después de que los iNPC se hayan conectado o en un día posterior a la sembración del iNPC.

7. Sembrar iBMECs en el canal inferior para generar el "lado de la sangre"

  1. Lleve el plato que contiene las fichas preparadas al BSC. Lave suavemente el canal inferior con 200 ml de medio EC.
  2. Evitando el contacto con los puertos, aspirar cuidadosamente gotas de exceso de medio EC de la superficie del chip, asegurándose de dejar el medio en ambos canales. Agitar suavemente la suspensión celular antes de sembrar cada chip para asegurar una suspensión de células homogénea.
  3. Con una pipeta P200, dibuje 30–100 l de la suspensión de la célula iBMEC (14–20 x 106 células/ml) y coloque la punta en la entrada del canal inferior. Desconecte suavemente la punta de la pipeta, dejando la punta que contiene la célula en el puerto de entrada.
  4. Presione el émbolo en una pipeta P200 con una punta vacía, inserte en la salida del canal inferior y tire cuidadosamente de la suspensión de una sola celda a través del canal inferior liberando lentamente el émbolo de la pipeta.
  5. Aspirar el exceso de suspensión celular de la superficie de la viruta. Evite el contacto directo con los puertos de entrada y salida para asegurarse de que no se aspira ninguna suspensión celular fuera de los canales.
  6. Cubra el chip y transfiéralo al microscopio para observar la densidad de la sembración. El canal inferior debe llenarse sin espacios observables entre las células cuando se observe en 4x o 10x bajo un microscopio(Figura 4).
  7. Si la densidad de sembrado es inferior al 90% de la cobertura o se distribuye de manera desigual, ajuste la densidad celular en consecuencia y repita los pasos 7.2–7.6 hasta que se logre la densidad correcta dentro del canal. Después de confirmar la densidad celular correcta(Figura 4), las células de semillas en los chips restantes. Para unir las células a la membrana porosa, que se encuentra en la parte superior del canal inferior, invierta cada chip y descanse en una base de viruta.
  8. Coloque un pequeño depósito (15 ml de tapa cónico de tubo que contenga DPBS estéril) dentro de la placa de 150 mm para proporcionar humedad a las células. Incubar virutas a 37 oC durante aproximadamente 3 h, o hasta que las células del canal inferior se hayan conectado. Una vez que los iBMECs se hayan conectado (3 h después de la separación), voltee los chips de nuevo a una posición vertical para permitir la fijación de la celda a la parte inferior del canal inferior.

8. Iniciación del flujo

  1. El flujo se inicia típicamente 48 h después de la sembración de iBMECs. Este tiempo es necesario para que los iBMECs se conecten firmemente al chip.
  2. Para mantener el flujo laminar a través de la viruta, es importante desgasar y equilibrar la temperatura del medio. El medio debe precalentarse en un baño de agua de 37oC durante 1 h.
  3. Se pueden desgasifimar hasta 50 ml de medio caliente mediante incubación bajo un sistema de filtración accionado por vacío durante 15 min.
  4. Priming de módulos portátiles
    1. Desinfecte el exterior del módulo portátil de embalaje y bandejas con 70% de etanol, limpie y transfiera al BSC. Abra el paquete y coloque los módulos en la bandeja. Orientarlos con los depósitos hacia la parte posterior de la bandeja.
    2. Pipeta de 3 ml de medios preequilibrados y calientes para cada depósito de entrada. Agregue el medio de cultivo EC al depósito de entrada del canal inferior y NDM al depósito de entrada del canal superior del canal superior(Figura 5).
    3. Pipeta de 300 ml de medios calientes preequilibrados a cada depósito de salida, directamente sobre cada puerto de salida(Figura 5).
    4. Coloque hasta seis módulos portátiles en cada bandeja. Lleve las bandejas a la incubadora y deslice completamente en el módulo de cultivo con el mango de la bandeja mirando hacia afuera.
    5. Seleccione y ejecute el ciclo "Prime" en el módulo de referencia cultural. Cierre la puerta de la incubadora y permita que el módulo de cultivo prima los módulos portátiles (tarda 1 minuto). El ciclo de cebado se completa cuando la barra de estado dice "Listo". Retire la bandeja del módulo de cultivo y llévela al BSC.
    6. Verifique que los módulos portátiles se prepararon con éxito inspeccionando la parte inferior de cada módulo portátil en el BSC. Busque la presencia de pequeñas gotas en los cuatro puertos.
      1. Si cualquier módulo portátil no muestra las gotas, vuelva a ejecutar el ciclo primo en esos módulos. Si algún medio goteaba sobre la bandeja (esto puede ocurrir con más frecuencia por los puertos de salida), limpie la bandeja con 70% de etanol.
  5. Conexión de chips a módulos portátiles, regulación e iniciación de flujo
    1. Lave suavemente ambos canales de cada chip con un medio de cultivo específico de celda caliente y equilibrado para eliminar las posibles burbujas en el canal y coloque pequeñas gotas de medios (según los medios en el canal) en la parte superior de cada puerto de entrada y salida.
    2. Inserte chips con soportes en los módulos portátiles y coloque hasta seis en cada bandeja. Inserte bandejas en el módulo de cultivo. Programe las condiciones apropiadas de cultivo de virutas de órganos (velocidad de flujo y estiramiento) en el módulo de cultivo.
    3. Las condiciones programadas comenzarán tan pronto como se complete el ciclo "Regular".
      NOTA: Los caudales de cada canal se pueden controlar de forma independiente y se pueden ajustar a velocidades que oscilan entre 0 y 1.000 l/h. El chip BBB se cultiva típicamente a 30 L/h. Cuando fluyen medios como medios EC o ESM a 30 l/h y 1000 l/h, las fuerzas de cizallamiento son de 0,01 dyn/cm2 y 0,33 dyn/cm2, respectivamente.
    4. Ejecute el ciclo "Regular", que toma aproximadamente 2 h, después de lo cual el módulo de cultivo comenzará a fluir en las condiciones de cultivo de chip de órgano preestablecido.

