Aquí, presentamos un método para purificar fibroblastos y células Schwann de nervios sensoriales y motores in vitro.
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Artículo de método
Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Las principales células del sistema nervioso periférico son las células Schwann (SCs) y los fibroblastos. Ambas células expresan claramente los fenotipos sensoriales y motores implicados en diferentes patrones de expresión génica del factor neurotrófico y otros procesos biológicos, afectando la regeneración nerviosa. El presente estudio ha establecido un protocolo para obtener SCs y fibroblastos sensoriales y motores altamente purificados más rápidamente. La raíz ventral (nervio motor) y la raíz dorsal (nervio sensorial) de ratas neonatales (7 días de edad) se disociaron y las células se cultivaron durante 4-5 días, seguidos por el aislamiento de fibroblastos sensoriales y motores y CC mediante la combinación secuencial de digestión diferencial y adherencia diferencial. Los resultados de los análisis de inmunocitoquímica y citometría de flujo mostraron que la pureza de los CC y fibroblastos sensoriales y motores eran >90%. Este protocolo se puede utilizar para obtener un gran número de fibroblastos/SCs sensoriales y motores más rápidamente, contribuyendo a la exploración de la regeneración sensorial y nerviosa motora.
Introducción
En el sistema nervioso periférico, las fibras nerviosas consisten principalmente en axones, células Schwann (SCs) y fibroblastos, y también contiene un pequeño número de macrófagos, células endoteliales microvasculares, y células inmunitarias1. Los SCs envuelven los axones en una proporción de 1:1 y están encerrados por una capa de tejido conectivo llamada endoneurium. Los axones se agrupan para formar grupos llamados fascículos, y cada fascículo se envuelve en una capa de tejido conectivo conocida como perineurium. Finalmente, toda la fibra nerviosa se envuelve en una capa de tejido conectivo, que se denomina epineurio. En el endoneurium, toda....
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Protocolo
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices Institucionales de Cuidado animal de la Universidad de Nantong. Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, fueron aprobados éticamente por el Comité de Administración de Animales Experimentales, provincia de Jiangsu, China.
1. Aislamiento y cultivo de fibroblastos nerviosos motores y sensoriales y SCs
- Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) de siete días de edad (n-4) proporcionadas por el Centro Animal Experimental de la Universidad de Nantong de China. Colocar las ratas en un tanque que contenga 5% de isoflurano durante 2-3 minutos, permitir que los animales re....
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Resultados
Observación microscópica de luz
Los SCs y los fibroblastos son las dos poblaciones celulares principales obtenidas en el cultivo celular primario a partir de tejidos nerviosos. Después de la inoculación durante 1 h, la mayoría de las células se adhirieron a la parte inferior del plato, y la morfología celular cambió de redonda a ovalada. Después del cultivo durante 24 h, los SCs exhibieron una morfología bipolar o tripolar y la longitud de estos osciló entre 100 y 200 .......
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Discusión
Las dos principales poblaciones celulares de los nervios periféricos incluían CC y fibroblastos. Los fibroblastos y SCs cultivados principalmente pueden ayudar con precisión a modelar la fisiología de fibroblastos y CC durante el desarrollo y la regeneración de los nervios periféricos. El estudio mostró que las células nerviosas ciáticas de rata P7 contenían alrededor del 85% de S100-positivas SCs, 13% de fibroblastos OX7 positivos y sólo 1.5% de macrófagos OX42 positivos13. Aunque el número de fi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Grant No. 2017YFA0104703), la Fundación Natural Nacional de China (Grant No. 31500927).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 Cabra Anti-Ratón IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilución: 1:400 |
| CoraLite488-conjugado Affinipure Cabra Anti-Ratón IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilución: 1:400 |
| Microscopio de barrido láser confocal | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Software Cell Quest | Becton Dickinson Biosciences | ||
| Solución salina equilibrada de D-Hank | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Microscopio de disección | Olympus | SZ2-ILST | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Medio de montaje | Abcam | ab104135 | |
| Medio de fijación/Medio de permeabilización | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Citometría de flujo | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Control de isotipo | Abcam | ab106163 | Dilución: 1:400 |
| Anticuerpo monoclonal anti-CD90 de ratón | Abcam | ab225 | Dilución: 1:1000 para ICC, 0,1 y micro; g para células 106 para el |
| anticuerpo anti-S100 de ratón | Abcam | ab212816 | Dilución: 1:400 |
| Polilisina (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Humano recombinante NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 Proteína de dominio EGF R | & D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (p/v) tripsina | Gibco | 25200-072 |
Referencias
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L.
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Reimpresiones y permisos
