Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

Aditi Upadhye; Melissa Marshall; James  C. Garmey; Timothy  P. Bender; Coleen McNamara

doi:10.3791/61003

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Artículo de método

Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

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DOI:

10.3791/61003

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31 de mayo de 2020

Aditi Upadhye¹ , Melissa Marshall² , James C. Garmey² , Timothy P. Bender³ , Coleen McNamara²

¹Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, ²Cardiovascular Research Center, University of Virginia, ³Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.

Resumen

Como la función celular está influenciada por factores específicos de nicho en el microambiente celular, los métodos para diseccionar la localización y migración celular pueden proporcionar más información sobre la función celular. Las células B-1a son un subconjunto único de células B en ratones que producen anticuerpos IgM naturales protectores contra epítopos específicos de oxidación que surgen durante la salud y la enfermedad. La producción de IgM de célula b-1a difiere dependiendo de la ubicación de la célula B-1a, y por lo tanto se vuelve útil desde un punto de vista terapéutico para apuntar a la localización B-1a a nichos que apoyan la alta producción de anticuerpos. Aquí describimos un método para apuntar a la migración celular B-1a a la médula ósea mediante sobreexpresión mediada por retroviral del receptor de quimiocina 4 (CXCR4) del motivo C-X-C. La inducción génica en las células murinas primarias B puede ser difícil y normalmente produce bajas eficiencias de transfección de 10-20% dependiendo de la técnica. Aquí demostramos que la transducción retroviral de células murinas primarias B-1a da como resultado una eficiencia de transducción del 30-40%. Este método utiliza la transferencia de células adoptivas de células B-1a transducidas en ratones receptores con deficiencia de células B para que se pueda visualizar la migración y localización de células B-1a del donante. Este protocolo se puede modificar para otras construcciones retrovirales y se puede utilizar en diversos ensayos funcionales después de la transferencia adoptiva, incluyendo el análisis del fenotipo y la función de células de donantes o células huésped, o el análisis de factores solubles secretados después de la transferencia celular B-1a. El uso de ratones donantes y receptores distintos diferenciados por el alotipo CD45.1 y CD45.2 y la presencia de un reportero de GFP dentro del plásmido retroviral también podrían permitir la detección de células donantes en otros modelos de ratón inmunes y inmunes que contienen poblaciones de células B endógenas.

Introducción

Estudios recientes han demostrado células inmunitarias considerables, y específicamente células B, heterogeneidad fenotípica y funcional dependiendo de la localización celular¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Las células B-1a son una de esas poblaciones con capacidad heterogénea para producir anticuerpos IgM protectores; Las células B-1a de la médula ósea secretan IgM de forma constitutiva y contribuyen significativamente a los títulos de Plasma IgM^6,mientras que las células peritoneales B-1a tienen secrec....