Artículo de método

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

DOI:

10.3791/60989

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2 de abril de 2020

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha informado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas está relacionada con su plasticidad estructural. Para identificar la estructura morfológica de las neuronas piramidales y las espinas dendríticas, se puede utilizar una técnica de etiquetado balístico. En el protocolo actual, las neuronas piramidales se etiquetan con tinte DilC18(3) y se analizan utilizando un software de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. Para investigar la estructura neuronal, se realizan análisis de ramificación dendrítica y análisis de Sholl, lo que permite a los investigadores extraer inferencias sobre la complejidad de las ramificaciones dendríticas y la complejidad del árbol neuronal, respectivamente. La evaluación de las espinas dendríticas se lleva a cabo utilizando un algoritmo de clasificación asistida automática integral para el software de reconstrucción, que clasifica las espinas en cuatro categorías (es decir, delgada, hongo, rechoncho, filopodia). Además, también se eligen otros tres parámetros (es decir, longitud, diámetro de la cabeza y volumen) para evaluar alteraciones en la morfología dendrítica de la columna vertebral. Para validar el potencial de la amplia aplicación de la técnica de etiquetado balístico, las neuronas piramidales del cultivo celular in vitro fueron etiquetadas con éxito. En general, el método de etiquetado balístico es único y útil para visualizar las neuronas en diferentes regiones cerebrales en ratas, lo que en combinación con un sofisticado software de reconstrucción, permite a los investigadores dilucidar los posibles mecanismos subyacentes disfunción neurocognitiva.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En 2000, Gan y otros describieron una técnica de etiquetado rápido para neuronas individuales y glia en el sistema nervioso que combinaba varios colorantes lipofílicos, permitiendo el etiquetado simultáneo de muchas células cerebrales con diferentes colores1,,2. Más recientemente, una técnica de etiquetado balístico fue descrita por Seabold et al.3 que introdujo colorantes fluorescentes (Dil) en las neuronas de las rebanadas cerebrales. Una técnica de tinción versátil, el etiquetado balístico es apreciado por su capacidad para ser utilizado en múltiples especies animales y a través de una amplia gama de edades. Además, se puede combinar con inmunostaining para identificar subpoblaciones de células cerebrales3. En comparación con las técnicas tradicionales (por ejemplo, imperraje de plata Golgi-Cox, microinyección)4, el etiquetado balístico ofrece la oportunidad de distinguir más claramente las características morfológicas, incluidas las espinas dendríticas, una característica que es fundamental para extraer inferencias sobre la complejidad neuronal y la conectividad sináptica5.

Las neuronas piramidales excitatorias se caracterizan por una sola dendrita apical grande, múltiples dendritas basales más cortas y miles de espinas dendríticas6. Las neuronas piramidales se encuentran en múltiples regiones cerebrales relacionadas con el procesamiento cognitivo de orden superior, incluyendo la corteza prefrontal (PFC) y el hipocampo. En el PFC, las neuronas piramidales se observan en las capas II/III y V, con cada una de ellas una morfología única. Específicamente, las neuronas piramidales en la capa II/III de la PFC tienen una dendrita apical más corta y menos ramificación que las neuronas piramidales en la capa V6. Dentro del hipocampo, las neuronas piramidales se encuentran en las regiones CA1 y CA3, con cada una mostrando morfologías distintas. Específicamente, las neuronas piramidales en la región CA1 exhiben una dendrita apical más distintiva, con ramificaciones que ocurren más lejos del soma, en relación con la regiónCA3 6.

