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Artículo de método

Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

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DOI:

10.3791/61003

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31 de mayo de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.

Resumen

Como la función celular está influenciada por factores específicos de nicho en el microambiente celular, los métodos para diseccionar la localización y migración celular pueden proporcionar más información sobre la función celular. Las células B-1a son un subconjunto único de células B en ratones que producen anticuerpos IgM naturales protectores contra epítopos específicos de oxidación que surgen durante la salud y la enfermedad. La producción de IgM de célula b-1a difiere dependiendo de la ubicación de la célula B-1a, y por lo tanto se vuelve útil desde un punto de vista terapéutico para apuntar a la localización B-1a a nichos que apoyan la alta producción de anticuerpos. Aquí describimos un método para apuntar a la migración celular B-1a a la médula ósea mediante sobreexpresión mediada por retroviral del receptor de quimiocina 4 (CXCR4) del motivo C-X-C. La inducción génica en las células murinas primarias B puede ser difícil y normalmente produce bajas eficiencias de transfección de 10-20% dependiendo de la técnica. Aquí demostramos que la transducción retroviral de células murinas primarias B-1a da como resultado una eficiencia de transducción del 30-40%. Este método utiliza la transferencia de células adoptivas de células B-1a transducidas en ratones receptores con deficiencia de células B para que se pueda visualizar la migración y localización de células B-1a del donante. Este protocolo se puede modificar para otras construcciones retrovirales y se puede utilizar en diversos ensayos funcionales después de la transferencia adoptiva, incluyendo el análisis del fenotipo y la función de células de donantes o células huésped, o el análisis de factores solubles secretados después de la transferencia celular B-1a. El uso de ratones donantes y receptores distintos diferenciados por el alotipo CD45.1 y CD45.2 y la presencia de un reportero de GFP dentro del plásmido retroviral también podrían permitir la detección de células donantes en otros modelos de ratón inmunes y inmunes que contienen poblaciones de células B endógenas.

Introducción

Estudios recientes han demostrado células inmunitarias considerables, y específicamente células B, heterogeneidad fenotípica y funcional dependiendo de la localización celular1,2,3,4,5. Las células B-1a son una de esas poblaciones con capacidad heterogénea para producir anticuerpos IgM protectores; Las células B-1a de la médula ósea secretan IgM de forma constitutiva y contribuyen significativamente a los títulos de Plasma IgM6,mientras que las células peritoneales B-1a tienen secreción IgM de bajo nivel en homeostasis y en su lugar se pueden activar a través de receptores innatos similares a peajes (TLR) o señalización mediada con citoquinas para proliferar, migrar y secretar rápidamente IgM7,8,9,10. Los anticuerpos IgM de células B-1a reconocen epítopos específicos de la oxidación (OSE) que están presentes en patógenos, células apoptóticas y LDL oxidado, y la unión igM a OSE puede prevenir la señalización inflamatoria aguas abajo en enfermedades como la aterosclerosis11. Por lo tanto, las estrategias para aumentar la producción de IgM a través del aumento de la migración celular peritoneal B-1a a sitios como la médula ósea pueden ser terapéuticamente útiles. Sin embargo, es importante que tales estrategias sean dirigidas y específicas de tipo celular, ya que los efectos fuera del objetivo pueden afectar negativamente la función inmune o la salud.

Aquí describimos un método para la sobreexpresión dirigida y a largo plazo de CXCR4 en células B-1a murinas primarias y posterior transferencia adoptiva para visualizar la migración celular y la producción funcional de anticuerpos IgM (Figura 1). La manipulación genética de las células B primarias está limitada por una baja eficiencia de transfección en comparación con la transfección de líneas celulares transformadas. Sin embargo, como las líneas celulares transformadas pueden desviarse significativamente de las celdas primarias12,,13, es probable que el uso de células primarias proporcione resultados que se alineen más estrechamente con la fisiología normal. Se han descrito varias técnicas para la transferencia de genes en células B murinas primarias, incluyendo transducción retroviral, transducción adenoviral, lipofección o transfección basada en electroporación, que tienen diferentes niveles de eficiencia, transiencia e impacto en la salud celular13,,14,,15. El siguiente método utilizó la transducción retroviral, ya que produjo una eficiencia adecuada de transferencia de genes de >30%, mientras que afectaba mínimamente a la viabilidad celular. El retrovirus expresivo de CXCR4 se generó utilizando la proteína fluorescente verde verde de entrada de células madre murinas de construcción retroviral anteriormente descrita anteriormente (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, en el que el gen del ratón CXCR4 fue sub-clonado4. Las partículas retrovirales MigR1 (control(Ctl)-GFP) y CXCR4-GFP se generaron utilizando la transfección de fosfato cálcico como se describe en los protocolos publicados anteriormente4,,14.

