Realización de biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y evaluación de cambios de tejido posteriores

Resumen

Aquí, proporcionamos una descripción detallada del procedimiento para inducir biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y el cierre de heridas de vía en tiempo real. Además, se proporcionan métodos para la preparación de tejidos para análisis histológicos, inmunohistoquímicos y moleculares del lecho de la herida.

Resumen

Entender los cambios tisulares y celulares que se producen en la respuesta aguda a lesiones, así como durante el proceso de curación de heridas es de suma importancia al estudiar enfermedades del tracto gastrointestinal (GI). El modelo de biopsia de pellizco colonico turbio es una herramienta útil para definir estos procesos. Además, se puede estudiar la interacción entre el contenido luminal intestinal (por ejemplo, microbios) y el colon. Sin embargo, la inducción de heridas y la capacidad de rastrear el cierre de heridas con el tiempo de una manera confiable pueden ser desafiantes. Además, la preparación y orientación de los tejidos debe llevarse a cabo de manera estandarizada para interrogar de manera óptima los cambios histológicos y moleculares. Aquí, presentamos un método detallado que describe la lesión inducida por biopsia y el monitoreo del cierre de heridas a través de colonoscopias repetidas. Se describe un enfoque que garantiza mediciones consistentes y reproducibles del tamaño de la herida, la capacidad de recoger el lecho de la herida para análisis moleculares, así como visualizar el lecho de la herida al seccionar los tejidos. La capacidad de llevar a cabo con éxito estas técnicas permite estudios de la respuesta aguda a lesiones, la cicatrización de heridas y las interacciones luminal-huésped dentro del colon.

Introducción

El tracto gastrointestinal (GI) es un complejo sistema de órganos dadas sus múltiples funciones, tipos de células huésped (por ejemplo, epitelial, inmune, estromal, etc.) así como billones de microbios. A la luz de esta complejidad, las enfermedades del tracto gastrointestinal a menudo implican la interacción de todos estos factores. Por ejemplo, las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) se asocian con ciclos de inflamación y remisión en el tracto gastrointestinal, que implican la activación de células inflamatorias, disbiosis y reparación epitelial^{1,2,3,4,5,6,7.} Tener sistemas modelo adecuados para estudiar la EII y otras condiciones inflamatorias del tracto gastrointestinal es fundamental para dilucidar la patogénesis de la enfermedad. Existen varios modelos para estudiar la patogénesis del EII, incluidos ratones genéticamente modificados y el uso de sustancias químicas como el sulfato sódico de dextrano (DSS) en roedores^8,9,10. Las limitaciones de estos modelos incluyen la incapacidad de controlar con precisión la inducción de la inflamación, así como dificultades en la evaluación de la cicatrización de heridas. Los métodos alternativos para imitar aspectos de la patogénesis de la EII podrían resultar útiles para el desarrollo de terapias.

Las biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones ofrecen un sistema modelo útil para estudiar la patogénesis de la respuesta inflamatoria, la cicatrización de heridas, así como las interacciones huésped-microbio en el colon. Este enfoque se utilizó por primera vez como una herramienta experimental en 2009, que demostró su utilidad para estudiar la respuesta inflamatoria aguda y la cicatrización de heridas en el intestino^11. Estudios posteriores utilizaron esta técnica para evaluar los roles de las diferentes vías de señalización, así como la microbiota intestinal, en la cicatrización de heridas en colones^{11,12,13,14,15,16,17,18.} Más recientemente, nuestro grupo utilizó este modelo para investigar la importancia de la señalización de esfingosina-1-fosfato y bacterias en la respuesta aguda a lesiones en colones¹⁹. Aunque útil, llevar a cabo biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicos en ratones y evaluar los cambios de tejido posteriores puede ser técnicamente difícil. Por ejemplo, la perforación del intestino puede ocurrir tras la inducción de lesiones y asegurar mediciones consistentes del lecho de la herida a través de colonoscopias en serie puede ser difícil. Además, orientar el tejido colonico correctamente para visualizar el lecho de la herida para análisis histológicos o inmunohistoquímicos puede ser un desafío. Aunque existe cierta información sobre estos métodos^18,20, una descripción precisa de estas técnicas a lo largo de las ayudas visuales promete mejorar la fiabilidad y la utilidad más amplia de este modelo. Aquí, presentamos un método detallado para llevar a cabo biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones, rastrear el cierre de heridas con el tiempo y preparar el tejido para permitir análisis histológicos y moleculares del lecho de la herida. La creación de un método estándar para llevar a cabo estas técnicas puede ampliar el uso de este modelo para estudiar mediadores previamente no investigados que son potencialmente importantes para la inflamación gastrointestinal y la reparación de heridas.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Weill Cornell Medicine." Para: "Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Weill Cornell Medicine y Stony Brook University.