9. Evaluación de la permeabilidad de sangre a cerebro

  1. Preparar NDM complementado con 10 g/ml de dextran-FITC (4 kDa). Esta solución se utilizará como entrada para el canal "lado de la sangre".
  2. Llenar los depósitos de canal inferior de los módulos portátiles con NDM complementado con dextran-FITC. Llene los depósitos del canal superior con NDM sin el trazador.
  3. Perfundie ambos, los canales superior e inferior a un caudal de 30 l/h durante al menos 4 h hasta que se acumulen suficientes medios para ser recogidos para la evaluación de la fluorescencia en un lector de placas (normalmente 100 l).
  4. Recopile muestras de medios de los depósitos de entrada y salida de los canales superior e inferior. Proteja las muestras de la luz.
  5. Diluir en serie el NDM complementado con 10 g/ml de dextran-FITC 1:1 utilizando NDM sin trazador para generar una curva de calibración de 10-12 puntos.
  6. Tomar 100 ml de cada muestra, incluida la curva de calibración, en una placa negra de 96 pocillos y leer la fluorescencia utilizando un lector de placas (excitación de 485 nm, emisión de 530 nm).
  7. Utilice los valores medidos para calcular los valores de laaplicación P de la siguiente manera:

figure-protocol-1

  1. Tome medidas diarias para evaluar las propiedades de la barrera y confirmar que el chip BBB sigue funcionando.

10. Inmunocitoquímica

  1. Lleve las papas fritas a una campana de humo químico. Usando una pipeta P200, fije las células perfundiendo ambos canales con 200 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% en DPBS e incubar durante 10 minutos en RT.
  2. Después de la fijación, persiga cada canal con 200 s de DPBS e incubar durante 5 min. Repetir lavado DPBS 2x.
  3. Bloquee y permeelice las células en el chip mediante la perfundiendo la solución de bloqueo primario (PBS, complementada con un 5% de suero de burro normal y un 0,1% de Tritón X-100). Incubar a RT durante 1 h.
  4. Diluir los anticuerpos primarios en la solución de bloqueo primario e incubar durante la noche a 4 oC. Los marcadores BMECs son GLUT-1 (1:100 dilución), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) y VE-cadherin (1:200). Los marcadores neuronales son iii-tubulina (1:1000; Tuj1o), S100 (1:500), anidación (1:1000) y GFAP (1:1000).
  5. Lave las virutas 3x con DPBS frío.
  6. Diluir los anticuerpos secundarios en la solución de bloqueo secundario (DPBS con un 5% de suero de burro normal sin Triton-X).
  7. Perfundie la solución secundaria de anticuerpos a través de ambos canales. Típicamente, los anticuerpos secundarios fluorescentes se diluyen 1:1000. Incubar durante 1 h a RT protegido de la luz.
  8. Lave las virutas 3x con DPBS.
  9. Núcleos de células de mancha mediante la perfundiendo chip con 100 l de solución DAPI. Incubar a RT durante 5 min.
  10. Lave las virutas 3x con DPBS.
  11. El chip está listo para la toma de imágenes utilizando un microscopio fluorescente vertical o invertido. La transparencia de PDMS permite la creación de imágenes en el chip de órgano intacto. Las ampliaciones superiores a 10x pueden requerir objetivos de larga distancia de trabajo debido al grosor del chip de órgano.

