Enfoque estereotáctico en ángulo adaptable para técnicas versátiles de neurociencia

Resumen

Aquí se describe un procedimiento estereotáctico que puede apuntar a regiones cerebrales desafiantes y difíciles de alcanzar (debido a limitaciones espaciales) utilizando un enfoque coronal en ángulo. Este protocolo es adaptable tanto a modelos de ratón como de rata y se puede aplicar a diversas aplicaciones neurocientíficas, incluida la implantación de cánulas y microinyecciones de construcciones virales.

Resumen

La cirugía estereotáctica es una herramienta esencial en el laboratorio de neurociencia moderno. Sin embargo, la capacidad de apuntar con precisión y precisión a regiones cerebrales difíciles de alcanzar todavía presenta un desafío, particularmente cuando se dirigen a estructuras cerebrales a lo largo de la línea media. Estos desafíos incluyen evitar el seno sagital superior y el tercer ventrículo y la capacidad de dirigirse consistentemente a núcleos cerebrales selectivos y discretos. Además, las técnicas de neurociencia más avanzadas (por ejemplo, optogenética, fotometría de fibra e imágenes de dos fotones) se basan en la implantación dirigida de hardware significativo para el cerebro, y las limitaciones espaciales son un obstáculo común. Aquí se presenta un protocolo modificable para la orientación estereotáctica de las estructuras cerebrales de roedores utilizando un enfoque coronal en ángulo. Se puede adaptar a 1) modelos de ratón o rata, 2) varias técnicas de neurociencia y 3) múltiples regiones cerebrales. Como ejemplo representativo, incluye el cálculo de coordenadas estereotácticas para la orientación del núcleo ventromedial hipotalámico de ratón (VMN) para un experimento de inhibición optogenética. Este procedimiento comienza con la microinyección bilateral de un virus adenoasociado (AAV) que codifica un canal de cloruro sensible a la luz (SwiChR ++) a un modelo de ratón dependiente de Cre, seguido de la implantación bilateral en ángulo de cánulas de fibra óptica. Usando este enfoque, los hallazgos muestran que la activación de un subconjunto de neuronas VMN es necesaria para las respuestas contrarreguladoras de glucosa intacta a la hipoglucemia inducida por insulina.

Introducción

El control neuronal del comportamiento, la alimentación y el metabolismo implica la coordinación de neurocircuitos altamente complejos, integradores y redundantes. Un objetivo impulsor del campo de la neurociencia es diseccionar la relación entre la estructura y la función del circuito neuronal. Aunque las herramientas clásicas de neurociencia (es decir, lesiones, inyecciones farmacológicas locales y estimulación eléctrica) han descubierto un conocimiento vital sobre el papel de regiones cerebrales específicas que controlan el comportamiento y el metabolismo, estas herramientas están limitadas por su falta de especificidad y reversibilidad¹.

Los avances recientes en el campo de la neurociencia han mejorado en gran medida la capacidad de interrogar y manipular la función del circuito de una manera específica de tipo celular con alta resolución espaciotemporal. Los enfoques optogenético² y quimiogenético^3, por ejemplo, permiten la manipulación rápida y reversible de la actividad en tipos de células genéticamente definidas de animales que se mueven libremente. La optogenética implica el uso de canales iónicos sensibles a la luz, denominados canalrhodopsinas, para controlar la actividad neuronal. La clave de esta técnica es la entrega génica de canalrhodopsina y una fuente de luz para activar la opsina. Una estrategia común para la entrega de genes es a través de una combinación de 1) ratones genéticamente modificados que expresan Cre-recombinasa en neuronas discretas, y 2) vectores virales dependientes de Cre que codifican canalrhodopsina.

