Un modelo de rata de sobrecarga de presión inducida remodelación moderada y disfunción sistólica en comparación con la insuficiencia cardíaca sistólica excesiva

Resumen

Describimos la creación de un modelo de rata de sobrecarga de presión inducida remodelación moderada y disfunción sistólica temprana donde se activan las vías de transducción de señales implicadas en el inicio del proceso de remodelación. Este modelo animal ayudará a identificar dianas moleculares para aplicar estrategias terapéuticas tempranas anti-remodelación para la insuficiencia cardíaca.

Resumen

En respuesta a una lesión, como el infarto de miocardio, la hipertensión prolongada o un agente cardiotóxico, el corazón se adapta inicialmente a través de la activación de vías de transducción de señal, para contrarrestar, a corto plazo, la pérdida de miocitos cardíacos y el aumento del estrés en la pared. Sin embargo, la activación prolongada de estas vías se vuelve perjudicial para la iniciación y propagación de la remodelación cardíaca que conduce a cambios en la geometría ventricular izquierda y aumentos en los volúmenes ventriculares izquierdos; un fenotipo observado en pacientes con insuficiencia cardíaca sistólica (HF). Aquí, describimos la creación de un modelo de rata de sobrecarga de presión inducida remodelación moderada y disfunción sistólica temprana (MOD) por bandas aórticas ascendentes (AAB) a través de un clip vascular con un área interna de 2 mm^2. La cirugía se realiza en ratas Sprague-Dawley de 200 g. El fenotipo MOD HF se desarrolla a las 8-12 semanas después de AAB y se caracteriza no invasivamente por medio de ecocardiografía. Los trabajos anteriores sugieren la activación de las vías de transducción de señales y la expresión génica alterada y la modificación post-traduccional de proteínas en el fenotipo MOD HF que imitan a las que se ven en la IC sistólica humana; por lo tanto, haciendo del fenotipo MOD HF un modelo adecuado para la investigación traslacional para identificar y probar posibles dianas terapéuticas anti-remodelación en HF. Las ventajas del fenotipo MOD HF en comparación con el fenotipo sistólico de HF es que permite la identificación de dianas moleculares implicadas en el proceso de remodelación temprana y la aplicación temprana de intervenciones terapéuticas. La limitación del fenotipo MOD HF es que puede no imitar el espectro de enfermedades que conducen a la IC sistólica en humanos. Además, es un fenotipo desafiante para crear, ya que la cirugía AAB se asocia con altas tasas de mortalidad y fracaso con sólo 20% de ratas operadas desarrollando el fenotipo HF deseado.

Introducción

La insuficiencia cardíaca (HF) es una enfermedad prevalente y se asocia con una alta morbilidad y mortalidad¹. Los modelos de sobrecarga de presión de roedores (PO) de HF, producidos por bandas aórticas ascendentes o transversales, se utilizan comúnmente para explorar mecanismos moleculares que conducen a la IC y para probar posibles dianas terapéuticas novedosas en la IC. También imitan los cambios observados en la IC humana secundaria a la hipertensión sistémica prolongada o la estenosis aórtica grave. Después de PO, la pared del ventventricular izquierdo (LV) aumenta gradualmente en grosor, un proceso conocido como hipertrofia concéntrica de LV (LVH), para compensar y adaptarse al aumento de la tensión de la pared del VL. Sin embargo, esto se asocia con la activación de una serie de vías de señalización maladaptive, que conducen a destornaduras en el ciclo de calcio y homeostasis, remodelación metabólica y de matriz extracelular y cambios en la expresión génica, así como apoptosis mejorada y autofagia^2,3,4,5,6. Estos cambios moleculares constituyen el desencadenante de la iniciación y propagación de la remodelación miocárdica y la transición a un fenotipo de IC descompensado.

A pesar del uso de cepas de roedores endogámicos y la estandarización del tamaño del clip y la técnica quirúrgica, hay una tremenda variabilidad fenotípica en la estructura y función de la cámara LV en los modelos de bandas aórticas^7,8,9. La variabilidad fenotípica encontrada después de PO en rata, cepa Sprague-Dawley, se describe en otros lugares^10,11. De ellos, dos fenotipos de ONDAS decatonados se encuentran con evidencia de remodelación miocárdica y activación de vías de transducción de señales que conducen a un estado de mayor estrés oxidativo. Esto se asocia con la remodelación metabólica, la expresión génica alterada y los cambios en la modificación posttranslacional de las proteínas, jugando un papel en el proceso de remodelación^10,,12. El primero es un fenotipo de remodelación moderada y disfunción sistólica temprana (MOD) y el segundo es un fenotipo de HF sistólica indecida (HFrEF).