Las células B-1a transducidas con éxito se transfirieron por vía intravenosa a ratones Rag1-/- con deficiencia de linfocitos. Tanto los ratones donantes como los receptores contenían además la noción del gen Apolipoproteína E (ApoE), lo que resulta en una mayor acumulación de OSE y aterosclerosis, proporcionando así un modelo para la activación celular in vivo B-1 y la producción de IgM. Además, los ratones donantes y receptores diferían en el alostipo CD45; las células de donante B-1 provenían de ratones CD45.1+ ApoE-/- y se transfirieron a receptores Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-. Esto permitió la diferenciación del donante CD45.1 de las células CD45.2 B receptoras después de la transferencia sin la necesidad de manchar adicionalmente para los marcadores de células B durante el análisis de citometría de flujo. Los resultados proporcionados aquí demuestran que la sobreexpresión de CXCR4 dirigida en células B-1a se asocia con una mayor capacidad de las células B-1a para migrar a la médula ósea, que se asocia con el aumento del plasma anti-OSE IgM. Además, proporcionamos un método para el enriquecimiento de células B-1 peritoneales a través de la selección negativa y demostramos el requisito de activación de la célula B-1 para la transducción eficiente. Este método se puede adaptar para otras construcciones retrovirales para estudiar el efecto de la sobreexpresión de proteínas en la migración celular B-1a, fenotipo o función. Además, el uso de la distinción de alotipo CD45.1 frente a CD45.2 teóricamente podría permitir la transferencia a otros modelos murinos inmunes y suficientes que contengan células B endógenas.

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Protocolo

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia.