Las espinas dendríticas en las neuronas piramidales tanto en el PFC como en el hipocampo son el sitio principal de las sinapsis excitatorias7. Las características morfológicas de las espinas dendríticas, que se caracterizan clásicamente en tres categorías primarias (es decir, delgadas, rechonchas o setas8),se han relacionado con el tamaño de la sinapsis excitatoria9. Las espinas delgadas, caracterizadas por un cuello largo y delgado, una cabeza bulbosa pequeña y densidades postsinápticas más pequeñas, son más inestables y desarrollan conexiones más débiles. Sin embargo, las espinas de setas, que tienen una cabeza de la columna vertebral dendrítica más grande, son reconocidas por formar conexiones sinápticas más fuertes, un efecto resultante de su mayor tamaño. En contraste agudo, las espinas rechonchas están desprovistas de un cuello de columna vertebral, exhibiendo una relación de volumen de cabeza y cuello aproximadamente igual8. Dentro del hipocampo, también se pueden observar espinas ramificadas, por lo que la columna vertebral tiene múltiples cabezas que emergen del mismo cuello dela dorsal dendrítico10. Por lo tanto, los cambios morfológicos de las espinas dendríticas podrían reflejar la funcionalidad y la capacidad estructural. Además, los estudios han demostrado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas se relaciona con su plasticidad estructural, lo que lleva a la idea de que las espinas pequeñas están involucradas en el aprendizaje y la atención, mientras que las espinas más grandes y estables, están involucradas en procesos a largo plazo, incluida la memoria11. Además, la distribución de espinas dendríticas a lo largo de la dendrita puede estar asociada con la conectividad sináptica5,12.

Por lo tanto, el presente documento metodológico tiene tres objetivos: 1) Presentar nuestro protocolo de etiquetado balístico, que ha sido utilizado con una tasa de éxito (es decir, neuronas que cumplen con los criterios de selección y apropiado para el análisis) de 83,3%5,12,13 y en múltiples regiones cerebrales (es decir, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demostrar la generalización de la técnica y su aplicación a las neuronas cultivadas in vitro; 3) Detallar la metodología utilizada en el software de reconstrucción neuronal y las inferencias que se pueden extraer de dichos datos.

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Protocolo

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Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028).

1. Preparación de tubos de cuentas DiI/Tungsteno

  1. Disolver 100 mg de polivinilpirrolidona (PVP) con 10 ml de ddH2O. Vortex la solución de PVP ligeramente.
  2. Llene el tubo con la solución PVP (ver Tabla de Materiales)y déjelo durante 20 minutos. A continuación, expulse la solución de PVP a través del otro extremo del tubo utilizando una jeringa de 10 ml.
  3. Combinar 170 mg de perlas de microportadora de tungsteno con 250 ml de cloruro de metileno. Vortex la suspensión de cuentas de tungsteno a fondo.
  4. Combinar 6 mg de tinte lipofílico DilC18(3) con 300 ml de cloruro de metileno. Vortex la solución de tinte DilC18(3) a fondo.
    NOTA: Realice los pasos 1.3–1.4 en una campana de humo.
  5. Pipetear 250 l de la suspensión de cuentas de tungsteno sobre un portaobjetos de vidrio. Espere a que la suspensión se seque al aire (3 min).
  6. Añadir 300 l de solución de tinte DilC18(3) en la parte superior de la capa de suspensión de cuentas de tungsteno. Mezcle bien la solución de tinte DiIC18(3) y la suspensión de cuentas de tungsteno con una punta de pipeta y deje que la mezcla se seque al aire (3 min).
  7. Una vez seca, usa una cuchilla de afeitar para dividir la mezcla en dos tubos centrífugos de 1,5 ml. Llene los tubos con agua.
  8. Sonicado en un baño de agua (Amp I, 100%) hasta que sea homogéneo (5 min). Asegúrese de que la punta del sonicador se encuentra directamente en los tubos con la suspensión del cordón.
  9. Combine los dos 1,5 ml de mezcla homogeneizada en un tubo cónico de 15 ml. Sonicar la mezcla durante otros 3 min.
  10. Dibuje la mezcla de colorante de cuentas de tungsteno-DilC18(3) en el tubo recubierto de PVP con una jeringa de 10 ml. Alimentar el tubo en la estación de preparación (ver Tabla de Materiales).
  11. Gire durante 1 min en la estación de preparación. Retire con cuidado toda el agua del tubo con una jeringa de 10 ml.
  12. Encienda el gas nitrógeno y ajuste el flujo de nitrógeno a aproximadamente 0,5 litros por minuto (LPM), gire el tubo en la estación de preparación y seque con nitrógeno durante 30 minutos.
  13. Retire el tubo de la estación de preparación y corte en longitudes de 13 mm (coincidiendo con el tamaño de carga del cartucho) utilizando una cortadora de tubos. Mantenga las longitudes de 13 mm en viales de centelleo en la oscuridad.