1. Colonoscopia e inducción de heridas

1. Presamble los componentes del endoscopio insertando primero el endoscopio de agujero rígido de 1,9 mm en la vala (Figura 1A-B). Fije la bomba de aire (para proporcionar insuficiencia colona) utilizando el tubo proporcionado, a la válvula de gas en el lado izquierdo de la enlata junto al canal de trabajo (Figura 1C).
   NOTA: Aunque la lente descrita aquí es de 0°, una lente de 30° también se puede utilizar para este propósito.
2. Asegúrese de que el canal de trabajo está en posición abierta e inserte 3 fórceps de biopsia Fr a través del canal de trabajo y avance hasta el final de la vala (mientras se asegura de que no sobresalga de la vala) (Figura 1C). Conecte el endoscopio ensamblado a la fuente de luz y al dispositivo de imágenes de vídeo siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Anestesia el ratón con un 5% de isoflurano con oxígeno en una cámara de inducción. A continuación, mueva el ratón a una plataforma de ensayo endoscópica que contenga un sistema de calefacción (para prevenir la hipotermia) en su lado ventral y mantener bajo anestesia utilizando un cono nasal con 2% de isoflurano con oxígeno. Agregue ungüento veterinario a los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando suavemente el pie trasero para probar un reflejo.
   NOTA: Cualquier cepa o cualquiera de los sexos de ratones se puede utilizar con esta técnica; sin embargo, es preferible que los ratones tengan al menos 8 semanas de edad, por lo que son lo suficientemente grandes para el procedimiento.
   1. Agregue ungüento veterinario a los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
   2. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando suavemente el pie trasero para probar un reflejo.
4. Llene una jeringa de 3 ml con una aguja de gavage de rata conectada con solución salina amortiguada por fosfato a temperatura ambiente (PBS). Inserte la aguja aproximadamente 1 cm en el ano del ratón e infunda suavemente PBS para limpiar el material fecal. Varios pellets fecales deben salir del ratón junto con el PBS que se infundió.
   NOTA: La instilación de un volumen excesivo de PBS puede dar lugar a la formación de espuma en el lúmenes que podría oscurecer la visualización del lúmenes.
5. Inserte el endoscopio ensamblado 0,5 cm en el ano del ratón. Avance los fórceps de biopsia en el lúmenes del recto hasta que las "mandíbulas" completas (incluida la bisagra) de los fórceps estén más allá del final de la vaina (como se observa en el monitor de vídeo) (Video Suplementario 1). Gire los fórceps 90° para que las mandíbulas se abran en una orientación este-oeste(Video Suplementario 1).
6. Para la biopsia, abra los fórceps y avance aproximadamente 1 cm, cierre los fórceps y en un movimiento suave tire rápidamente hacia atrás en las fórceps mientras los deja cerrados(Video Suplementario 1).
   1. Evite insufflar completamente el colon al realizar la biopsia. Por lo tanto, deje el lado derecho de la válvula de gas abierta durante este paso; aunque cabe señalar que al abrir las fórceps existe el riesgo de dañar la mucosa cuando el colon está en esta posición.

