Artículo de método

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

DOI:

10.3791/60989

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2 de abril de 2020

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1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

En este artículo

Resumen

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Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Resumen

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Se ha informado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas está relacionada con su plasticidad estructural. Para identificar la estructura morfológica de las neuronas piramidales y las espinas dendríticas, se puede utilizar una técnica de etiquetado balístico. En el protocolo actual, las neuronas piramidales se etiquetan con tinte DilC18(3) y se analizan utilizando un software de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. Para investigar la estructura neuronal, se realizan análisis de ramificación dendrítica y análisis de Sholl, lo que permite a los investigadores extraer inferencias sobre la complejidad de las ramificaciones dendríticas y la complejidad del árbol neuronal, respectivamente. La evaluación de las espinas dendríticas se lleva a cabo utilizando un algoritmo de clasificación asistida automática integral para el software de reconstrucción, que clasifica las espinas en cuatro categorías (es decir, delgada, hongo, rechoncho, filopodia). Además, también se eligen otros tres parámetros (es decir, longitud, diámetro de la cabeza y volumen) para evaluar alteraciones en la morfología dendrítica de la columna vertebral. Para validar el potencial de la amplia aplicación de la técnica de etiquetado balístico, las neuronas piramidales del cultivo celular in vitro fueron etiquetadas con éxito. En general, el método de etiquetado balístico es único y útil para visualizar las neuronas en diferentes regiones cerebrales en ratas, lo que en combinación con un sofisticado software de reconstrucción, permite a los investigadores dilucidar los posibles mecanismos subyacentes disfunción neurocognitiva.

Introducción

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En 2000, Gan y otros describieron una técnica de etiquetado rápido para neuronas individuales y glia en el sistema nervioso que combinaba varios colorantes lipofílicos, permitiendo el etiquetado simultáneo de muchas células cerebrales con diferentes colores1,,2. Más recientemente, una técnica de etiquetado balístico fue descrita por Seabold et al.3 que introdujo colorantes fluorescentes (Dil) en las neuronas de las rebanadas cerebrales. Una técnica de tinción versátil, el etiquetado balístico es apreciado por su capacidad para ser utilizado en múltiples especies animales y a través de u....

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Protocolo

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Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028).

1. Preparación de tubos de cuentas DiI/Tungsteno

  1. Disolver 100 mg de polivinilpirrolidona (PVP) con 10 ml de ddH2O. Vortex la solución de PVP ligeramente.
  2. Llene el tubo con la solución PVP (ver Tabla de Materiales)y déjelo durante 20 minutos. A continuación, expulse la solución de PVP a través del otro extremo del tubo utilizando una jeringa de 10 ml.
  3. Combinar 170 mg de perlas de microportadora de tungst....

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Resultados

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En la Figura 2A,las neuronas piramidales típicas en la región del hipocampo en las secciones del cerebro de la rata fueron identificadas por la tecnología de etiquetado balístico, caracterizada por una gran dendrita apical y varias dendritas basales más pequeñas alrededor del soma. La Figura 2B muestra la neurona en el software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal después de que se detectó el soma, se trazaron ramas dendríticas y se detectaron esp.......

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Discusión

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En este protocolo, describimos una técnica de etiquetado versátil para las neuronas tanto del cerebro de rata como de las cultivadas in vitro. Además, informamos de la metodología para la utilización de software de reconstrucción neuronal y software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. La evaluación de la morfología neuronal y las espinas dendríticas ofrece una oportunidad para determinar alteraciones en la complejidad de las ramificaciones den.......

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Divulgaciones

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Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones DE NIH HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
20Gx25mm Aguja PrecisionGlideBD 305175
placa de cultivo celular de 24 pocillosCostar3562
35 mm Platos con fondo de vidrioMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
Solución antibiótica-antimicóticaCellgro30004CI100X
B-27 suplementoLife Technologies17504-04450X
Camisa de barrilBIO-RAD165-2417
BóraxSigmaB9876
Ácido bóricoSigmaB0252
Soporte de cartuchoBIO-RAD165-2426
Software de imagen confocalNikonEZ-C1versión 3.81b
Microscopio confocalNikonTE-2000E
Cubierta vidrioVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 medioLife Technologies10565-018
Dumont #5 PinzasWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 PinzasWorld Precision Instruments14097
F344 rat(Harlan Laboratories, Indianápolis, IN)
GlucosaVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Pantallas de difusión HeliosBIO-RAD165-2475
Kit de pistola génica HeliosBIO-RAD165-2411
Sistema de pistola génica HeliosBIO-RAD165-2431
Conjunto de manguera de helioBIO-RAD165-2412
Pinzas de irisWorld Precision Instruments15914
Tijeras de irisWorld Precision Instruments500216 Cloruro
de metilenoFisher ScientificD150-1
Medio neurobasalLife Technologies21103-049
Neurolucida 360 softwarembf biosciencela columna dendrítica
ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehídoSigmaP6148
Poly-L-LysineSigmaP9155
PolivinilpirrolidonaFisher Scientific5295
ProLong Gold reactivo antidecoloraciónFisher ScientificP36930medio de montaje
Matriz de cerebro de rata, 300 - 600 g, coronal, 0,5 mmTed Pella15047
SevofluranoMerritt Veterinary Supply347075
Bicarbonato de sodioLife Technologies25080
SuperFrost Plus PortaobjetosFisher Scientific12-550-154%
Kitde jeringasBIO-RAD165-2421
Tubo de TefzelBIO-RAD165-2441
Tripsina-EDTALife Technologies15400-054
Cortador de tubosBIO-RAD165-2422
Estación de preparación de tubosBIO-RAD165-2418
Tungsteno M-25 Microcarrier 1.7 y micro; mBIO-RAD165-2269
Tijeras VannasWorld Precision Instruments500086
análisis de

Referencias

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  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W.

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Etiquetas

Espinas dendr ticasreconstrucci n neuronalan lisis de Shollmicroscop a confocalcolorante DilC18 3microesferas de tungsteno

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