El modelo PO de HF es ventajoso sobre el modelo de infarto de miocardio (MI) de HF porque las tensiones circunferenciales y de pared meridional inducidas por PO se distribuyen homogéneamente en todos los segmentos del miocardio. Sin embargo, ambos modelos sufren de variabilidad en la gravedad de PO^10,,11 y en infarto tamaño^13,14 junto con inflamación intensa y cicatrices en el sitio del infarto^15, así como la adhesión a la pared torácica y los tejidos circundantes, que se observan en el modelo MI de HF. Por otra parte, el modelo de HF inducido por PO de rata es difícil de crear, ya que se asocia con altas tasas de mortalidad y fracaso^10,con sólo 20% de las ratas operadas desarrollando el fenotipo MOD HF¹⁰.

El MOD es un fenotipo HF atractivo y constituye una evolución del fenotipo HFrEF creado tradicionalmente, ya que permite la focalización temprana de las vías de transducción de señales que juegan un papel en la remodelación miocárdica, especialmente cuando se refiere a perturbaciones en la dinámica y función mitocondrial, metabolismo miocárdico, ciclo de calcio y remodelación de matriz extracelular. Estos procesos fisiopatológicos son muy evidentes en el fenotipo MOD HF^11. En este manuscrito, describimos cómo crear los fenotipos MOD y HFrEF y abordamos los escollos mientras realizamos el procedimiento de banda sortica ascendente (AAB). También profundizamos en cómo caracterizar mejor con ecocardiografía los dos fenotipos HF, MOD y HFrEF, y cómo diferenciarlos de otros fenotipos que no desarrollan PO severo o que desarrollan PO severo y remodelación concéntrica pero sin remodelación excéntrica significativa.

Protocolo

Todos los métodos y procedimientos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad de Tulane.

1. Herramientas e instrumentos para la creación de modelos AAB

1. Obtener desinfectantes, como 70% alcohol isopropílico y povidona-yodo.
2. Obtener ketamina y xilazina para la anestesia y buprenorfina para la analgesia.
3. Obtenga una almohadilla de calentamiento y una almohadilla inferior desechable de alta absorbencia con las dimensiones de 18 pulgadas x 30 pulgadas.
4. Consigue un rollo de hilo 100% algodón, una cinta y un cortapelos.
5. Obtener una placa de plástico de 20 cm x 25 cm, rango de espesor entre 3-5 mm.
6. Obtenga un iluminador de fibra óptica Z-LITE.
7. Obtener un ventilador mecánico para animales pequeños (por ejemplo, SAR-830/AP).
8. Obtenga 2-0 y 3-0 suturas córset Vicryl y sutura de monofilamento de nylon 3-0, almohadillas de gasa estériles y puntas de algodón extra grandes estériles y guantes estériles.
9. Obtener angiocath 16 G para intubación.
10. Compre las siguientes herramientas quirúrgicas.
    1. Obtenga una ligadura Hemoclip de acero inoxidable Weck y clips de ligaduras de acero inoxidable.
    2. Obtenga tijeras de iris finas endurecidas.
    3. Obtener fórceps adsón.
    4. Consigue dos fórceps Graefe curvos.
    5. Consigue un fórceps recto Hemostats de Mosquito Halsted.
    6. Obtenga un soporte de aguja Mayo-Hegar.
    7. Consigue un retractor torácico de Alm con dientes romos.
11. Utilizar y obtener un autoclave y un esterilizador de cuentas.