2. Visualizar y medir el lecho de la herida

1. Inicie la grabación de vídeo inmediatamente después de la biopsia presionando el pedal conectado al dispositivo de grabación del colonoscopio. Ensuque completamente el colon presionando firmemente un dedo índice contra el lado derecho de la válvula de gas para cubrir completamente la abertura con el fin de forzar el aire en el endoscopio y así en el colon.
   NOTA: Aunque este protocolo describe el uso de una bomba de aire en la que el flujo de aire se controla manualmente, también se puede utilizar una bomba peristáltica con un suministro de aire controlado.
2. Avance las fórceps de nuevo fuera de la vaina, y en el lúmenes rectales mientras está en la posición cerrada(Video Suplementario 1). Coloque los fórceps contra la pared rectal inmediatamente por encima de la herida hasta que la base de las mandíbulas esté alineada con el borde superior del campo de visualización(Figura 2 y Video Suplementario 1). Continúe insuflando completamente el colon hasta que se pueda observar una vista clara de la herida.
   NOTA: Se debe tener cuidado de extender los fórceps lo suficientemente lejos como para revelar sólo las mandíbulas de las fórceps hasta la base para cada ratón que se examina con el fin de garantizar una distancia constante entre la lente del endoscopio y la lesión (Figura 2,flecha blanca).
3. Si realiza biopsias en varios ratones el mismo día, retire el tejido biopsiado del ratón anterior de los fórceps (utilizando el cepillo de limpieza proporcionado) y limpie la vaina de la lente con un 70% de etanol para limpiarla antes de inducir una herida en el ratón siguiente.
   NOTA: Aunque este protocolo describe la realización de una sola biopsia por ratón, se pueden realizar varias biopsias en un solo ratón siempre que el tejido extraído de la biopsia anterior se retire de los fórceps con el fin de garantizar que se pueda tomar una biopsia completa en biopsias posteriores.
4. Coloque el ratón en un vacío de jaula de otros ratones y encima de una toalla para mantener las vías respiratorias despejadas hasta que se recupere de la anestesia después de completar el procedimiento. Monitoree el ratón para asegurarse de que se recupera de la anestesia como se indica al recuperar la actividad.
   NOTA: Dos personas están obligadas a inducir la herida y visualizar el lecho de la herida el día 0 (una operando el endoscopio y la otra operando los fórceps de biopsia), pero solo se necesita un individuo para visualizar heridas en días posteriores (como se describe a continuación).
5. Siga el mismo procedimiento de preparación del ratón y la colonoscopia para mediciones posteriores de la herida (normalmente los días 2, 4 y 6 siguientes a la biopsia), como se describió anteriormente en las secciones 1.1-1.4, excepto para la inducción de la herida.
6. Localice el lecho de la herida en el monitor de vídeo en estos puntos de tiempo después de insertar el endoscopio, y avance los fórceps de biopsia (en posición cerrada) para inmediatamente por encima del lecho de la herida, insuflar el colon e iniciar la grabación de vídeo, como se describe en las secciones 2.1 y 2.2 (Figura 2).
   NOTA: Puede ser difícil localizar el lecho de la herida más de 6 días después de la biopsia.
7. Avance los fórceps en el lúmenes en estos días posteriores a la misma distancia que el día 0 para asegurar una distancia constante entre la lente del endoscopio y la lesión a lo largo de los días. Garantizar una distancia constante entre la lente y la lesión mejorará la precisión de las mediciones a lo largo del tiempo.
   NOTA: Un individuo puede realizar mediciones en estos días (el endoscopio se opera con la mano derecha y los fórceps de biopsia están avanzados con la mano izquierda).
8. Una vez completadas todas las mediciones, abra las grabaciones de vídeo de las colonoscopias en serie en el software de edición de vídeo que permite la creación de imágenes fijas a partir de vídeo.
9. Avance el video a un marco que muestre un punto en el tiempo en el que el lecho de la herida se puede visualizar fácilmente, los fórceps cerrados están por encima de la cama de la herida y contra la pared rectal y la pared está tensa. Tome una instantánea de este marco y codigue el nombre del archivo para asegurarse de que las mediciones de los lechos de las heridas se llevan a cabo de forma cegada.
10. Abra las imágenes con nombres de archivo codificados en NIH ImageJ para cuantificar el tamaño del lecho de la herida. En la pestaña Analizar, seleccione Establecer medidas y active la casilla Área.
    1. Seleccione la herramienta Seleccione a mano alzada en la barra de menús principal y dibuje un perímetro alrededor de la herida (consulte la Figura 2). En la pestaña Analizar, seleccione Medir y el valor de esa medición se rellenará automáticamente en la ventana Resultados.
11. Exporte los resultados a una hoja de cálculo después de completar las mediciones de todas las imágenes, seleccionando Guardar como en la pestaña Archivo dentro de la ventana Resultados y cambiando la extensión para convertirse en un archivo de hoja de cálculo.
12. Calcule el tamaño de la herida los días posteriores a la inducción de la herida (es decir, los días 2, 4 y 6) en relación con el tamaño del día 0 (inmediatamente después de la herida) en una hoja de cálculo. Para ello, divida el tamaño de la herida en cada día por el tamaño de la herida el día 0 y convierta ese valor en un porcentaje.
    NOTA: En condiciones normales utilizando este método de visualización colonoscópica, el mayor cierre de la herida se observa después de los primeros 2 días (~ 75% reducción de tamaño) con cierre más gradual en los días 4 y 6 (~ 80% y ~ 95% reducción de tamaño, respectivamente).

