La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.
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Artículo de método
Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana
En este artículo
Resumen
Resumen
La barrera hematoencefálica (BBB) está formada por unidades neurovasculares (NFI) que protegen el sistema nervioso central (SNC) de una serie de factores que se encuentran en la sangre que pueden alterar la delicada función cerebral. Como tal, el BBB es un obstáculo importante para la entrega de terapias al SNC. La acumulación de evidencia sugiere que el BBB desempeña un papel clave en la aparición y progresión de las enfermedades neurológicas. Por lo tanto, existe una enorme necesidad de un modelo BBB que pueda predecir la penetración de fármacos dirigidos al SNC, así como dilucidar el papel de la BBB en la salud y la enfermedad.
Recientemente hemos combinado tecnologías de células madre pluripotentes (iPSC) de órgano en chip para generar un chip BBB totalmente personalizado para los seres humanos. Esta novedosa plataforma muestra propiedades celulares, moleculares y fisiológicas que son adecuadas para la predicción del transporte de fármacos y moléculas a través de la BBB humana. Además, utilizando chips BBB específicos del paciente, hemos generado modelos de enfermedad neurológica y demostrado el potencial para aplicaciones de medicina predictiva personalizada. Aquí se proporciona un protocolo detallado que demuestra cómo generar chips BBB derivados de iPSC, comenzando con la diferenciación de las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC (iBMECs) y dando como resultado cultivos neuronales mixtos que contienen progenitores neuronales, neuronas diferenciadas y astrocitos. También se describe un procedimiento para la sembración de células en el chip del órgano y el cultivo de los chips BBB bajo flujo laminar controlado. Por último, se proporcionan descripciones detalladas de los análisis de chip BBB, incluidos los ensayos de permeabilidad paracelulares para evaluar la permeabilidad de fármacos y moléculas, así como métodos inmunocitoquímicos para determinar la composición de los tipos de células dentro del chip.
Introducción
El BBB es una barrera altamente selectiva que separa el SNC de la sangre circulante. Protege las funciones cerebrales críticas de sustancias, factores y xenobióticos potencialmente disruptivos, al tiempo que permite la afluencia de nutrientes y otros metabolitos necesarios para mantener la homeostasis cerebral1. El BBB es un NVU multicelular en el que los procesos pericitados, los pies de los pies finales de la astrocitos y los neuronales contactan directamente con las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas interacciones permiten a los BMEC formar propiedades de barrera especializadas que son soportadas por cruces apretad....
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Protocolo
1. Generación de células progenitoras neuronales derivadas de iPSC (iNPC)
- Producir EZ-esferas a partir de colonias iPSC como se describe a continuación y como se publicó anteriormente20,21,22.
- Cultivo de colonias iPSC para confluencia en 6 placas de pozores recubiertos con matriz de membrana de sótano (0,5 mg/placa) en mTESR1 u otros medios comerciales (ver Tabla de Materiales).
- Retire el medio iPSC y sustitúyalo por 2 ml de medio EZ-sphere [ESM; DMEM:F12 7:3 complementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico de 100 ng....
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Resultados
La Figura 6A,B,C representa un chip BBB sembrado con esferas EZ en el canal superior del "lado del cerebro" y iBMECs en el canal inferior del "lado de la sangre". los iBMECs fueron cabezas de cabeza primero y se les permitió fijarse durante la noche, después de lo cual las esferas EZ fueron sembradas. Las fichas se cultivaron en condiciones estáticas con reemplazo diario de medios durante siete días. El chip BBB se fijó entonces usando 4% PFA en RT durante 10 min y lavado 3 .......
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Discusión
La combinación de la tecnología de órgano en chip y las células derivadas de iPSC en la NVU es prometedora para el modelado preciso del BBB humano. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la aplicación simple y robusta del chip BBB16basado recientemente en iPSC. En la Figura 3se muestra una descripción general y una sincronización del paradigma de sembración. Para obtener y mantener funciones de barrera adecuadas para el modelado BBB, es fundamental generar u.......
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Divulgaciones
Cedars-Sinai posee una participación minoritaria en Emulate, la compañía que produce los chips de órgano microfluídicos del estudio. Un oficial de Cedars-Sinai también sirve en la Junta Directiva de Emulate. Emulate no proporcionó apoyo financiero para esta investigación. Cedars-Sinai y Emulate tienen patentes presentadas relacionadas con este trabajo.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Soshana Svendsen por su edición crítica. Este trabajo fue apoyado por la beca 1621/18 de la Fundación De ciencia de Israel, el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST), Israel 3-15647, la subvención del Instituto de Medicina Regenerativa de California ID DISC1-08800, la Fundación de la Familia Sherman, la concesión NIH-NINDS 1UG3NS105703, y la subvención de la Asociación de ALS 18-SI-389. AH fue financiado por la Fundación Wallenberg (número de subvención 2015.0178).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Solución de disociación |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Colágeno IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Suero de burro | Sigma | D9663 | |
| Emular reactivo 1 (ER-1) | Emular Inc | ER-1 | |
| Emular reactivo 2 (ER-2) | Emular Inc | ER-2 | |
| Fibronectina | Sigma | F1141 | |
| Glial Proteína ácida fibrilar (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Suplemento de glutamina |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Matriz de membrana basal |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Industrias biológicas | 01-340-1B | |
| Nestina | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Industrias biológicas | 05-100-1A | Medios alternativos |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Suero bovino derivado de plasma pobre en plaquetas (PPP) | Tecnologías biomédicas | J64483AB | |
| Ácido retinoico (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Unidad de filtro superior de tubo de centrífuga estéril | Millipore SCGP00525 | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Anticuerpo monoclonal | Invitrogen | 33-9100 | |
| β III-tubulina (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoetanol | Life Technologies | 31350010 |
Referencias
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V.
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Reimpresiones y permisos
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