Si bien la optogenética proporciona un medio elegante y altamente preciso para controlar la actividad neuronal, el método depende de la microinyección estereotáctica exitosa del vector viral y la colocación de fibra óptica en una región cerebral definida. Aunque los procedimientos estereotácticos son comunes dentro del laboratorio de neurociencia moderno (y hay varios protocolos excelentes que describen este procedimiento)^4,5,6, ser capaz de dirigirse de manera consistente y reproducible a regiones cerebrales discretas a lo largo de la línea media (es decir, el hipotálamo mediobasal, un área del cerebro crítica para la regulación de las funciones homeostáticas⁷⁾presenta desafíos adicionales. Estos desafíos incluyen evitar el seno sagital superior, el tercer ventrículo y los núcleos hipotalámicos adyacentes. Además, existen limitaciones espaciales significativas para la implantación bilateral de hardware que se requiere para los estudios de inhibición. Con estos desafíos en mente, este protocolo presenta un procedimiento modificable para apuntar a regiones cerebrales discretas a través de un enfoque estereotáctico en ángulo.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales y fueron aprobados tanto por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) como por Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad de Washington.

1. Cálculo de coordenadas en ángulo

1. Usando un atlas cerebral coronal, marque un triángulo rectángulo para que la hipotenusa pase a través de la región objetivo de interés. En el ejemplo representativo(Figura 1),el núcleo ventromedial hipotalámico (VMN) se dirige a un ángulo de 15° desde la línea media coronal.
   NOTA: La colocación del eje de rotación representado en la Figura 1 (y por lo tanto, la longitud del lado C) es arbitraria y puede modificarse para apuntar a cualquier región del cerebro. Aunque esto puede parecer contradictorio, los pasos posteriores del protocolo ajustarán la posición de la cabeza en el eje z de tal manera que este punto se alinee con el centro de rotación estereotáctico (ver sección 6). Sin embargo, se recomienda no exceder un ángulo de rotación coronal de 15 ° debido a las limitaciones físicas del aparato del soporte de la cabeza.
2. Establezca el ángulo deseado (a) y la longitud estimada del lado B y use trigonometría para calcular la longitud de los lados A y C. Este paso es importante para posicionar correctamente la cabeza durante la rotación.
   NOTA: En el ejemplo de la Figura 1,las líneas de cuadrícula del atlas se utilizan para aproximar la longitud del lado B, produciendo una longitud de 7.576 mm. Esta información se utiliza para calcular la longitud del lado A:
   
   En este ejemplo, 2,03 mm indica la distancia R/L desde la línea media a la que la cánula de fibra óptica entra en el cerebro cuando la cabeza se gira 15°.
   1. Opcionalmente, calcule la longitud del lado C para aproximarse a la coordenada D/V:
      
      NOTA: 1) La longitud de la hipotenusa (C) no representa la profundidad de la inyección, pero será útil para determinar la coordenada D / V, que puede necesitar ser ajustada para adaptarse al aumento de la longitud frente al lado B para las inyecciones directas. Por lo tanto, se recomienda realizar inyecciones de prueba para optimizar la coordenada D/V. 2) En este ejemplo dirigido al VMN, se obtienen dos conjuntos de coordenadas: uno para la microinyección que no está en ángulo (A/P = -1.4, R/L = 0.4 a 0°, D/V = -5.7) y otro para la implantación de fibra óptica en ángulo (A/P = -1.4, R/L = 0.0 a 15°, D/V = -5.4).