3. Recolección del lecho de la herida para análisis molecular

1. Eutanasia el ratón usando asfixia por CO₂ seguida de dislocación cervical (o técnica equivalente) el día seleccionado después de la biopsia.
2. Coseche la región distal del colon abriendo la piel y el músculo abdominal para exponer la cavidad corporal. Coloque las tijeras cerradas debajo del colon y levante suavemente para liberarla del mesenterio subyacente y luego corte el colon en su punto medio y en el ano para eliminarlo del ratón.
3. Enjuague el contenido fecal usando una aguja de gavage de rata unida a una jeringa de 20 ml llena de PBS frío en hielo 1x y luego coloca el colon en papel filtrante.
4. Abra el colon longitudinalmente en papel filtrante asegurándose de que el lado mesenterico esté boca abajo contra el papel filtrante. Aplicar 0.2% azul metileno a la mucosa usando un pipete exprimido mientras el tejido todavía está en el papel filtrante y luego drenar el exceso de azul metileno. Ver el colon bajo un microscopio diseccionador y localizar el lecho de la herida (Figura 3A).
5. Usando tijeras micro iris de 4 pulgadas, cortar alrededor del borde del lecho de la herida(Figura 3A,círculo discontinuo) teniendo cuidado de no cortar en la capa muscular (a menos que se desee el músculo) y transferir la lecho de la herida diseccionada a un tubo usando pinzas de punto fino para la congelación o método de almacenamiento deseado.
   NOTA: La cantidad de tejido recogido de esta manera es suficiente para extraer ARN para análisis de ARN-seq o equivalente.

