En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.
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Artículo de método
Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los bloques de construcción proteígicos a medida son candidatos versátiles para el montaje de estructuras supramoleculares como células mínimas, vehículos de administración de medicamentos y andamios enzimáticos. Debido a su biocompatibilidad y atún a nivel genético, las proteínas similares a la elastina (ELP) son bloques de construcción ideales para aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Sin embargo, el montaje de estructuras supramoleculares basadas en proteínas con propiedades fisioquímicas distintas y un buen potencial de encapsulación sigue siendo un reto.
Aquí proporcionamos dos protocolos eficientes para el autoensamblaje guiado de ELP anfifílicos en arquitecturas de proteínas supramoleculares como coacervados esféricos, fibras y vesículas estables. Los protocolos de montaje presentados generan compartimentos basados en membranas proteicas (PMBC) basados en ELP con propiedades fisicoquímicas adaptables. Los PBPC demuestran el comportamiento de separación de fases y revelan la fusión de membranadependiente del método y son capaces de encapsular moléculas de carga fluorescente químicamente diversas. Los PMBC resultantes tienen un alto potencial de aplicación como plataforma de formulación y entrega de medicamentos, célula artificial y espacio de reacción compartimentado.
Introducción
El montaje de estructuras supramoleculares para aplicaciones biotecnológicas es cada vez más importante1,2,3,4,5. Para el montaje de arquitecturas funcionales como coacervados, vesículas y fibras con las propiedades fisicoquímicas deseadas es importante comprender y controlar las propiedades fisicoquímicas y conformacionales de los componentes. Debido a la precisión molecular de las moléculas que se encuentran en la naturaleza, los bloques de construcción para las estructuras supramoleculares se basan cada ....
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Protocolo
1. Diseño y clonación de proteínas anfifílicas similares a la elastina (ELP)
- Clonar y diseñar las construcciones como se describe en otros lugares8,20. Hay plásmidos disponibles bajo petición.
2. Expresión, purificación y preparación de proteínas
- Expresión de F20E20-mEGFP y F20E20-mCherry
- Inocular la cultura de expresión principal de la precultura nocturna a unaDo6 de 0,3. Incubar a 37oC, 200 rpm en medio estéril de 400 ml LB complementado con antibióticos apropiados en un matraz de 2 L.
- Preparar la solución de stock IPTG (1 M)....
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Resultados
Desarrollo de protocolos para la producción de vesículas
La Figura 1 describe los dos métodos diferentes de preparación de vesículas. El método de hinchazón THF en el lado izquierdo se compone de tres pasos sucesivos y da como resultado diferentes conjuntos supramoleculares del ELP dependiendo de la temperatura. En la Figura 1A, las imágenes de microscopía de epifluorescencia muestran vesículas ensambladas a parti.......
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Discusión
Un fallo al seguir los protocolos descritos para el montaje de estructuras supramoleculares definidas conduce principalmente a la formación de agregados inespecíficos(Figura 2,IV) o a anfifílicos ELP distribuidos homogéneos. Los pasos críticos del protocolo se discuten a continuación:
Para un alto rendimiento de expresión del ELP anfifílico, una temperatura relativamente baja de 20oC es óptima. Para una purificación exitosa basada en la afinidad de la ELP anfifíli.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen al BMBF el apoyo financiero y al Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) por proporcionar el centro de investigación. Estamos agradecidos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, EE. UU. por proporcionar el plásmido pEVOL-pAzF. Agradecemos al personal del Centro de Imágenes de Vida (LIC) en el Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) de la Universidad Albert-Ludwigs-Universidad freiburgpor su ayuda con sus recursos de microscopía confocal, y el excelente apoyo en la grabación de imágenes.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 y micro; m y 0,2 y micro; m Filtro estéril | VWR | ||
| 1,4-ditiotreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99,5% p.a. | Escalera | ||
| 2log | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Tubos Falcon | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes colorante | Sigma Aldrich | ||
| Ácido acético glacial | VWR | ||
| Acetonitrilo, anhidro, 99,8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicilina sal de sodio, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience Biofuge | ||
| Heraeus | |||
| Bottle Top Filter con membrana PES (45 & m, 22 y micro; m) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Cámara Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| DS Qi1 | Nikon | ||
| 5417r | Centrífuga Eppendorf | ||
| 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu malla cuadrada rejilla de cobre | EMS | ||
| Cloranfenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutro | Life Technologies | ||
| Sónico digital | Branson | ||
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Incubadora agitadora ambiental ES-20 | Biosan | ||
| Absoluto de etanol | Roth | ||
| Solución de bromuro de etidio | Roth | ||
| Filtro compatible con | Avanti | ||
| Bio-Rad | |||
| Glicerol Grado de proteómica | Amresco Glicina | ||
| Applichem | |||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Placa de calor MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF columna de crudo | GE Life Sciences Columna de | níquel | |
| Clorhidrato ácido fumante, 37%, p.a. | Iluminador Merck | ||
| ix 20 | Iluminador INTAS | ||
| LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazol | Merck | ||
| Aceite de inmersión para microscopía | Incubadoras Merck | ||
| agitadores Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Escalas de laboratorio Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Liofililizador Alpha 2-4 LSC | Cristo | ||
| Lisozima, 20000 U/mg | Microscopio Roth | ||
| CM 100 | Microscopio Philips | ||
| Eclipse TS 100 | Microscopía Nikon | ||
| Cubreobjetos (15 x 15 mm) | |||
| VWR | |||
| Microwave | Studio | ||
| Ávidos Polares | |||
| NaCl, >99,5%, p.a. | Pellets | ||
| Ni-NTA Agarosa, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrana | Avanti | ||
| Medidor de PH 766 calimatic | Knick | ||
| Fenilmetilsulfonilflourid (PMSF) | |||
| (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Escalera de proteínas 10-250 kDa | NEB | ||
| Enfriador de recirculación F12 | Julabo | ||
| Anillos de refuerzo | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiodihidrógeno fosfato dihidratado, NaH2PO4 | VWR | ||
| Filtro de jeringa estéril 0,2 mm Acetato de celulosa | VWR | ||
| T4 ADN Ligasa | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugado | MolecularSondas | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99,5% anual | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton de Casein | Roth | ||
| Limpiador ultrasónico | VWR | ||
| Urea p.a. | Bomba | ||
| 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans membrana tubular de celulosa regenerada (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
Referencias
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Reco....
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Reimpresiones y permisos