2. Preparación de secciones cerebrales

NOTA: Las ratas macho adultas F344/N fueron emparejadas alojados en un ambiente controlado bajo una luz 12/12: ciclo oscuro con acceso ad libitum a alimentos y agua. Todos los animales fueron atendidos utilizando las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

  1. Anestetiza profundamente a las ratas usando 5% de sevoflurano.
  2. Proceda al siguiente paso cuando las ratas no respondan a estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.
  3. Asegure la rata en una posición supina dentro de una campana de humo químico.
  4. Haga una incisión a través de la piel a lo largo de la línea media torácica. Separe el diafragma y abra el pecho con tijeras. Inserte una aguja de 20 G a 25 mm en el ventrículo izquierdo.
  5. Corte inmediatamente la aurícula derecha con tijeras. Perpeto 50 mL de 100 mM PBS con 5 mL/min de caudal. Perpeto 100 mL de 4% paraformaldehyde tamponado en 100 mM PBS.
  6. Retire todo el cerebro de la rata inmediatamente después de la perfusión.
  7. Postfijar todo el cerebro durante 10 min con 4% de paraformaldehído.
    NOTA: No postfixen en 4% paraformaldehído durante más de 30 min, ya que afectará al etiquetado.
  8. Cortar secciones coronales de 500 m de espesor utilizando una matriz cerebral de rata (ver Tabla de Materiales). Haga el primer corte y mantenga la hoja en su lugar. Haga un segundo corte usando una segunda cuchilla y retire verticalmente la primera cuchilla, manteniendo el tejido en la superficie de la hoja.
  9. Coloque las rodajas cerebrales en una placa de 24 pocillos con 1 ml de PBS de 100 mM en cada poca. Repita este proceso hasta que se hayan cortado todas las rebanadas.

3. Etiquetado balístico y visualización de secciones cerebrales

  1. Quite el PBS de cada pozo de destino.
  2. Cargue el cartucho con un trozo de tubo de cuentas DiI/Tungsteno y colóquelo en el aplicador.
  3. Coloque un trozo de papel de filtro entre dos pantallas de malla. Conecte el aplicador a la manguera de helio. Ajuste la presión de salida del helio a 90 libras por pulgada cuadrada (psi).
  4. Coloque el aplicador verticalmente a mano en el centro del pozo objetivo a una distancia de 1,5 cm entre la muestra y la pantalla de malla. Dispare el tubo de cuentas DiI/Tungsten.
    NOTA: Asegúrese de eliminar todo el PBS de los pozos objetivo antes de disparar.
  5. Cargue el cartucho con el siguiente tubo de cuentas DiI/Tungsten. Dispara continuamente las cuentas DiI/Tungsteno desde el tubo en las rodajas restantes.
  6. Llene la placa de 24 pocillos con 100 mM de PBS. Lavar con 500 ml de 100 mM frescos de PBS 3x. No deje que las rebanadas se volteen mientras se lava con PBS.
  7. Añadir 500 ml de PBS fresco de 100 mM y mantener las rodajas a 4 oC en la oscuridad durante 3 h.
  8. Transfiera las rebanadas cerebrales a diapositivas de vidrio usando un cepillo fino.
    NOTA: Se pueden transferir tres secciones cerebrales a cada diapositiva de vidrio.
  9. Añadir inmediatamente 1 ml de medio de montaje antidescolora en cada sección. Coloque un cubreobjetos de 22 mm x 50 mm sobre las secciones del cerebro. Seque los portaobjetos de vidrio en la oscuridad durante 2 días.
  10. Encienda el sistema de microscopio confocal y cambie a un objetivo de 60o.
  11. Ajuste el sistema de microscopio confocal para que tenga un aumento de 60o (A/1.4, aceite) y un intervalo de plano Z de 0,15 m (tamaño de agujero de 30 m, radio de agujero proyectado hacia atrás 167 nm). Utilice una longitud de onda de 543 nm para adquirir imágenes de las neuronas de interés.
  12. Obtener imágenes de la pila Z para el tipo de neurona objetivo basado en los límites de la región del cerebro y características morfológicas de las neuronas.
    NOTA: Adquiera al menos tres imágenes de cada animal.

