Aquí, presentamos un método para purificar fibroblastos y células Schwann de nervios sensoriales y motores in vitro.
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Artículo de método
Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Las principales células del sistema nervioso periférico son las células Schwann (SCs) y los fibroblastos. Ambas células expresan claramente los fenotipos sensoriales y motores implicados en diferentes patrones de expresión génica del factor neurotrófico y otros procesos biológicos, afectando la regeneración nerviosa. El presente estudio ha establecido un protocolo para obtener SCs y fibroblastos sensoriales y motores altamente purificados más rápidamente. La raíz ventral (nervio motor) y la raíz dorsal (nervio sensorial) de ratas neonatales (7 días de edad) se disociaron y las células se cultivaron durante 4-5 días, seguidos por el aislamiento de fibroblastos sensoriales y motores y CC mediante la combinación secuencial de digestión diferencial y adherencia diferencial. Los resultados de los análisis de inmunocitoquímica y citometría de flujo mostraron que la pureza de los CC y fibroblastos sensoriales y motores eran >90%. Este protocolo se puede utilizar para obtener un gran número de fibroblastos/SCs sensoriales y motores más rápidamente, contribuyendo a la exploración de la regeneración sensorial y nerviosa motora.
Introducción
En el sistema nervioso periférico, las fibras nerviosas consisten principalmente en axones, células Schwann (SCs) y fibroblastos, y también contiene un pequeño número de macrófagos, células endoteliales microvasculares, y células inmunitarias1. Los SCs envuelven los axones en una proporción de 1:1 y están encerrados por una capa de tejido conectivo llamada endoneurium. Los axones se agrupan para formar grupos llamados fascículos, y cada fascículo se envuelve en una capa de tejido conectivo conocida como perineurium. Finalmente, toda la fibra nerviosa se envuelve en una capa de tejido conectivo, que se denomina epineurio. En el endoneurium, toda la población celular se compone de 48% DE SCs, y una porción sustancial de las células restantes involucra fibroblastos2. Además, los fibroblastos son componentes importantes de todos los compartimentos nerviosos, incluyendo el epineurium, el perineurium y el endoneurium3. Muchos estudios han indicado que los SCs y los fibroblastos desempeñan un papel crucial en el proceso de regeneración después de las lesiones del nervio periférico4,,5,6. Después de la transección del nervio periférico, los fibroblastos perineuriales regulan la clasificación celular a través de la vía de señalización de ephrin-B/EphB2 entre SCs y fibroblastos, guiando aún más el recrecimiento axonal a través de las heridas5. Los fibroblastos nerviosos periféricos secretan la proteína tenascina-C y mejoran la migración de los SCs durante la regeneración nerviosa a través de la vía de señalización de 1-integrina7. Sin embargo, los SCs y fibroblastos utilizados en los estudios anteriores se derivaron del nervio ciático, que incluye los nervios sensoriales y motores.
En el sistema nervioso periférico, los nervios sensoriales (nervios aferentes) llevan a cabo la señalización sensorial desde los receptores al sistema nervioso central (SNC), mientras que los nervios motores (nervios eferentes) conducen señales desde el SNC hasta los músculos. Estudios previos han indicado que los SCs expresan fenotipos motores y sensoriales distintos y secretan factores neurotróficos para apoyar la regeneración de los nervios periféricos8,,9. Según un estudio reciente, los fibroblastos también expresan diferentes fenotipos motores y sensoriales y afectan la migración de SCs10. Así, la exploración de las diferencias entre los fibroblastos/SC motores y nerviosos sensoriales nos permite estudiar los complicados mecanismos moleculares subyacentes de la regeneración específica del nervio periférico.
En la actualidad, existen muchas formas de purificar los CC y los fibroblastos, incluida la aplicación de agentes antimitoticos, citolisis mediada por anticuerpos11,12, inmunopanning secuencial13 y sustrato de laminina14. Sin embargo, todos los métodos anteriores eliminan los fibroblastos y preservan sólo los SCs altamente purificados y los fibroblastos se pueden obtener mediante la tecnología de clasificación de citometría de flujo15,pero es una técnica lenta y costosa. Por lo tanto, en este estudio, se desarrolló un método simple de digestión diferencial y adherencia diferencial para purificar y aislar fibroblastos sensoriales y nerviosos y SCs con el fin de obtener un gran número de fibroblastos y SCs más rápidamente.
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Protocolo
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices Institucionales de Cuidado animal de la Universidad de Nantong. Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, fueron aprobados éticamente por el Comité de Administración de Animales Experimentales, provincia de Jiangsu, China.