2. Preparación de la estereotación para el procedimiento en ángulo

1. Confirme que el marco estereotáctico y el micromanipulador han sido calibrados (consulte el manual de Kopf para obtener el protocolo completo).
2. Coloque el medidor de altura central en el zócalo de la placa base del soporte de la cabeza.
3. Asegure el visor de centrado en el portaherramientas y, a continuación, visualmente el visor. Ajuste la posición del micromanipulador hasta que los puntos de mira estén alineados y enfocados en el punto de mira del medidor.
   NOTA: Durante este paso, el endoscopio se coloca en el plano focal del centro de rotación del titular de la cabeza. Una vez establecido, el micromanipulador no debe moverse durante los pasos restantes.
4. Coloque las barras de la oreja en los soportes y córquelas de tal manera que las líneas indicadoras en ambos lados estén en 0 (Figura 3A).
5. Utilice las perillas medial-lateral y anterior-posterior en el soporte de la cabeza (Figura 2) para alinear en el centro las barras de los oídos en los planos X e Y por encima de la cruz del medidor de altura central (Figura 3A).
6. Para alinear la posición de la barra auricular en el eje Z, retire las barras auriculares del soporte y retire el medidor de altura central. Reemplace las barras para los oídos y vuelva a centrarlas en 0.
7. Mira hacia abajo en el alcance. Utilice la perilla de desplazamiento vertical(Figura 3B)y la perilla de inclinación coronal, respectivamente, para bajar y girar las barras de la oreja hasta que la mira del endoscopio permanezca centrada entre las barras de la oreja a lo largo de la rotación coronal.
8. La estereotaxia ya está calibrada y lista. No realice más ajustes en la posición del soporte de la cabeza.

3. Preparación de materiales para inyección/implantación

1. Asegúrese de que todos los instrumentos, herramientas quirúrgicas y materiales estén esterilizados y colocados en un campo quirúrgico estéril junto a la estereota.
2. Manejar y almacenar construcciones virales de acuerdo con su nivel de bioseguridad y los requisitos reglamentarios institucionales relevantes de bioseguridad.
3. Extraiga el virus en la jeringa, teniendo cuidado de usar prácticas de manejo adecuadas y equipo de protección personal.

4. Anestesia

1. Registre el peso corporal del ratón antes de la cirugía.
2. Anestesia profundamente el ratón usando isoflurano.
3. Asegúrese de que el ratón esté profundamente anestesiado realizando una prueba de pellizco del dedo del dedo del día hasta que la respuesta de temblor esté ausente. Si el animal continúa mostrando reflejos fuertes, aumente la concentración y / o la duración de la anestesia.
4. Aplique ungüento para los ojos en cada ojo para mantenerlos húmedos durante la cirugía.
5. Afeitar el cuero cabelludo desde justo detrás de las orejas hasta justo detrás de los ojos con un cortapelos.
6. Proporcione al ratón analgésico aprobado por IACUC.
7. Monitorear continuamente al animal durante todo el procedimiento quirúrgico y proporcionar soporte térmico.

5. Procedimiento quirúrgico

1. Coloque la cabeza en el soporte de la cabeza colocando los incisivos superiores en el espacio en la barra de mordida, asegurándose de que la lengua esté debajo de la barra de mordida.
2. Asegure la cabeza en las barras de la oreja insertando suavemente las barras de la oreja en el meato auditivo externo, asegurándose de que las barras de la oreja estén colocadas simétricamente (generalmente entre tres y cuatro para un ratón adulto). Este paso es fundamental para garantizar que la cabeza sea estable y esté centrada para la rotación.
3. Prepare asépticamente el área de incisión afeitada con tres exfoliantes alternos de bedine e hisopos con alcohol, o con una preparación alternativa del sitio quirúrgico aprobada institucionalmente.
4. Coloque una cortina quirúrgica sobre el animal para mantener un campo quirúrgico estéril y reducir el riesgo de infección postoperatoria.
5. Exponga el cráneo haciendo una incisión a lo largo de la línea media sagital del cuero cabelludo. Raspe suavemente la superficie del cráneo para eliminar cualquier fascia y exponer las suturas.
   NOTA: Si las líneas de sutura son difíciles de visualizar, se puede aplicar peróxido de hidrógeno al cráneo utilizando un aplicador estéril con punta de algodón para mejorar la visualización de la sutura.
6. Coloque el visor de centrado en el soporte y centre el punto de mira en bregma(Figura 4,panel izquierdo). Cero el micromanipulador.
7. Mueva el punto de mira caudalmente a lambda, observando la distancia bregma-lambda (B-L).
   NOTA: Si las líneas de sutura no siguen una línea recta a lo largo de la línea media, se recomienda establecer la línea media utilizando la "línea de mejor ajuste" a través de bregma y lambda. Sin embargo, si se siguen los pasos anteriores, la colocación inicial de la retícula del endoscopio debe estar a medio camino entre las barras del oído y aproximarse mucho a la sutura de la línea media B-L.
8. Si la distancia B-L es significativamente menor o mayor que 4,21 mm, ajuste incrementalmente el bregma asignado para obtener una distancia B-L de 4,21 mm ± 0,2 mm.
9. Reemplace el ámbito de centrado por el indicador de alineación. Coloque las sondas en lambda y bregma y ajuste la perilla de inclinación dorsal en el soporte de la cabeza para nivelar en el plano sagital (nariz hacia arriba o hacia abajo), luego use el endoscopio de centrado para reasignar bregma.
10. Utilice el indicador de alineación para nivelar en el plano coronal utilizando la perilla de inclinación coronal. Mida en múltiples puntos a lo largo del eje rostral/caudal para tener en cuenta las deformaciones superficiales en el cráneo.
11. Tenga en cuenta la posición en el dial de la perilla de inclinación coronal, ya que esta es la posición de rotación de 0 °.