4. Uso de la metodología con cultivo celular

  1. Aislar las neuronas corticales primarias de ratas F344/N en el primer día postnatal utilizando la metodología14previamente reportada.
  2. Cultivo de neuronas corticales primarias en un plato inferior de vidrio de 35 mm durante una semana. Cambiar la mitad del medio de cultivo con medio de crecimiento de neurona fresca al tercer día después del aislamiento. Lave el plato inferior de vidrio 2x con 1 mL de 100 mM PBS.
  3. Fijar con 4% paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Repita los pasos 3.2–3.6 para etiquetar las células de forma balística.
  4. Lavar con 1 mL de 100 mM PBS 3x. Añadir 500 ml de 100 mM frescos de PBS y mantenerlo a 4 oC en la oscuridad durante 3 h.
  5. Añadir 200 s de medio de montaje antidescolor.
  6. Obtener imágenes de pila Z para cada neurona objetivo utilizando los parámetros en el paso 3.10.

5. Análisis neuronal y cuantificación dendrítica de la columna vertebral

  1. Neuronas ciegas usando números de código para prevenir el sesgo del experimentador.
  2. Establecer criterios de selección para las neuronas en función de la región cerebral de interés.
    NOTA: Los criterios de selección para las neuronas incluyen tinción dendrítica continua, fondo bajo, sin grupos de tinte dentro de las células, difusión mínima del tinte DiI en el espacio extracelular, morfología correcta de las neuronas piramidales(Figura 1).
  3. Abra el software de reconstrucción neuronal (Consulte el vídeo adjunto 1).
  4. Cargue un archivo de imagen haciendo clic en la imagen"Carpetade archivos" en la esquina superior izquierda.
  5. Haga clic en "Soma" y marque el soma de las neuronas en la imagen.
  6. Haga clic en "Tree" y seleccione "User-Guided".
  7. Traza todas las ramas dendríticas de interés.
    NOTA: Para las neuronas piramidales, que se caracterizan por una dendrita apical y múltiples dendritas basilares, sólo se traza la dendrita apical. Asegúrese de que todas las ramas de conexión estén unidas entre sí.
  8. Haga clic en"Espina".
  9. Defina los parámetros de detección y haga clic en"Detectar todo".
    NOTA: Para las rebanadas cerebrales, los parámetros consistentes utilizados en todas las regiones cerebrales son: 2.0 (Rango exterior), 0.3 (Altura mínima), 100% (Sensibilidad del detector) y 10 (Recuento mínimo). Para el cultivo celular, es necesario aumentar la sensibilidad del detector y disminuir el recuento mínimo.
  10. Clasificar espinas seleccionando"Clasificar todo".
    NOTA: Las espinas dendríticas se clasifican utilizando un algoritmo integral del software de reconstrucción neuronal15.
  11. Guarde el seguimiento seleccionando la Imagen de disco en la esquina superior izquierda.
  12. Realizar análisis morfológicos neuronales y dendríticos de la columna vertebral.
    1. Software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal abierta (Ver vídeo adjunto 2).
    2. Cargue la imagen haciendo clic en"Archivo"y "Abrir archivode datos ".
    3. Haga clic en "Análisis" y"Análisis de estructura ramificada"para analizar la morfología neuronal y la morfología dendrítica de la columna vertebral.
    4. Para la morfología neuronal, haga clic en"Totalesde árbol" y seleccione la casilla para"Totales de dendrita".
    5. Para la morfología dendrítica de la columna vertebral, haga clic en"Espinas"y luego seleccione la casilla para"Detalles de la columna vertebral".
    6. Guarde la salida como un archivo de texto (.txt) haciendo clic con el botón derecho en la tabla de salida y seleccionando"Guardaren archivo".
    7. Haga clic en"Analizar"y "Análisis de gritos".
    8. Fije el Radio inicial a 10 m y el Incremento del radio a 10 m.
    9. Haga clic en el cuadro "Dendrites" y haga clic en "Mostrar".
    10. Guarde la salida como un archivo de texto (.txt) haciendo clic con el botón derecho en la tabla de salida y seleccionando"Guardaren archivo".