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Resultados

La Figura 6A,B,C representa un chip BBB sembrado con esferas EZ en el canal superior del "lado del cerebro" y iBMECs en el canal inferior del "lado de la sangre". los iBMECs fueron cabezas de cabeza primero y se les permitió fijarse durante la noche, después de lo cual las esferas EZ fueron sembradas. Las fichas se cultivaron en condiciones estáticas con reemplazo diario de medios durante siete días. El chip BBB se fijó entonces usando 4% PFA en RT durante 10 min y lavado 3 ...

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Discusión

La combinación de la tecnología de órgano en chip y las células derivadas de iPSC en la NVU es prometedora para el modelado preciso del BBB humano. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la aplicación simple y robusta del chip BBB16basado recientemente en iPSC. En la Figura 3se muestra una descripción general y una sincronización del paradigma de sembración. Para obtener y mantener funciones de barrera adecuadas para el modelado BBB, es fundamental generar u...

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Divulgaciones

Cedars-Sinai posee una participación minoritaria en Emulate, la compañía que produce los chips de órgano microfluídicos del estudio. Un oficial de Cedars-Sinai también sirve en la Junta Directiva de Emulate. Emulate no proporcionó apoyo financiero para esta investigación. Cedars-Sinai y Emulate tienen patentes presentadas relacionadas con este trabajo.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Soshana Svendsen por su edición crítica. Este trabajo fue apoyado por la beca 1621/18 de la Fundación De ciencia de Israel, el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST), Israel 3-15647, la subvención del Instituto de Medicina Regenerativa de California ID DISC1-08800, la Fundación de la Familia Sherman, la concesión NIH-NINDS 1UG3NS105703, y la subvención de la Asociación de ALS 18-SI-389. AH fue financiado por la Fundación Wallenberg (número de subvención 2015.0178).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AccutaseEMD MilliporeSCR005Solución de disociación
B27Gibco12587010
BfgfPeprotech100-18B
Chip-S1Emulate IncChip-S1Organ-Chip
Colágeno IVSigmaC5533
DAPIInvitrogenD3571
Dextran-FITCSigma46944
DMEM: F12Thermo Fisher Scientific31330038
Suero de burroSigmaD9663
Emular reactivo 1 (ER-1)Emular IncER-1
Emular reactivo 2 (ER-2)Emular IncER-2
FibronectinaSigmaF1141
Glial Proteína ácida fibrilar (GFAP)DakoZ0334
GLUT-1InvitrogenMA5-11315
GlutamaxLife Technologies35050038Suplemento de glutamina
hBDNFPeprotech450-02
KOSRThermo Fisher Scientific10828028
LamininSigmaL2020
MatrigelCorning354234Matriz de membrana basal
mTeSR1StemCell Technologies, Inc.85851
NEAAIndustrias biológicas01-340-1B
NestinaMilliporeMAB353
NutriStemIndustrias biológicas05-100-1AMedios alternativos
PECAM-1Thermo Fisher Scientific10333
Suero bovino derivado de plasma pobre en plaquetas (PPP)Tecnologías biomédicasJ64483AB
Ácido retinoico (RA)SigmaR2625
S100βAbcamab6602
Steriflip-GP Unidad de filtro superior de tubo de centrífuga estérilMillipore SCGP00525
Triton X-100SigmaX100
ZO-1 Anticuerpo monoclonalInvitrogen33-9100
β III-tubulina (Tuj1α)SigmaT8660
β-mercaptoetanolLife Technologies31350010

Referencias

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