6. Alineación de los ejes centrales de rotación para coordenadas en ángulo

1. Asegure el alcance de centrado en el portaherramientas y coloque el micromanipulador en la coordenada calculada de la sección 1. Tenga en cuenta que la coordenada R/L para la implantación en ángulo corresponde a la longitud del lado A.
   1. En el ejemplo de la Figura 1,las coordenadas en ángulo para la colocación de fibra óptica dirigida al VMN son (A/P = -1.4, R/L = [2.03] a 0° de rotación coronal, [0.00] a 15° de rotación coronal, D/V = -5.4).
2. Avistamiento del alcance y marca esta coordenada (R/L 2,03 mm desde la línea media según el ejemplo de VMN; Figura 4,panel central). Esta marca representa el punto en el que la cánula entrará en el cerebro una vez que se gire la cabeza.
3. Reposicione el micromanipulador sobre la línea media (R/L = 0,00). Utilice la perilla de inclinación coronal para girar la cabeza hacia el ángulo calculado en la sección 1.
   1. Si el punto de mira del alcance ya se alinea con la marca, continúe con la sección 7.
   2. Si el punto de mira del visor no se alinea con la marca de referencia, ajuste la posición de la cabeza en el eje z utilizando la perilla de desplazamiento vertical (Figura 2) hasta que los puntos de mira se alinee lo más cerca posible de la marca.
4. Gire la cabeza hacia atrás a la posición coronal de 0°. Si el desplazamiento vertical se ajustó en el paso 6.3, reasigne bregma utilizando el ámbito de centrado.
5. Repita los pasos 6.3 y 6.4 hasta que la cruz alcance consistentemente la marca de referencia cuando se gira la cabeza(Figura 4C).
6. En este punto, el punto arbitrario de rotación establecido en la sección 1 ahora debe alinearse con el centro estereotáctico de rotación.

