Aquí describimos un protocolo para la toma de imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulo cortical en el brote de meristem apical y el seguimiento de su respuesta a los cambios en las fuerzas físicas.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem
En este artículo
Resumen
Resumen
Comprender la regulación a nivel celular y tisular del crecimiento y la morfogénesis ha estado a la vanguardia de la investigación biológica durante muchas décadas. Los avances en tecnologías moleculares y de imagen nos permitieron obtener información sobre cómo las señales bioquímicas influyen en los eventos morfogenéticos. Sin embargo, es cada vez más evidente que aparte de las señales bioquímicas, las señales mecánicas también afectan a varios aspectos del crecimiento celular y tisular. El arabidopsis shoot apical meristem (SAM) es una estructura en forma de cúpula responsable de la generación de todos los órganos sobre el suelo. La organización del citoesqueleto de microtúbulo cortical que media la deposición de celulosa apoplástica en las células vegetales es espacialmente distinta. La visualización y evaluación cuantitativa de patrones de microtúbulos corticales son necesarias para comprender la naturaleza biofísica de las células en el SAM, ya que la celulosa es el componente más rígido de la pared celular de la planta. La forma estereotipada de la organización de microtúbulos corticales también es una consecuencia de las fuerzas físicas de todo el tejido existentes en el SAM. La perturbación de estas fuerzas físicas y el posterior seguimiento de la organización de microtúbulos corticales permite la identificación de proteínas candidatas implicadas en la mediación de la mecano-percepción y transducción. Aquí describimos un protocolo que ayuda a investigar tales procesos.
Introducción
Las células vegetales están rodeadas por una matriz extracelular de polisacáridos y glicoproteínas que se asemeja mecánicamente a un material compuesto reforzado con fibra capaz de cambiar dinámicamente sus propiedades mecánicas1. El crecimiento de las células vegetales es impulsado por la absorción de agua en la célula, lo que resulta en una acumulación concomitante de fuerzas de tracción en la pared celular. En respuesta a tales fuerzas, las modificaciones en el estado físico de la pared celular permiten la expansión de la célula. Las células con paredes primarias son capaces de experimentar un crecimiento rápido en comparación con la pared c....
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Protocolo
1. Crecimiento de la planta
- Cerda semillas de Arabidopsis que expresan el dominio de unión a microtúbulos fusionado con proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 en el suelo y mantener en largo día (16 h día /8 h noche), condiciones de 20 oC/6 oC durante 1 semana para la germinación.
- Después de la germinación, transfiera las plántulas a nuevas macetas con suficiente espacio de crecimiento para permitir un crecimiento vegetativo robusto. Mantener las plantas en día corto (8 h día /16 h noche), 20 oC/16 oC condiciones durante 3-5 semanas.
- Transferir las plantas a un día largo (16 h día /8 h noche), condiciones....
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Resultados
La Figura 1 muestra imágenes de proyección típicas obtenidas de líneas MBD-GFP con celdas en el centro de la cúpula que contienen microtúbulos corticales desorganizados, y celdas en la periferia que tienen una distribución circunferencial (Figura 1A,B), mientras que las celdas de dominio de límite contienen microtúbulos corticales alineados paralelos al eje largo de la célula. Estas observaciones muestran diferen.......
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Discusión
La evaluación de los eventos de transducción de señales mecánicas es crucial para identificar los reguladores moleculares involucrados en las vías de mecanoso-percepción y transducción. El protocolo descrito aquí proporciona una visión cuantitativa de tales eventos utilizando la respuesta de microtúbulo cortical como lectura para dicho proceso en los SAM de Arabidopsis. El procedimiento descrito aquí se utiliza habitualmente en varios estudios en diversos tipos de tejidos16,
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glicina | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 microscopio confocal Leica | DM6000 CS | ||
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| cinta de microporos | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| mio-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benciladenina | Sigma | B3408 | |
| ácido nicotínico | Sigma | N4126 | |
| caja con bisagras de plástico | Ciencias de la microscopía electrónica | 64312 | |
| PPM (Mezcla de conservantes vegetales) | Tecnología de células | PPM | |
| Yoduro de propidio | Sigma | P4864 | |
| clorhidrato de piridoxina | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| clorhidrato de tiamina | Sigma | T4625 |
Referencias
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology....
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Reimpresiones y permisos
