Lesión cerebral inducida por láser en la corteza motora de ratas

A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte y la tercera causa principal de discapacidad¹. El accidente cerebrovascular también conduce a una discapacidad grave, a menudo requiere atención adicional del personal médico y sus familiares. Por lo tanto, es necesario comprender las complicaciones asociadas con el trastorno y mejorar el potencial de resultados más positivos.

El uso de modelos animales es el primer paso para entender las enfermedades. Para garantizar los mejores resultados de investigación, un modelo típico incluiría una técnica simple, asequibilidad, alta reproducibilidad y variabilidad mínima. Los determinantes en los modelos de accidente cerebrovascular isquémico incluyen el volumen de edema cerebral, el tamaño del infarto, la extensión de la descomposición de la barrera hematoencefálica (BBB) y el deterioro funcional generalmente evaluado a través de la puntuación de gravedad neurológica^2.

La técnica de inducción por accidente cerebrovascular más utilizada en modelos de roedores ocluye la arteria cerebral media (MCA) transitoria o permanentemente³. Esta técnica produce un modelo de trazo similar a los de los seres humanos: tiene una penumbra que rodea el área acariciada, es altamente reproducible, y regula la duración de la isquemia y la reperfusión^4. Sin embargo, el método MCAO tiene algunas complicaciones. La técnica es propensa a hemorragia intracraneal y lesiones a la retina ipsilateral con una disfunción de la corteza visual y hipertermia común que a menudo conducen a resultados adicionales^5,,6,,7. Otras limitaciones incluyen altas variaciones en el accidente cerebrovascular inducido (que surgen de la extensión probable de la isquemia a regiones no deseadas, como la región externa de la arteria carótida), oclusión insuficiente del MCA y reperfusión prematura. Además, las ratas de diferentes cepas y tamaños exhiben varios volúmenes de infarto⁸. Además de todas las desventajas mencionadas, el modelo MCAO no puede inducir pequeños accidentes cerebrovasculares aislados en áreas cerebrales profundas, ya que está limitado técnicamente en términos de su requisito de tamaño mínimo del recipiente para el cateterismo. Esto hace que la necesidad de un modelo alternativo sea aún más crítica. Otro método, la fototrombosis, proporciona una posible alternativa a los procedimientos MCAO pero no mejora la eficiencia^9. Esta técnica apunta a la carrera con la luz y ofrece algunas mejoras en los modelos anteriores. Sin embargo, la fototrombosis requiere una craneotomía invasiva que se asocia con compicaciones secundarias⁹.

A la luz de las deficiencias esbozadas, el protocolo presentado aquí proporciona una técnica láser alternativa capaz para inducir lesiones cerebrales en roedores. El mecanismo de acción de la técnica láser se basa en los efectos fototérmicos del láser impartidos en tejidos vivos, lo que conduce a la absorción de haces de luz por los tejidos del cuerpo y su conversión en calor. Las ventajas de utilizar una técnica láser son su seguridad y facilidad de manipulación. La capacidad de un láser para producir calor para detener el sangrado lo hace muy importante en la medicina, mientras que su capacidad para amplificar diferentes haces en un punto de encuentro dado asegura que los láseres evitan destruir los tejidos sanos que se interponen en el camino del punto de destino¹⁰. El rayo láser utilizado en este protocolo puede pasar a través de un medio líquido bajo, como el hueso, sin emitir su energía y / o causar ninguna destrucción. Una vez que alcanza un medio líquido alto, como los tejidos cerebrales, consume su energía para destruir los tejidos diana. La técnica, por lo tanto, puede inducir lesiones cerebrales sólo en el área apropiada del cerebro.

La técnica presentada aquí mostró una enorme cantidad de capacidad para regular sus niveles de irradiación, produciendo las variaciones elegidas de lesión cerebral previstas desde el principio. A diferencia del MCAO original que afecta tanto a la corteza como al estriado, la técnica láser fue capaz de regular el impacto de la lesión cerebral, induciendo lesiones sólo en la corteza motora prevista. Aquí, se proporciona el protocolo de lesión cerebral inducida por láser y un resumen de los resultados representativos para el procedimiento realizado en la corteza cerebral de ratas.