7. Microinyección

1. Coloque el taladro estereotáctico en el soporte y maniobra el micromanipulador hasta la primera coordenada de inyección.
   1. Según el ejemplo para apuntar al VMN, perfore en A / P = -1.4 y R / L = 0.4 mientras la cabeza está nivelada.
2. Baje el taladro hasta que la broca esté justo por encima del cráneo. Encienda el taladro y baje suavemente hasta que la broca haya perforado el cráneo (no la duramadre).
3. Repetir para el sitio de inyección contralateral.
4. Use un controlador de aguja estéril para introducir una curva de 90 ° en una aguja de 27-30G (por ejemplo, de una jeringa de insulina estéril de 0.5 ml) y use la aguja doblada para atravesar suavemente la duramadre.
5. NOTA: Si se produce sangrado, aplique presión con un aplicador estéril con punta de algodón y limpie con agua estéril hasta que el sangrado se haya detenido.
6. Cuando esté listo para inyectar, coloque cuidadosamente una jeringa Hamilton llena en el soporte estereotáctico.
   NOTA: Las coordenadas del micromanipulador ya no se aplican después de cambiar a una nueva herramienta. Utilice el centro del orificio de rebabas como el nuevo objetivo para la inyección.
7. Coloque cuidadosamente la aguja sobre el orificio de rebaba.
8. Baje la aguja hasta que toque ligeramente la duramadre dentro del centro del orificio de rebaba. CRÍTICO: Poner a cero el micromanipulador solo en el eje z, de modo que se mantengan las coordenadas en el micromanipulador para el alcance de centrado estereotáctico y el taladro.
9. Baje lentamente la aguja hacia el cerebro, observando de cerca para asegurarse de que la aguja no se desvíe en el borde del orificio de rebaba. Continúe bajando hasta 0,05 mm ventral a la coordenada de inyección D/V y espere 1 min. Este paso adicional crea un pequeño "bolsillo" para minimizar el reflujo viral en la extracción de la aguja.
10. Eleve lentamente la aguja a la coordenada D/V y comience la inyección.
    NOTA: El caudal y el volumen variarán según la región objetivo y el diseño experimental. Para el silenciamiento optogenético de las neuronas VMN, se desea una cobertura suficiente, por lo que se inyectan 200 nL de virus a una velocidad de 1 nL / s.
11. Después de la microinyección, espere 10 minutos en el lugar de la inyección para minimizar el eflujo del virus durante la abstinencia.
12. Retire lentamente la micropipeta del cerebro a una velocidad aproximada de 1 mm/min.
13. Una vez que la aguja esté libre del cráneo, expulse un pequeño volumen de virus para asegurarse de que la aguja no se haya obstruido con sangre o tejido. Use un aplicador estéril con punta de algodón para eliminar el virus antes de continuar.
14. Repita los pasos 7.6 a 7.12 para el lado contralateral.
15. Selle los orificios de la rebaba de microinyección con cera ósea para mejorar la curación (Figura 5B).

8. Implantación de fibra óptica

NOTA: Después de la inyección viral, las cánulas de fibra óptica bilateral se implantan en el ángulo calculado por sección 1. Tenga en cuenta que estas coordenadas ya deben estar marcadas en el cráneo de la sección 6.

1. Repita los pasos 7.1 –7.4 para las coordenadas en ángulo.
2. Devuelve la cabeza a la posición de nivel 0°.
3. A continuación, use el taladro manual para producir cuatro orificios adicionales para los tornillos óseos: dos deben colocarse anteriormente y dos posteriormente(Figura 5A). Estos servirán como anclajes para fijar la fibra óptica al cráneo(Figura 5D).
   NOTA: Asegúrese de espaciar los orificios lo suficientemente lejos de los orificios de rebaba de coordenadas en ángulo para acomodar la porción de la virola de la fibra óptica que se encuentra sobre el cráneo.
4. Tan suavemente como sea posible, use el pequeño destornillador de cabeza plana para colocar los tornillos óseos de tal manera que se asienten firmemente en el cráneo pero no penetren en el cerebro.
5. Sujete una cánula de fibra óptica en el soporte de la cánula y colóquela en el soporte estereotáctico.
6. Gire el cabezal hasta el ángulo calculado, observando de nuevo que las coordenadas del micromanipulador no se aplican a la nueva herramienta. Utilice el centro de los orificios de rebabas en ángulo como objetivo de implantación.
7. Baje la fibra óptica hasta que toque la duramadre dentro del centro del orificio de rebaba(Figura 5C). Cero el micromanipulador en el eje z, luego lentamente más lento el fibraóptico a la coordenada en ángulo D / V (-5.4 según el ejemplo VMN).
8. Use gel de cianoacrilato para conectar la virola de fibra óptica a los tornillos de anclaje ipsilaterales, luego aplique un acelerante con una punta de micropipeta(Figura 5D).
9. Una vez que el gel de cianoacrilato se haya endurecido por completo, afloje suavemente el soporte de la cánula y eleve hasta que esté libre de la virola de fibra óptica.
10. Repita los pasos 8.5–8.9 para la coordenada en ángulo contralateral y, a continuación, nivele la cabeza. Para mayor seguridad, haga una conexión adicional entre las dos cánulas de fibra óptica en ángulo con el gel de cianoacrilato y el acelerador(Figura 5D).
11. Prepare una cantidad pequeña y relativamente delgada de cemento dental. Aplicar sobre la superficie del cráneo, asegurándose de cubrir bien los tornillos de anclaje y la base de las cánulas de fibra óptica. Deje suficiente de la virola limpia para el posterior acoplamiento con los cables de conexión de fibra óptica.
12. Una vez que el cemento se haya completado en seco, retire el ratón del aparato estereotáctico.
13. Coloque el ratón en una jaula de recuperación con soporte térmico. Permita que se recupere y transfiera a la jaula del hogar una vez que aparezca alerta, móvil y se esté arreglando.