1. Aislamiento y cultivo de fibroblastos nerviosos motores y sensoriales y SCs
- Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) de siete días de edad (n-4) proporcionadas por el Centro Animal Experimental de la Universidad de Nantong de China. Colocar las ratas en un tanque que contenga 5% de isoflurano durante 2-3 minutos, permitir que los animales respiren lentamente y no tengan actividad independiente, y luego desinfectar usando 75% de etanol antes de la decapitación.
- Use tijeras para cortar la piel posterior durante unos 3 cm y retire la columna vertebral. Abra el canal vertebral cuidadosamente para exponer la médula espinal.
- Mantener la médula espinal en un plato Petri de 60 mm con 2-3 ml de solución de sal equilibrada de D-Hanks (HBSS).
- Basado en la estructura anatómica, extirpar la raíz ventral (nervio motor) y luego la raíz dorsal (nervio sensorial) bajo un microscopio diseccionado. A continuación, colóquelos en una solución de sal equilibrada (HBSS) de D-Hanks helada.
- Después de retirar el HBSS, cortar los nervios en trozos de 3-5 mm con tijeras y digerir con 1 ml de 0.25% (p/v) tripina a 37 oC durante 18-20 min. A continuación, suplemento con 3-4 ml de DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) para detener la digestión.
- Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo suavemente unas 10 veces y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Después de eso, desechar el sobrenadante y suspender el precipitado en 2-3 mL de DMEM complementado con 10% FBS.
- Filtrar la suspensión celular usando un filtro de malla 400, y luego inocular las células en plato Petri de 60 mm y cultivo a 37 oC en presencia de 5% CO2. Después de 4-5 días de cultivo, aísle el paso 0 (p0) fibroblastos y SCs después de alcanzar el 90% de confluencia.
- Aislamiento y cultura de SCs (Figura 1)
- Lave las células una vez usando 1x PBS. Añadir 1 ml de 0,25% (p/v) de trippsina (37 oC) por plato de Petri de 60 mm para digerir las células durante 8-10 s a temperatura ambiente. Después de eso, añadir 3 mL de DMEM complementado con 10% FBS para detener la digestión.
- Sople suavemente la mezcla para separar los SCs con una pipeta. A continuación, recoger y centrifugar los SCs a 800 x g durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante y suspender el precipitado en 3 mL de DMEM con 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, forskoline de 2 m y 10 ng/mL HRG, y luego inocular las células en un plato de Petri de 60 mm sin recubrimiento. Después de cultivar a 37 oC durante 30-45 min, los fibroblastos (un número de fibroblastos se digieren con SCs) se unen a la parte inferior del plato.
- Transfiera el sobrenadante (incluidos los SCs) a otro plato mediano recubierto de poli-L-lisina (PLL) y el cultivo a 37 oC durante 2 días.
- Aislamiento y cultivo de fibroblastos (Figura 1)
- Después de retirar los SCs (como se muestra en el paso 1.8), lave los fibroblastos restantes en los platos con 1x PBS y luego agregue 1 ml de 0.25% (p/v) de trippsina para digerir los fibroblastos durante 2 min a 37 oC.
- Añadir DMEM complementado con 10% FBS para terminar la digestión. Soplar los fibroblastos con una pipeta, y luego recogerlos y centrifugarlos a 800 x g durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante, suspender el precipitado con 2 ml de DMEM que contiene 10% FBS, y luego inocular las células en un plato petri de 60 mm sin recubrimiento. Los fibroblastos después del cultivo durante 30-45 min a 37 oC se unen a la parte inferior del plato. Deseche el sobrenadante (incluyendo algunos números de SCs). A continuación, añadir 3 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS en el plato de fibroblastos y cultivo a 37 oC durante 2 días.
- Pasar las células p1 hasta que alcanzaron el 90% de confluencia. A continuación, purificarlos por digestión diferencial y adherencia diferencial de nuevo como se describe en las secciones 1.8 y 1.9.
- Digerir los fibroblastos p2 y SCs después de cultivar durante 2 días, y luego recoger las células, contar e inocular en 1 x 105 números/bien en diapositivas recubiertas de PLL para inmunocitoquímica (ICC).
2. ICC para la identificación de la pureza celular
- Cultivo de las células durante 24 h a 37 oC y realizar tinción ICC después de la digestión diferencial y adherencia diferencial de fibroblastos motores y sensoriales y SCs.
- Lavar los fibroblastos motores y sensoriales y los SCs con 1x PBS y fijarlos en 200 l/pozo de 4% de paraformaldehído (pH 7.4) durante 18 min a temperatura ambiente.
- Bloquear los SCs de muestra con tampón de bloqueo (0,1% Tritón X-100 en 0,01 M PBS que contiene un 5% de suero de cabra) y bloquear los fibroblastos de la muestra con tampón de bloqueo (0,01 M PBS que contiene 5% de suero de cabra) durante 45 minutos a 37 oC después de lavarlos con PBS tres veces.