El siguiente procedimiento se llevó a cabo de conformidad con las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos también fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales en la Universidad Ben-Gurion del Negev.

1. Selección y preparación de animales

1. Seleccione 65 ratas macho Sprague-Dawley que pesen de 300 a 350 g sin patología general para este procedimiento. El tamaño más pequeño plantea dificultades técnicas para el procedimiento MCAO.
2. Asigne 3 ratas por jaula y déjelas adaptarse durante al menos 3 días.

2. Procedimiento MCAO

1. Seleccione 25 ratas para MCAO permitiendo una mortalidad del 10—20% asociada con el procedimiento¹¹.
2. Realice MCAO utilizando una técnica estándar, como se describió anteriormente en el detalle¹².

3. Procedimiento experimental de lesión cerebral inducida por láser

1. Asigne 20 ratas a un grupo marcado como grupo láser y 20 ratas a otro grupo de control (operado por sham).
2. Somete a las ratas del grupo láser a irradiación láser a 50J X 10 puntos de la siguiente manera:
   1. Anestesiar rata con una mezcla de 2% de isoflurano en oxígeno permitiendo la ventilación espontánea. Compruebe si hay suficiente profundidad anestésica pellizcando la cola con fórceps para ver la ausencia del reflejo de abstinencia.
   2. Mantener la temperatura corporal central de la rata a 37 oC durante todo el procedimiento experimental utilizando una almohadilla de calentamiento regulada por temperatura rectal.
   3. Retire el vello local con una afeitadora y desinfecte con 70% de alcohol y 0,5% de gluconato de clorhexidina. Repita el paso de desinfección dos veces más.
      NOTA: El tamaño de la incisión quirúrgica debe ser de aproximadamente 3 cm. Retire el vello de al menos 2 cm alrededor del área de la incisión.
   4. Coloque la rata en un soporte de cabeza estereotaxico en una posición propensa y haga una incisión de 3 cm para reflejar el cuero cabelludo lateralmente y exponer el área entre Bregma y Lambda.
   5. Mantener la anestesia a través del cono nasal.
   6. Utilice láser de neodimio-YAG (Nd-YAG) (longitud de onda máxima 1064 nm) para administrar 50J X 10 puntos,con 1 s de duración del pulso, al área expuesta del cráneo por encima del hemisferio derecho.
   7. Asegúrese de que la parte generadora láser del aparato esté a una distancia de 2 mm del área expuesta para producir un rayo láser. Se seleccionaron 50 puntos J X 10 después de una cuidadosa evaluación de diferentes combinaciones de energía y superficie. Esta combinación es eficiente y no causa destrucción ósea del cráneo después de la administración por menos de un segundo¹⁰.
      NOTA: 2 mm es la distancia entre el terminal del rayo láser (desde el cable óptico que pasa a través) y el hueso del cráneo. En caso de que se utilice una lente de enfoque, la distancia debe calcularse teniendo en cuenta el ángulo de inclinación de la lente para enfocar el haz en el área de daño deseada. Garantice la seguridad adecuada cuando utilice un dispositivo láser, incluido el entrenamiento adecuado y la protección ocular.
   8. Retire la rata del dispositivo y cierre el cuero cabelludo con suturas quirúrgicas de seda 3-0.
   9. Suspenda la anestesia y devuelva la rata a su jaula para su recuperación. Administrar 0,1 ml de 0,25% de bupivacaína localmente para reducir el dolor postoperatorio inmediatamente después de la cirugía.
      NOTA: Todo el procedimiento debe durar menos de 5 minutos si se realiza correctamente.
3. Observe a la rata en busca de signos de angustia durante la recuperación posterior a la anestesia. Antes de la aparición de la anestesia, dar 0.01mg/kg buprenorfina intramuscular para la analgesia postoperatoria y continuar con dosis repetidas cada 12 h durante al menos 48 h.
4. Sujeto controlar ratas a las mismas condiciones sin someterlas al láser.