2. Procedimiento quirúrgico de banda aórtica ascendente

1. Anestetizar al animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de 75-100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina.
   NOTA: Deje unos minutos para que el animal esté completamente sedado y flácido. Si la dosis anestésica no es suficiente y el animal todavía se mueve en la jaula, vuelva a inyectar al animal con la misma dosis anestésica después de permitir suficiente tiempo, alrededor de 5-10 minutos entre las inyecciones posteriores. La mayoría de los animales requieren 1-2 inyecciones para lograr sedación profunda y anestesia.
2. Afeitar el cabello en el sitio quirúrgico ubicado en el área torácica lateral derecha debajo de la axila derecha.
3. Estabilice al animal pegando suavemente las cuatro extremidades a la tabla de plástico. Luego realice la intubación endotraqueal con una angiocath de 16 G. Después de que el animal sea intubado con éxito, iniciar la ventilación mecánica con volúmenes de marea de 2 mL a 50 ciclos/min y FiO₂ del 21%. Busque el aumento simétrico en la pared torácica con cada respiración.
4. Gire al animal lentamente para que se acueste en su lado lateral izquierdo, y luego doble la cola de una manera en forma de U y estabilice golpeándola suavemente a la tabla de plástico. A continuación, siga adelante y desinfecte el área arasda con la aplicación tópica de povidona-yodo.
5. Infiltrar la piel en el lugar de la incisión con una mezcla de 50/50 en volumen de 1-2% de lidocaína/0.25-0.5 % de bupivacaína como analgesia preventiva antes de hacer la incisión.
6. Realizar una incisión cutánea horizontal derecha, de 1-2 centímetros de largo, en el área axilar derecha 1 cm por debajo de la axila derecha. Luego, disecciona la capa muscular torácica hasta llegar a la caja torácica torácica. Haga una toracotomía de 1 cm^rd entre la caja torácica 2^y 3.
   1. Mientras disecte la capa muscular del pecho, tenga cuidado y evite lesiones en la arteria axilar derecha, que corre debajo de la axila derecha.
      NOTA: La toracotomía realizada entre la^1a y la costilla^2a conlleva el riesgo de unir la arteria braquiocéfala derecha en lugar de la aorta ascendente. La toracotomía entre la^3a y la cuarta costilla hace que sea difícil de visualizar y banda rindar la aorta ascendente, ya que el operador estará mirando la aurícula derecha.
      NOTA: Evite extender la toracotomía demasiado medialiente hacia el esternón para evitar disocción y lesiones en la arteria mamaria interna derecha.
7. Disecciona los dos lóbulos de la glándula del timo suavemente y empújalos de lado. Luego identifica la aorta ascendente y aíslala de la vena cava superior por disección contundente a través de un fórceps Graefe curvo.
   NOTA: La manipulación significativa de la glándula del timo la hará hinchada y dificultará la visualización de la aorta ascendente.
   1. Diseccionar la vena cava superior de la aorta con especial precaución para evitar lesiones o roturas de la vena cava superior, que es fatal. Esta puede ser la parte más difícil del procedimiento y se espera que suceda de vez en cuando, incluso en la mayoría de las manos experimentadas, pero a menudo con principiantes y estudiantes.
8. Levante suavemente la aorta ascendente con un fórceps Graefe curvo y coloque el clip vascular alrededor de la aorta ascendente.
   1. Ajuste la herramienta de ligadura de hemorclips vasculares a través de una pieza de plástico precortada de 7" para obtener un clip vascular del área interna deseada de 1,5 mm² o 2 mm^2,dependiendo del modelo de IC que se desee.
9. Sutura el tórax a través de una sutura de monofilamento Vicryl 2-0. A continuación, sutura la capa muscular del pecho a través de una sutura cónico 3-0 Vicryl. A continuación, sutura la incisión de la piel a través de una sutura monofilamento de nylon 3-0.
10. Administrar una combinación de los siguientes medicamentos después de la finalización de la cirugía durante 48-72 horas para servir como analgesia en el período postoperatorio: 1) Buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg por vía subcutánea cada 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg por vía subcutánea cada 12h, y 3) Morfina 2,5 mg/kg por vía subcutánea cada 2-4h según sea necesario para el dolor intenso.
    NOTA: Deje que el animal se recupere en una almohadilla de calefacción bajo monitoreo regular. Una vez que el animal muestra signos de recuperación de la anestesia (capaz de respirar espontáneamente - sin evidencia de jadeo o uso de los músculos accesorios durante más de dos minutos - y tiene buenos reflejos, extremidades rojas y cálidas), extubar al animal y devolverlo a la jaula.