6. Análisis de datos

  1. Analizar los datos de morfología neuronal (es decir, complejidad de ramificación dendrítica).
    1. Agregue el número de dendritas en cada orden de bifurcación y divida por el número total de dendritas. Multiplique por 100 para calcular las frecuencias relativas para el número de dendritas en cada orden de bifurcación.
  2. Analice los datos del análisis de Sholl para examinar la complejidad del árbol neuronal y la conectividad dela dorsal dendrítica.
    1. Calcule la media y el error estándar de la media para el número de intersecciones en cada radio.
    2. Sume el número de espinas que dependen del tipo de columna vertebral (es decir, delgada, rechonchas, setas) en cada radio y divídalas por el número total de espinas para ese tipo de columna vertebral. Multiplique por 100 para calcular las frecuencias relativas para el número de espinas en cada radio.

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Resultados

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En la Figura 2A,las neuronas piramidales típicas en la región del hipocampo en las secciones del cerebro de la rata fueron identificadas por la tecnología de etiquetado balístico, caracterizada por una gran dendrita apical y varias dendritas basales más pequeñas alrededor del soma. La Figura 2B muestra la neurona en el software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal después de que se detectó el soma, se trazaron ramas dendríticas y se detectaron esp...

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Discusión

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En este protocolo, describimos una técnica de etiquetado versátil para las neuronas tanto del cerebro de rata como de las cultivadas in vitro. Además, informamos de la metodología para la utilización de software de reconstrucción neuronal y software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. La evaluación de la morfología neuronal y las espinas dendríticas ofrece una oportunidad para determinar alteraciones en la complejidad de las ramificaciones den...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por las subvenciones DE NIH HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
20Gx25mm Aguja PrecisionGlideBD 305175
placa de cultivo celular de 24 pocillosCostar3562
35 mm Platos con fondo de vidrioMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
Solución antibiótica-antimicóticaCellgro30004CI100X
B-27 suplementoLife Technologies17504-04450X
Camisa de barrilBIO-RAD165-2417
BóraxSigmaB9876
Ácido bóricoSigmaB0252
Soporte de cartuchoBIO-RAD165-2426
Software de imagen confocalNikonEZ-C1versión 3.81b
Microscopio confocalNikonTE-2000E
Cubierta vidrioVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 medioLife Technologies10565-018
Dumont #5 PinzasWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 PinzasWorld Precision Instruments14097
F344 rat(Harlan Laboratories, Indianápolis, IN)
GlucosaVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Pantallas de difusión HeliosBIO-RAD165-2475
Kit de pistola génica HeliosBIO-RAD165-2411
Sistema de pistola génica HeliosBIO-RAD165-2431
Conjunto de manguera de helioBIO-RAD165-2412
Pinzas de irisWorld Precision Instruments15914
Tijeras de irisWorld Precision Instruments500216 Cloruro
de metilenoFisher ScientificD150-1
Medio neurobasalLife Technologies21103-049
Neurolucida 360 softwarembf biosciencela columna dendrítica
ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehídoSigmaP6148
Poly-L-LysineSigmaP9155
PolivinilpirrolidonaFisher Scientific5295
ProLong Gold reactivo antidecoloraciónFisher ScientificP36930medio de montaje
Matriz de cerebro de rata, 300 - 600 g, coronal, 0,5 mmTed Pella15047
SevofluranoMerritt Veterinary Supply347075
Bicarbonato de sodioLife Technologies25080
SuperFrost Plus PortaobjetosFisher Scientific12-550-154%
Kitde jeringasBIO-RAD165-2421
Tubo de TefzelBIO-RAD165-2441
Tripsina-EDTALife Technologies15400-054
Cortador de tubosBIO-RAD165-2422
Estación de preparación de tubosBIO-RAD165-2418
Tungsteno M-25 Microcarrier 1.7 y micro; mBIO-RAD165-2269
Tijeras VannasWorld Precision Instruments500086
análisis de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
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