4. Puntuación de gravedad neurológica (SEN)

1. Evaluar la puntuación de gravedad neurológica 24 h después de la lesión cerebral inducida por láser utilizando una puntuación de 43 puntos¹³. Pruebe a los animales en busca de déficits neurológicos, alteraciones del comportamiento, tarea de equilibrio de haces y reflejos, asignando puntuaciones más altas para discapacidades más graves, como se detallaba anteriormente¹³.

5. Manipulaciones posteriores a la lesión

1. Después de la evaluación del SEN, eutanasia a las ratas exponiéndolas a un 20% de oxígeno y un 80% de CO2 (a través de la inspiración) y perfume la rata transcardiamente con solución salina con fosfato heparinizado (PBS, 0,9% NaCl).
   NOTA: Asegúrese de que el CO₂ se entregue a una tarifa predeterminada de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Este paso también se puede realizar bajo 5% de anestesia isoflurano.
2. Cosecha el cerebro y prepárate para un examen posterior como se describe en un protocolo anterior¹¹.
3. Evaluar la hemorragia subaracnoidea (SAH) a través del examen visual de todo el cerebro después de su aislamiento del cráneo. Si es necesario, se puede utilizar un microscopio o una lupa para este fin.

6. Evaluación de la lesión cerebral

1. Determinar el volumen del infarto cerebral y el edema cerebral mediante tinción TTC
   NOTA: 2,3,5-Triphenyltetrazolium cloruro (TTC) tinción es un procedimiento conveniente para la detección de infarto cerebral¹¹.
   1. Secise los cerebros cosechados en 6 rodajas coronales, cada una de 2 mm de espesor.
   2. Incubar el conjunto de rodajas de cada cerebro durante 30 min a 37oC en 0,05% TTC.
   3. Después de la tinción, escanee las rodajas con un escáner óptico con una resolución de 1600 X 1600 ppp.
   4. Las áreas no manchadas de las rebanadas cerebrales fijas se definen como infarto¹².
   5. El uso de un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, freeware Image J) mide el área infarta no mantenida, hemisferios ipsi y contralateral para cada una de las 6 rebanadas coronales.
   6. Calcular el volumen infarto como un porcentaje del cerebro total:
      
   7. Calcular edema cerebral usando el método Kaplan:
      
2. Determinar la extensión de la rotura de la barrera hematoencefálica (BBB)
   NOTA: Evalúe la rotura del BBB 24 h después de la lesión cerebral inducida por láser de la siguiente manera:
   1. Administrar 2% Evans Blue mezclado con 4 ml/kg de solución salina por vía intravenosa a ratas a través de la vena de cola canulada y permitir que la solución circule durante 1 h.
   2. Eutanasia las ratas exponiéndolas al 20% de oxígeno y al 80% de CO₂ (a través de la inspiración) 24 h después del último SEN, como se describió anteriormente¹³.
   3. Cosecha el tinte localizado intravascularmente de la siguiente manera:
      1. Abra los pechos de las ratas con pincettes quirúrgicas y tijeras quirúrgicas.
      2. Perfunde a los animales con solución salina enfriada al 0,9% a través del ventrículo izquierdo utilizando 110 mmHg hasta obtener un líquido de perfusión incoloro de la aurícula derecha.
   4. Cosecha los cerebros y córtales rostrocaudally en rodajas de 2 mm.
   5. Separe las rebanadas cerebrales izquierdas de las porciones derechas para evaluar los hemisferios lesionados y no lesionados por separado.
   6. Pesar, homogeneizar con mortero y pestillo, y luego incubar los tejidos cerebrales en 50% ácido tricloroacético durante 24 h.
   7. Centrifugar las rebanadas cerebrales homogeneizadas a 10.000 g durante 20 min.
   8. Mezclar 1 ml del sobrenadante del cerebro centrifugado con 1,5 ml de etanol al 96% de etanol a 1:3 y evaluar la rotura de la barrera hematoencefálica utilizando un detector de fluorescencia a 620 nm de longitud de onda de excitación (10 nm de ancho de banda) y 680 nm de longitud de onda de emisión (10 nm de ancho de banda).
      NOTA: Ambos grupos de ratas se someten al mismo protocolo para determinar la avería de BBB.