- Retire el tampón de bloqueo e incubar con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-CD90 monoclonal de ratón (un marcador específico para fibroblastos) (1:1000) para fibroblastos y anticuerpos anti-S100 de ratón (un marcador específico para SCs) (1:400) para SCs a 4 oC durante la noche.
- Deseche los anticuerpos primarios, lávelos con PBS tres veces e incubar con los siguientes anticuerpos secundarios: IgG antiratón de cabra Alexa Fluor 594 (1:400) para fibroblastos y IgG antiratón de cabra conjugado con 488 (1:400) para SCs a temperatura ambiente durante 1,5 h.
- Lave las muestras tres veces con PBS y manche los núcleos con un tinte Hoechst 33342 de 5 g/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave la muestra con 1 veces PBS tres veces y móntela utilizando el medio de montaje (20 l/deslizamiento) en el portaobjetos de vidrio.
- Tome las fotografías celulares mediante un microscopio de escaneo láser confocal en tres campos aleatorios para cada pozo. Evalúe el número total de núcleos y células cd90 positivas, células S100 positivas y luego calcule el porcentaje de células CD90 positivas y células S100 positivas, respectivamente. Realizar la tinción por triplicado.
3. Análisis de citometría de flujo (FCA) para la identificación de la pureza celular
- Evaluar la pureza de los fibroblastos y SCs motores y sensoriales como se describió anteriormente por FCA16. En resumen, digiere los fibroblastos motores y sensoriales p2 y los SCs con 0,25% (p/v) de tripina, resuspendi los gránulos celulares y incubarlos en medio de fijación a temperatura ambiente durante 15 min.
- Incubar las células con medio de permeabilización y sonda utilizando anticuerpos anti-CD90 monoclonales de ratón (0,1 g/106 células, 200 l) para fibroblastos y anticuerpos anti-S100 de ratón (1:400, 200 l) para SCs a temperatura ambiente durante 30 min, respectivamente.
- Incubar las células con 488-conjugado de cabra anti-ratón IgG durante 30 min. Utilice el calibre FACS para realizar la citometría de flujo, y analizar los datos utilizando el software Cell Quest.
- Incubar las células sólo con 488-conjugados de cabra anti-ratón IgG (Grupo de fibroblastos) y ratón IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Control de isotipo (grupo SCs), que sirve como control negativo.
4. Análisis estadístico
- Evaluar las diferencias estadísticas en los datos mediante la prueba tno parís con GraphPad Prism 6.0. Establezca la significancia estadística en p<0.05. Realizar todos los ensayos en triplicado.
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Resultados
Observación microscópica de luz
Los SCs y los fibroblastos son las dos poblaciones celulares principales obtenidas en el cultivo celular primario a partir de tejidos nerviosos. Después de la inoculación durante 1 h, la mayoría de las células se adhirieron a la parte inferior del plato, y la morfología celular cambió de redonda a ovalada. Después del cultivo durante 24 h, los SCs exhibieron una morfología bipolar o tripolar y la longitud de estos osciló entre 100 y 200 ...
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Discusión
Las dos principales poblaciones celulares de los nervios periféricos incluían CC y fibroblastos. Los fibroblastos y SCs cultivados principalmente pueden ayudar con precisión a modelar la fisiología de fibroblastos y CC durante el desarrollo y la regeneración de los nervios periféricos. El estudio mostró que las células nerviosas ciáticas de rata P7 contenían alrededor del 85% de S100-positivas SCs, 13% de fibroblastos OX7 positivos y sólo 1.5% de macrófagos OX42 positivos13. Aunque el número de fi...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Grant No. 2017YFA0104703), la Fundación Natural Nacional de China (Grant No. 31500927).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 Cabra Anti-Ratón IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilución: 1:400 |
| CoraLite488-conjugado Affinipure Cabra Anti-Ratón IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilución: 1:400 |
| Microscopio de barrido láser confocal | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Software Cell Quest | Becton Dickinson Biosciences | ||
| Solución salina equilibrada de D-Hank | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Microscopio de disección | Olympus | SZ2-ILST | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Medio de montaje | Abcam | ab104135 | |
| Medio de fijación/Medio de permeabilización | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Citometría de flujo | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Control de isotipo | Abcam | ab106163 | Dilución: 1:400 |
| Anticuerpo monoclonal anti-CD90 de ratón | Abcam | ab225 | Dilución: 1:1000 para ICC, 0,1 y micro; g para células 106 para el |
| anticuerpo anti-S100 de ratón | Abcam | ab212816 | Dilución: 1:400 |
| Polilisina (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Humano recombinante NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 Proteína de dominio EGF R | & D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (p/v) tripsina | Gibco | 25200-072 |
Referencias
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