3. Ecocardiografía

1. Sedar al animal con inyección intraperitoneal de 80-100 mg/kg de ketamina. Asegurar una sedación adecuada para la adquisición adecuada de imágenes de eco de buena calidad.
   NOTA: Se desaconseja el uso de isoflurano como anestésico por su efecto cardiodepresor, especialmente en el entorno de una sobrecarga de presión grave y podría dar una falsa impresión de dilatación del VL y disfunción sistólica que se resuelve una vez que el animal está fuera de la anestesia.
   1. Tenga cuidado y administre la mitad o incluso un tercio de la dosis de ketamina en animales que se ven dispneicos y taquipneicos con sospecha de que han desarrollado el fenotipo HFrEF.
2. Afeitar el pelo del pecho, anteriormente, en el animal completamente sedado.
3. Poner al animal en su espalda y estabilizarlo en la tabla de plástico.
4. Adquiera clips de vista de eje largo parasternal 2D y 2D parasternales a nivel del músculo papilar. Además, obtenga imágenes en modo M desde la vista corta del eje parasternal a nivel del músculo papilar para medir el espesor de la pared septal y posterior del VI en diastole, así como el diámetro diastólico final y sistólico final de LV.
   1. Adquiera imágenes o clips a una frecuencia cardíaca de 370 - 420 latidos por minuto para garantizar una evaluación adecuada del tamaño y la función del LV. La adquisición de imágenes a frecuencias cardíacas más bajas dará lugar a una falsa impresión de la función de LV deprimida y la dilatación del VL.
      NOTA: La adquisición de imágenes/clips de vista de eje parasternal largo 2D escorzados conducen a mediciones falsas. Para fines de control de calidad, asegúrese de que el ápice LV y el ángulo aorto-mitral se visualicen dentro del mismo corte de plano.
   2. Adquirir imágenes/clips de vista de eje parasternal corto 2D a nivel del músculo papilar medio. Esto servirá como referencia para obtener mediciones fiables de lvablaense en serie y posteriores mientras sigue a los animales a lo largo del tiempo durante el período de estudio.
5. Obtenga imágenes en modo M en vista larga del eje parasternal a nivel de la válvula aórtica para evaluar el diámetro relativo de la aortica a la aurícula izquierda (LA) en la sístole final.
   NOTA: Los animales con los fenotipos MOD y HFrEF deben mostrar evidencia de dilatación LA con una relación LA/Ao que sea de 1,25 y 1,5 euros en fenotipo MOD HF y 1,5 en el fenotipo¹⁰de HFrEF.

Resultados

La caracterización de los fenotipos de ondas decavío, que se desarrollan 8-12 semanas después de AAB, podría realizarse fácilmente a través de ecocardiografía. Las imágenes representativas en modo M de los fenotipos Sham, Week 3 post-AAB, MOD y HFrEF se presentan en la Figura 1A. La Figura 1B y la Figura 1C muestran el tamaño del clip vascular para la creación de...

Discusión

Después de PO relacionado con AAB en rata, el LV se somete a una remodelación concéntrica mediante el aumento del espesor de la pared del VL, conocido como LVH concéntrico, como un mecanismo compensatorio para contrarrestar el aumento de la tensión de la pared del VL. El aumento en el espesor de la pared LV se hace notable durante la primera semana después de AAB y alcanza su espesor máximo en 2-3 semanas después de AAB. Durante este período de tiempo, la activación de las vías de transducción de señal maladaptive conduc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas de Adson	F.S.T.	11019-12	herramienta quirúrgica
Alm retractor torácico con dientes romos	ROBOZ	RS-6510
pinza Graefe, curvada	F.S.T.	11152-10	herramienta quirúrgica
Halsted-Mosquito Hemostáticos, rectos	F.S.T.	13010-12	herramienta quirúrgica
Tijeras de iris finas endurecidas, rectas	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	herramienta quirúrgica
hemoclip tradicional-acero inoxidable pinzas de ligadura	Weck	523735	herramienta quirúrgica
Mayo-Hegar portaagujas	F.S.T.	12004-18	herramienta quirúrgica
ventilador mecánico	CWE inc	SAR-830/AP	ventilador mecánico para animales pequeños
Ligadura Hemoclip de acero inoxidable	Weck	533140	herramienta quirúrgica