9. Atención postquirúrgica

1. Monitoree a los animales diariamente durante 3 días después de la operación para el comportamiento, la postura, la actividad y el aseo, y mantenga registros de la ingesta de alimentos y el peso corporal.
2. Si los animales exhiben algún indicador general de dolor o mala salud, consulte con los servicios veterinarios.
3. Permita que los ratones al menos 2 semanas para la recuperación y para la expresión viral antes de comenzar los estudios de comportamiento.

10. Optogenética

1. Para la realización de estudios optogenéticos, consulte Sidor et al.⁸.
2. Validar la expresión viral y la colocación de fibra al finalizar los estudios.

Resultados

Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para la realización de estudios optogenéticos para interrogar el papel de las neuronas VMN hipotalámicas en el control glucémico⁹. El primero utilizado fue un enfoque estereotáctico estándar (no en ángulo) para la microinyección bilateral de un virus inhibidor de la canalropsina al VMN. Si bien un enfoque en ángulo también sería adecuado, se seleccionó el enfoque estándar (no en ángulo) porque es suficiente para apuntar a la región cerebral de in...

Discusión

Los avances recientes en neurociencia han apoyado la comprensión y la comprensión avanzadas de la actividad y la función de los neurocircuitos cerebrales. Esto incluye la aplicación de tecnologías optogenéticas y quimiogenéticas para activar o silenciar poblaciones neuronales discretas y sus sitios de proyección in vivo. Más recientemente, esto ha incluido el desarrollo de indicadores de calcio codificados genéticamente (por ejemplo, GCaMP, RCaMP) y otros biosensores fluorométricos (por ejemplo, dopamina, norepinefrina) ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cánulas de fibra óptica	Lentes dóricas	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Sistema
alineación estereotáxica Kopf modelo 1900	Kopf	modelo 1900 Kopf modelo 1900-51
altura central	Kopf	modelo 1900-51
Kopf modelo 1905 indicador de alineación	Kopf	modelo 1905
taladro estereotáxico Kopf modelo 1911	Kopf	Modelo 1911
Kopf Modelo 1915 Visor de centrado	Kopf	Modelo 1915
Kopf Modelo 1922 60 grados Barras de oreja sin rotura	Kopf	Modelo 1922 Kopf Modelo 1923-B
Ratón Soporte de cabeza de anestesia con gas	Kopf	Modelo 1923-B
Kopf Modelo 1940 Micro Manipulador	Kopf	Modelo 1940
Micro4 Sistema de microinyección	World Precision Instruments	--
Tornillos de hueso de ratón	Plásticos Uno	00-96 X 1/16
Soporte de cánula estereotáxica, férula de 1,25 mm	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill