Summary
我们描述了一种使用高频回声心动图评估成年斑马鱼心脏形态和功能的协议。该方法允许心脏可视化和随后定量功能参数，如心率 （HR）、心脏输出 （CO）、小数面积变化 （FAC）、弹出分数 （EF） 以及血液流入和流出速度。
Abstract
斑马鱼（Danio rerio）已成为心血管研究中非常受欢迎的模型有机体，包括人类心脏病，这主要是因为它的胚胎透明度、遗传性和快速、高通量研究的便利性。然而，透明度的丧失限制了成人阶段的心脏功能分析，这使得与年龄相关的心脏病的建模复杂化。为了克服这些限制，斑马鱼的高频超声超声心动图正在成为一个可行的选择。在这里，我们提出了一个详细的协议，通过非侵入性超声心动图，使用高频超声来评估成年斑马鱼的心脏功能。该方法允许对斑马鱼的心脏尺寸进行可视化和分析，并量化重要的功能参数，包括心率、中风体积、心脏输出和弹出分数。在这种方法中，鱼被麻醉并保存在水下，手术后可以回收。虽然高频超声是一种昂贵的技术，但相同的成像平台可以通过调整不同的传感器来用于不同的物种（例如，鼠类和斑马鱼）。斑马鱼回声心动图是心脏排便的有力方法，可用于疾病模型，特别是晚期疾病的验证和表征;毒品屏幕;和心脏损伤，恢复和再生能力的研究。
Introduction
斑马鱼（Danio rerio）是研究发育过程和人类疾病的成熟脊椎动物模型1。斑马鱼在胚胎发育过程中具有与人类（70%）的遗传相似性（70%）、遗传可感染性、高繁殖性和光学透明度，允许对器官和组织（包括心脏）进行直接视觉分析。尽管只有一个中庭和一个心室，斑马鱼的心脏（图1）在生理上类似于哺乳动物的四室心脏。重要的是，斑马鱼的心率、心电图形态和动作潜能形状比人类比鼠种更像2。这些特点使斑马鱼成为心血管研究的优秀模型，为心脏发育33、4、4再生5和病理状况11、3、43,4提供了重要见解，包括动脉硬化、心肌病、心律失常、先天性心脏病和淀粉样蛋白光链心肌毒性1,1、4、6。,6通过高速视频显微镜77、88的直接视频分析，在胚胎阶段（受精后1天）可以评估心脏功能。然而，斑马鱼在胚胎阶段后失去透明度，限制了正常成熟心脏和晚发心脏状况的功能评估。为了克服这一限制，Echocardiix被成功地用作高分辨率、实时、非侵入性成像的替代品，以评估成年斑马鱼的心脏功能9,109、10、11、12、13、14、15。,11,12,13,14,15
在斑马鱼中，心脏位于胸腔中，紧接在刺的后部，中庭位于心室的背对背。中庭从窦静脉吸血中收集静脉血，并将其转移到心室，在那里进一步泵送至球状动脉（图1）。在这里，我们描述了一种生理、水下、协议，通过非侵入性超声心动图评估成年斑马鱼的心脏功能，使用中心频率为50 MHz的线性阵列超声探头，以30μm的分辨率进行B模式成像。由于超声波很容易在水中传播，因此在鱼和水下扫描探头之间保持接近，为心脏检测提供足够的接触面，无需超声波凝胶，而且对鱼的总体压力较小。虽然一些作者9、12、1312,13报告了替代斑马鱼超声心动系统，但在这里我们介绍了适用于动物高频超声的通用和最常用的设置。
该方法允许对成年斑马鱼心脏进行高分辨率成像，追踪心脏结构，并从多普勒血流测量中量化峰值速度。我们在体内显示重要的收缩和舒张参数的可靠定量，如弹出分数 （EF）、小数区域变化 （FAC）、心室血液流入和流出速度、心率 （HR） 和心脏输出 （CO）。我们帮助建立一个可靠的正常健康成年斑马鱼心脏功能和尺寸参数的范围，以便更精确地评估病理状态。总体而言，我们为评估斑马鱼的心脏功能提供了一种可靠的方法，在建立和验证斑马鱼心脏病模型66、16、16心脏损伤和恢复10、13,13和再生11、12,12中非常有用，并可用于进一步评估潜在的药物。
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Protocol
涉及斑马鱼的所有程序均得到我们的机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国农业部动物福利法。
1. 实验设置
-
设置图像采集平台
- 使用小剪刀或手术刀在12点钟位置的海绵上切开，在扫描过程中握住鱼。将海绵放入玻璃容器中（图2A）。
注：切口的位置应留出足够的空间来移动传感器，并在平台倾斜进行扫描时保持鱼波纹管水线（图2）。切口可能因鱼的大小而异;但是，对于标准尺寸和重量，切口应约为 2.5 厘米 x 0.7 厘米 x 0.5 厘米（长度、宽度和深度分别为 0.5 厘米）。玻璃容器应至少 6 厘米深，以避免在成像鱼时漏水。 - 例如，使用双面胶带，将装有海绵的玻璃盒固定在超声波平台上。确保玻璃盒位于平台中心并牢固连接（图 2B）。
- 使用平台支架左侧的旋钮向前倾斜约 30° 平台（图 2B）。在玻璃方块中填充含有0.2毫克/mL三甲烷磺酸（MS222）的200-250 mL鱼系统水。
注：三甲苯可制备为Tris 40 mM pH 7中的4mg/mL库存溶液，并进一步稀释至鱼系水中所需的浓度;0.2毫克/米拉被发现是最佳浓度16。4mg/mL 三叶素库存溶液可在-20°C或4°C下长期储存一个月。 - 将传感器插入工作轨站的微操纵器支架内，将传感器的切口转向操作员。使阵列与地面平行，与工作侧相对于舞台保持纵向（参见图 2 Figure 2B）。留出足够的空间（两侧 10 厘米），以便现在连接的传感器导轨系统沿着 x 轴和 y 轴移动。
- 登录到控制软件，并选择鼠标（小）血管。为研究中包含的每一只动物创建一个新的研究以及一个新的系列。查找位于浏览器页面上屏幕左下角的新算例按钮（视图以 B 模式开始）。
- 使用小剪刀或手术刀在12点钟位置的海绵上切开，在扫描过程中握住鱼。将海绵放入玻璃容器中（图2A）。
2. 处理鱼
注：本研究中使用的斑马鱼为成年，11个月大的野生型菌株AB/Tuebingen（AB/TU）的雄性。斑马鱼在28°C的单独流水族系统中保持，其恒定光周期设置为14小时光/10小时黑暗。斑马鱼每天用盐水虾（阿米亚纳普利）和干食物片喂食两次。
- 使用鱼网，将鱼转移到含有0.2毫克/mL三环水系统水的小水箱中。等待，直到鱼完全麻醉（没有运动和没有反应触摸）。
- 使用塑料茶匙，轻轻地快速将鱼转移到装有海绵的玻璃盒中，放入以前制作的切口中，鱼的腹侧朝上。
注： 确保鱼头定位向操作员（与传感器的切口相同），并且与身体其他部分相比，其水平略高，以实现更好的心脏可视化。 - 使用导轨系统上的手柄轻轻降低传感器（保持其原始位置），将其纵向放置并靠近鱼的侧，传感器的切口面向操作员。离开鱼的2-3毫米（不超过1厘米）的间隙。使用所有 3 个轴中的微操纵器调整传感器的平台，直到鱼心可视化，然后开始图像采集。在整个图像采集过程中，传感器的角度不应更改（图2C）。
注：只要有足够的接近（高达1厘米），鱼的顶部的水将通过液体表面张力提供接触面，允许在探头和鱼之间传输超声波波。因此，没有必要将传感器推到鱼上。尝试完成此步骤，并在不到 3 分钟内完成扫描，以防止在图像采集期间鱼死亡或心率降低。如果需要，请使用计时器。心脏可以在屏幕的上半侧找到，朝向眼睛的左侧，如果将 x 轴一直向右移动，则可以轻松可视化。如果在 B 模式下继续难以找到心脏，请切换到彩色多普勒模式，该模式允许跟踪血流（红色表示血液流向操作员）并定位心脏。
3. 图像采集
注：有关成像系统和图像分析软件，请参阅材料表。
- 纵向视图 B 模式
- 本地化心脏后，选择或停留在 B-Mode 中（在启动新系列后位于触摸屏左下角），并缩小字段以放大并仔细查看心脏，以便在分析期间更轻松地进行跟踪。
- 为了在B-Mode图像采集中更清晰地观察心脏，通过放大来减少现场。使用触摸屏手动缩小 x 轴和 y 轴上的字段。
- 如果需要，通过将动态范围设置为 45-50 dB 来增强图像的质量/对比度。转到"更多控件"选项中的 B 模式控件，然后将更改保存到模式预设。点击"模式预设"，每次开始拍摄新系列之前，选择优化的图像采集设置。
- 通过选择"保存图像"，在长轴平面上拍摄所需的图像。
注： 有关图像采集的更多详细信息和培训资源，请访问https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab和https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- 纵向视图脉冲波
- 切换到彩色多普勒进行血流检测（选择颜色按钮）和采集（在启动新系列后位于触摸屏左下角）。
- 使用触摸屏将象限放置在心形阀顶部，并本地化流入，红色信号将区分（图 3A）。尽可能减小象限面积以提高帧速率。
注：降低颜色脉冲重复频率（颜色 PRF）（速度范围），以确保在彩色多普勒图像的速度轮廓中可以看到黄色。这将增加可以看到的速度范围，并有助于创建一个镶嵌的颜色，将允许更清楚地可视化的峰值速度。 - 激活脉冲波 （选择PW） 多普勒模式以采样心室血液流入速度。将样品体积门定位在三角阀的中心（红色信号变黄）以检测最大流速。用手指调整屏幕上的 PW 角度，使其与血液流入的方向对齐。按开始或更新，开始采样流入心室的血液速度。
注：确保角度正确线与血流平行，以便提供一致且可重现的结果。放置正确的角度线，使其与血流方向相匹配，将确保准确捕获速度。 - 重复步骤 3.2.3，通过将彩色多普勒象限放置在心室和球形（球形阀）之间的交界处，并本地化流量，从而确定流出速度（图 3B）。将样品体积门放在心室-球形结前，并调整角度校正线以匹配血流方向。
注：如前所述，要达到精确的速度值，请确保 PW 角度与血流对齐。 - 调整基线（条），在流速面板中降低或提升基线，以便完全检测和跟踪信号峰值（图3C，D）。识别上部/正象限中的流入峰值（向探头方向的信号）和下/负象限（信号离开探头）中的流出峰值。
4. 鱼类恢复
- 一旦图像采集完成，使用茶匙，将鱼转移到常规系统无三环水加气水，让鱼恢复（通常需要30秒到2分钟恢复刺运动和游泳）。
- 为了帮助恢复，使用转移移液器反复喷水在刺上，以促进水和氧气输送的曝气。
5. 图像分析
- 打开图像分析软件。
- 选择图像并单击图像处理图标（图 4）。使用可用的比例（图4），调整图像的亮度和对比度，以便清晰地可视化心室墙壁或血流模式。
- 使用 B 模式图像，从心脏包/测量上的 PSLAX（准长轴）选项打开下拉列表（图 4）。选择LV 跟踪并跟踪 systole 和 diastole 处的心室内壁，以获得 systole （VA） 和分管 （VAd）、端舒张体积 （EDV） 和端收缩体积 （ESV） （图 5A，B） 中的心室区域 （VA）。
注： 体积值从 2D 图像跟踪外推，可能会偏离 3D 实体。对于所有测量，平均每个动物至少有3个具有代表性的心脏周期。 - 请注意软件将自动计算和显示的笔画体积和弹出分数。
注： 笔画体积和弹出分数也可以使用公式手动计算
SV = EDV-ESV
EF = （EDV-ESV）/EDV
其中 SV 是冲程体积，EDV 为端舒张体积，ESV 为端收缩体积，EF 是弹出分数 - 使用公式计算小数面积变化
FAC = （VAd - VA）/ VAd
其中FAC是小分区域变化，VAd是心室区域，在硅藻区，而VA是硅室的心室区域。 - 使用公式计算心脏输出
CO = HR x SV
其中CO是心脏输出，HR是心率，SV是中风体积 - 使用脉冲波多普勒模式图像，通过选择心脏包下的MV Flow选项来测量流入血速（图 4）。分别选择E或A进行早期分段和晚期数据，并确定图形上的峰值速度（图 3C）。
- 通过选择AoV 流来测量流出的血液速度，并确定跟踪上的峰值（图 3D）。
- 使用 2 种不同的方法测量心率，以便进行更可靠的评估：
- 当在图像采集过程中在屏幕上可视化心脏时，在 10 秒内计数节拍，并将其乘以 6。
- 使用 Vevo LAB 软件上的脉冲波多普勒图像，选择心率按钮和 3 个连续主动脉流峰值之间的跟踪间隔（图 4和图 6）。
- 要在跟踪 LV 和血流高峰后将数据导出到电子表格，请单击报表 = 导出 = 保存为 Excel。
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Representative Results
所述协议允许测量重要的心电图和功能参数，类似于人类和动物回声心动图中使用的技术。B-Mode 图像允许跟踪心室内壁（图 5），并获取尺寸数据（如室和壁尺寸）和功能数据（如心率、冲程体积和心脏输出）以及心室收缩函数的参数，如小数面积变化和弹出分数（表 1）。使用彩色多普勒模式图像在心室瓣的测量也提供心室流入和流出的血液速度（分别血液填充和流出心室的速度）（图3和表1）。
本研究获得的参数与以往研究报告的类似实验条件66、16、17（16,17表1）的参数相当，进一步证明了该方法的可重复性。总体而言，我们发现，使用这种详细的协议可以有效和一致地评估斑马鱼的心脏功能，这在研究期间比较不同的心脏表型至关重要。
图1：成年斑马鱼心脏的插图。血流循环由箭头表示：血液从窦静脉曲窦流向心室，并进一步转移到心室，在那里被泵送到球状动脉。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：鱼成像室。（A） 为了准备一个鱼成像的"腔室"，在垂直方向上用切口朝一端的海绵放置在玻璃容器中。（B） 玻璃容器随后被牢固地贴在倾斜的成像平台上。（C） 传感器安装在操纵器上，并放置在与切口平行的位置，以实现正确的成像定位（传感器切口指向操作员）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：彩色多普勒模式和相应的脉冲波多普勒的三角流入（A）和流出（B），以评估各自心室舒张波峰（C）和心室流出（D）的速度。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：图像分析。在图像处理（为了达到图像所需的对比度和亮度）后，可以在 PW 多普勒模式（左）和 B 模式（右）图像中执行测量。要跟踪 B 模式图像中的 LV 墙，请从下拉菜单中选择"心脏包"，转到PSLAX，然后选择LV 跟踪。要测量 PW 多普勒模式图像中的峰值速度，请从下拉菜单中选择心脏包。要测量心室血液流入速度，请选择MV Flow选项，并分别选择E或A进行早期分管和晚期分管。要确定流出的血液速度，请选择AoV 流量和AV 峰值速度。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 5：B 模式图像。（A） 心室 （V） 的 B 模式图像，里面充满了来自中庭 （A） 的血液。（B） systole 中心室的 B 模式图像，通过球茎动脉（B，绿色追踪）喷射血液。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 6：脉冲波多普勒图像。通过跟踪 3 个连续主动脉流峰值，可以生成心率值。主动脉流峰值可以通过在分析软件中的测量选项卡中选择心率按钮来显示。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 参数，单位 = sd | 本研究 | 王， L. 等人， 2017;Lee， L.等人， 2016 & Mishra， S. 等人， 2019 | 评论/描述 |
| 心率 （HR），bpm | 133 × 7 | 118 × 14 - 162 × 32 | 野生型AB/ABTU男性和女性在3-12个月麻醉三环0.2毫克/mL |
| 分数面积变化 （FAC） | 0.38 × 0.03 | 0.29 ± 0.07 - 0.39 ± 0.05 | |
| 弹出分数 （EF）， [%] | 42 × 7 | 34 × 0.04 - 48 × 0.03 | |
| 冲程体积 （SV）， μL | 0.21 ± 0.01 | 0.18 × 0.06 - 0.28 ± 0.08 | |
| 心脏输出 （CO）， μL 最小-1 | 27.3 × 1.69 | 19 × 9.5 - 36.1 × 7.8 | |
| E 峰值速度（早期心室流入），mm/s | 30 × 6.8 | 25 × 7 - 51 × 16 | |
| 峰值速度（心室流入晚期），mm/s | 152 × 32 | 144 × 36 - 288 × 54 | |
| 心室流出，毫米/s | 86.6 × 19 | 不适用 |
表1：成年斑马鱼的回声心电图参数。在目前研究中评估的心脏功能参数的值为3至12个月的成年雄性或雌性斑马鱼，在0.2mg/mL三环溶液中麻醉。介绍了在类似条件下执行的相同参数66、16、1716,17中为相同参数获取的值范围，以便进行验证，并帮助标准化该方法。
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Discussion
描述了一种系统的方法，用于对成年斑马鱼进行心电成像和心脏功能评估。回声心动图是活成年鱼心脏成像和功能分析中唯一可用的非侵入性和最可靠的方法，在斑马鱼心血管研究中越来越受欢迎。所需时间很短，允许进行高通量和纵向研究。然而，所使用的方法和数据分析存在相当大的差异。当如此多的变量会影响即将到来的参数时，斑马鱼回声心动图的标准化是非常困难的。在进行实验研究时，应考虑可能产生变异性的条件，包括麻醉、体重、年龄、性别和背景拉伤。王L等人16日评估了这些因素带来的变异性，并汇编了斑马鱼心脏功能的现有数据，以帮助标准化该方法。他们的研究是设计涉及斑马鱼对声心动图评估的实验研究非常有用的资源。根据王、L等人16等提供的信息，以及本文中的参考资料和我们自己的观察6，我们概述了我们认为对协议优化和可重复性很重要的关键步骤和条件：
试样选择：先前的研究表明，虽然收缩函数参数（EF，FAC）不受性别差异显著影响，但6个月以上的女性，舒张功能（即峰值波E/A比率）可能要低得多。还观察到，心室区域和体积随着鱼龄（3个月及以上）显著增加，由于体重和体型较高，雌性明显增加。将舒张体积与身体质量指数（BMI）和身体表面积（BSA）索引有助于消除年龄匹配的雌性与男性之间的差异，而指数化为BSA和体重有助于克服与年龄相关的舒张体积差异16。也有报道，不同背景菌株的鱼之间的舒张功能16。总体而言，在选择实验设计时，建议使用年龄和应变匹配对照组，避免混合不同的性别。建议使用男性，因为质量在肉汁女性中较低。
扫描位置：在此设置中，可以有两个扫描位置：纵向轴和短轴。我们发现，在短轴模式下，很难识别心脏室。因此，我们只使用纵向轴，并建议后者在B模式中划定心脏室，并推导心室大小和功能。
麻醉：在测量过程中避免显著的心动过退，适当的镇水至关重要。心率会影响心脏功能测量，影响研究的准确性。三氯苯是最常见的麻醉剂，发现剂量为0.2mg/mL，以提供足够的镇定。然而，测量时间是至关重要的，因为心率在镇流16下3-4分钟后开始下降。为了避免引入可变性，将测量保持在 3 分钟以下至关重要。
关键参数：心率在追求一致性和准确性时可被视为关键参数。心率应在测试的实验组之间和所报告条件的值范围内进行比较。我们发现，118 × 14 至 162 × 32 bpm 的范围可以代表野生型斑马鱼 3-12 个月大的成人的正常值，用 0.2mg/mL 的三环麻醉不到 3 分钟。
结果准确性：为确保准确性，应测量至少3个心脏周期。为了获得更准确的手动图像跟踪，分析应以盲的方式进行。
除了选择最合适的条件外，几个方面对于确保精确测量至关重要。理想情况下，条件应尽可能接近正常的鱼类生理状态。在水下进行扫描具有使鱼保持自然环境和接近正常条件，气体交换，水组成，静水压力和温度的优点。与以前的研究相比，这些明显的优势，在扫描鱼被放置在湿海绵暴露在室内空气和电导率启用超声波凝胶，而不是水9,9，10。水下扫描还允许在手术后恢复鱼，前提是麻醉和恢复之间的时间保持在3分钟以下，并在测量后立即将鱼送回恢复水中。为确保尽可能快速有效地执行程序，建议在进行实验之前花费大量时间进行培训。
回声心动图是一种非常成熟的方法，用于评估临床实践以及鼠（或其他哺乳动物）动物模型中的心脏功能。然而，与人工或人类回声心动图不同，在水下进行鱼超声不允许将标本连接到电极。因此，无法直接测量心脏和呼吸速率。在这种情况下，心率可以通过在 10 或 15 分钟间隔内计算每分钟节拍或手动跟踪 3 个连续主动脉流峰值来测量（图6）。心率还影响其他参数（如心脏输出）的确定，这些参数必须通过心室内壁跟踪获得中风体积等参数后手动计算。另一个需要考虑的方面是，鱼的心脏形态与哺乳动物完全不同。在双室斑马鱼心脏，心室填充主要是由心房收缩决定的，与哺乳动物18相比，鱼的早到晚心室填充率通常要低得多。这解释了脉冲波多普勒在A和E峰斑马鱼和健康的哺乳动物心脏之间获得的不同轮廓。
回声心动图能够彻底描述鱼心形，并量化多种功能参数。弹射分数、小数面积变化、血液流入和流出速度、心率和心脏输出所得的值均在先前研究报告的范围内（表1），突出了该方法的可重复性。综合来看，我们的数据表明，高频超声超声心动图是一种可靠且可重复的方法，用于测量斑马鱼的心脏形态和功能，在评估疾病模型或药物测试时。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢弗雷德·罗伯茨的技术支持和对手稿的修订。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
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