No se registraron muertes ni SAH ni en el control ni en los grupos experimentales(Tabla 1). El grupo MCAO tenía una tasa del 20% tanto de mortalidad como de SAH.

Los cambios relativos de la temperatura corporal en las ratas de ambos grupos también fueron similares, a pesar de una diferencia en la variabilidad de ambos grupos (Tabla 1).

Hubo un SEN significativamente peor tanto en los modelos láser (16 x 1,1) como en el MCAO (20 x 1,5), en comparación con el grupo de control operado por sham (1 x 0,3; Tabla 1; p<0.01).

La lesión cerebral inducida por láser también causó un aumento significativo en el volumen de infarto en el hemisferio objetivo, en comparación con el grupo de control operado por la farsa (2,4% a 0,3 frente a 0,5% a 0,1; Tabla 2 y Figura 1A; p<0.01), según la prueba Mann-Whitney U. Sin embargo, el volumen de infarto del modelo láser fue menor en comparación con la técnica de MCAO (2,4% a 0,3 frente a 9,9% a 2,9).

El edema cerebral determinado 24 h después de una lesión cerebral se muestran en la Figura 1B y la Tabla 2. No hubo diferencia en el edema cerebral entre el modelo de lesión cerebral inducida por láser y el grupo de control operado por la farsa (3,4% a 0,6 frente a 0,7% a 1,2). Hubo una diferencia significativa en el edema cerebral entre el modelo láser y la técnica de MCAO (3,4 x 0,6 frente a 7 x 2,6o). Los datos se presentan como la media de SEM.

En comparación con el grupo de control operado por la farsa, la lesión cerebral inducida por láser y la técnica de MCAO causaron un aumento significativo en la rotura del BBB en el hemisferio no lesionado (563 ng/g a 66 y 1176 ng/g a 168, respectivamente, vs 141 ng/g a 14; Figura 2A y Tabla 2; p<0.01) y el hemisferio objetivo (2204 ng/g a 280 y 2764 ng/g a 256, respectivamente, frente a 134 ng/g a 11; Figura 2B y Tabla 2; p<0.01).

El examen histológico del cerebro de las ratas se muestra en la Figura 3.

Tabla 1: Evaluación del SEN, temperatura corporal, hemorragia subaracnoidea y mortalidad. * p < 0.01

Tabla 2: Evaluación de la descomposición del BBB, la zona del infarto y el edema cerebral. * p < 0,01

Figura 1: Evaluación de la lesión cerebral en el modelo láser 24 h después de la lesión en comparación con el modelo MCAO y el control operado por sham. (A) Evaluación del volumen del infarto. Hubo un aumento en el volumen de infarto en el modelo láser en comparación con el control operado por sham (*p<0.01). Sin embargo, el volumen de infarto en el modelo láser era menor en comparación con el modelo MCAO (*p<0.01). (B) Evaluación del edema cerebral total. Hubo un aumento en el edema cerebral en el modelo MCAO en comparación con el modelo láser o el control operado por sham. No hubo diferencia en el edema cerebral entre el modelo láser y el control operado por sham. Los datos se miden como % para el hemisferio contralateral y se expresan como medio de SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 2: El alcance de la avería de BBB en comparación con los controles falsos. (A) Hemisferio contralateral (no lesionado). Tanto el láser como los modelos MCAO, llevaron a un aumento significativo en la rotura de BBB en el hemisferio no lesionado en comparación con el grupo de control operado por sham (*p<0.01). (B) Hemisferio Ipsilateral (lesionado). Hubo una diferencia en la avería ipsilateral de BBB en los modelos láser y MCAO en comparación con el control operado por sham (*p<0.01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Examen histológico de los cerebros de las ratas a partir de grupos falsos, láseres y MCAO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.