4. Preparación de tejido para análisis histológico

1. Eutanasia el ratón y cosecha el colon como se describe en el paso 3.1-3.2.
2. Abra el colon longitudinalmente en papel filtrante asegurándose de que el lado mesenterico esté boca abajo contra el papel filtrante. Aplique suavemente un 4% de paraformaldehído (o fijador de elección) usando un pipete exprimido y cubra el tejido con parafilm. Deje el piso en un recipiente sellado durante 4-6 horas.
3. Transfiera los tejidos al 70% de etanol para su almacenamiento. Cuando esté listo para procesar los tejidos, retire el parafilm y aplique un 0,2% de color azul metileno a la mucosa usando un pipete exprimido mientras el tejido todavía está en papel filtrante. A continuación, escurrir el exceso de azul metileno.
4. Ver el colon bajo un microscopio diseccionador y localizar el lecho de la herida (Figura 3A). Usando un bisturí con una hoja #10, cortar directamente a través del centro del lecho de la herida y continuar cortando el resto del colon en línea recta, de tal manera que el colon se ha cortado por la mitad, en cuanto a longitud(Figura 3A,línea negra).
5. Procesa el colon y luego la incrustación de parafina (ya sea uno o ambos lados que permanecen después del corte) de tal manera que el lado que fue cortado por el bisturí (el lado que era el centro de la cama de la herida antes de la bisección) está boca abajo en la parafina. Proceda a cortar secciones y manchas para las manchas o fabricantes deseados.
6. Si se requieren criosecciones para una tinción dada, coseche el colon como se describe en el paso 3.1 y abra longitudinalmente sobre el papel filtrante, asegurándose de que el lado mesenterico esté boca abajo contra el papel filtrante.
7. Bisect el lecho de la herida dentro del colon recién cosechado como se describe en el paso 4.5 e incrustar el colon (ya sea uno o ambos lados que permanecen después del corte) de tal manera que el lado que fue cortado por el bisturí está boca abajo en un molde base medio lleno de tejido medio de congelación.
8. Asegure el tejido en su lugar con pinzas finas y coloque el molde base en una placa de metal sobre hielo seco para endurecer el medio de congelación. Una vez congelada la parte inferior del medio (y el tejido se mantiene en su lugar), suelte el tejido y llene el volumen restante del molde base con medio de congelación y colóquelo de nuevo sobre hielo seco.
   1. Después de congelar todo el volumen del medio de congelación, transfiéralo a un congelador de -80 °C hasta la sección.
9. Para parafina o secciones congeladas, corte y manche secciones adicionales por H&E para asegurarse de que el lecho de la herida ha sido capturado en la sección antes de proceder a la tinción específica del estudio. La Figura 3B muestra un ejemplo de una sección en la que se puede observar claramente el lecho de la herida.

Resultados

Los elementos pequeños (lente, revestimiento, fórceps de biopsia) necesarios para llevar a cabo biopsias se muestran en la Figura 1 junto con indicadores de montaje adecuado de estos componentes. La Figura 2 muestra imágenes representativas de vistas aceptables del lecho de la herida con el fin de cuantificar con precisión el tamaño del lecho de la herida y la tasa de cierre de la herida. Un ejemplo de una vista ex vivo del lecho de la herida se muestra en la

Discusión

Garantizar biopsias consistentes y precisas, así como mediciones del tamaño de la herida, son de suma importancia cuando se intenta evaluar eficazmente la tasa de cierre de heridas en este modelo. Por lo tanto, deben adoptarse varias medidas para estar seguros de que los procedimientos se están llevando a cabo correctamente. En primer lugar, la profundidad de la biopsia no debe ser demasiado superficial o profunda. Si es demasiado superficial, no habrá una ventana suficiente para evaluar el cierre de la herida.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinza de biopsia, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Sistema de torre Coloview	Karl Storz	Contactar empresa
Vaina de exploración, 9 Fr, Kit	Karl Storz	61029DK
Telescopio Hopkins, 0', 1,9 mm x 10 cm	Karl Storz	64301AA
isofluorano	Covetrus	2905
azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140
micro tijeras de iris	Integra	18-1619
NIH ImageJ	NIH	N/A	software disponible para descarga gratuita desde: https://imagej.nih.gov/ij/
Pawfly MA-60 bomba de acuario Amazon		N/A
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