1. Separación magnética y enriquecimiento de células peritoneales B-1

  1. Eutanasia un ratón de 12 a 14 semanas, macho, CD45.1+ApoE-/- usando CO2.
  2. Haz un corte superficial en el abdomen usando tijeras quirúrgicas rectas y pela la piel usando tijeras curvas para exponer la pared peritoneal. Enjuague la cavidad peritoneal con 10 ml de 37 oC RPMI-1640 medio utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G. Agitar el ratón para desenganchar las células agarrando la cola y moviendo el ratón de lado a lado a fondo durante 15 x 20 s.
    NOTA: Masajear el peritoneo lavado también puede maximizar la recuperación celular.
  3. Recoger el líquido peritoneal con una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G dibujando líquido en la parte inferior derecha del peritoneo justo por encima del nivel de la cadera, cerca de los intestinos. Evite interrumpir los depósitos epidimales de grasa y los órganos subyacentes. Evite extraer líquido del lado izquierdo del ratón, ya que la grasa omental se puede extraer fácilmente en la jeringa.
  4. Una vez que se recogen 6 x 7 ml de líquido, dispensar en un tubo cónico de 50 ml colocado sobre hielo. A continuación, eleve el ratón verticalmente sosteniendo la pared peritoneal por encima del diafragma utilizando fórceps para que cualquier líquido restante permanezca en la parte inferior de la cavidad peritoneal. Haga un pequeño corte en la pared peritoneal usando tijeras quirúrgicas por encima del hígado (asegúrese de no cortar el hígado) y recoja cualquier líquido peritoneal restante usando una pipeta de vidrio y una bombilla.
  5. Acopia de células de lavado peritoneal de todos los ratones CD45.1+ApoE-/- (n a 15-20) en tubos cónicos de 50 ml, y guárdelos en hielo.
    NOTA: Para calcular el número de ratones necesarios: Las células B-1a comprenden el 5-10% de la población peritoneal total y producen aproximadamente 2,5 x 5 x 105 células B-1a por ratón en las manos de los autores. La eficiencia de la transducción es de 30 a 40 %, como se muestra a continuación.
  6. Recuento de células vivas utilizando un tinte de viabilidad como el azul tripano y un hemocitoómetro (diluir muestras 1:5 en azul tripano y cargar 10 l en la cámara del hemocitociómetro). Células de grupo a hasta 1 x 108 células por tubo. Células centrífugas a 400 x g durante 5 min a 4 oC, luego aspirar sobrenadante.
  7. Resuspender hasta 1 x 108 células en 1 ml de anticuerpos anti-CD16/CD32 (Tabla de materiales) diluidos 1:50 en tampón de ensayo (1x solución salina tamponada de fosfato [PBS], albúmina sérica bovina 0,5% [BSA], 2 mM EDTA) para bloquear los receptores Fc. Escale según sea necesario en función del recuento de celdas. Incubar sobre hielo durante 10 min a 4oC.
  8. Preparar una mezcla maestra 2x de los anticuerpos biotinilados (Tabla 1) en el tampón del ensayo para el agotamiento. La mezcla maestra 2x explica el volumen del líquido en el que ya se encuentran las células al incubar con anti-CD16/CD32. Por ejemplo, si las células están incubando en 500 l de anti-CD16/CD32 diluido, a continuación, añada 500 l de 2x mezcla maestra que contenga 10 l de anticuerpos biotinilados Ter119, Gr-1, CD23 y NK1.1, y 25 l de anticuerpo F4/80 biotiniloado para alcanzar las concentraciones finales indicadas en la Tabla 1. Añadir 2x mezcla maestra a las células y manchar durante 20 minutos a 4 oC.
  9. Lavar las células con 5 ml de tampón de ensayo y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar sobrenadante.
  10. Resuspender e incubar células con microperlas antibiotinas (Tabla de materiales) diluidas en tampón de ensayo según la concentración y el protocolo recomendados por el fabricante.
  11. Lavar con 5 ml de tampón de ensayo y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4oC. Aspirar sobrenadante y resuspender hasta 1 x 108 células en 500 l de tampón de ensayo.
  12. Primeras columnas de selección magnética (Tabla de materiales) con 3 ml de tampón de ensayo. Transfiera las células a columnas de selección magnética cebada y recoja las eluyentes que contienen células B-1 enriquecidas en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo. Lave la columna de selección magnética con búfer de ensayo adicional hasta que el volumen total acumulado sea de 10 ml.
    NOTA: Una alícuota de las fracciones celulares pre purificadas y post-purificadas debe analizarse por separado mediante la citometría de flujo para la eficiencia de purificación mediante la tinción de células CD19+ B, macrófagos F480+ y células T CD5+ como se muestra en la Figura 2.
  13. Contar la fracción celular post-purificada (eluente que contiene células B-1 enriquecidas) contando las células vivas como en el paso 1.6, y resuspender a 1 x 106 células/ml en medio de cultivo celular B (RPMI-1640, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor [FBS], 10 mM HEPES, 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato sódico, 50 g/ml de gentamicina, 55 mM-merceptoetanol).

2. Estimulación celular de células B-1

  1. Dividir celdas agrupadas para las dos condiciones transducidas (Ctl-GFP y CXCR4-GFP), al tiempo que se apartan y enchacan al menos 10 x 106 celdas para un control no transducido.
  2. Placa de hasta 150 l (150.000 células) por pozo en placas de fondo redondo de 96 pocillos.
  3. Añadir 100 nM TLR9 agonista ODN1668 a todos los pozos para estimular la proliferación celular.
  4. Incubar durante 16-18 h a 37oC, 5% CO2.

3. Transducción retroviral de células B peritoneales

  1. Generar partículas retrovirales Ctl-GFP (MigR1) y CXCR4-GFP utilizando la transfección de fosfato cálcico como se describe en los protocolos publicados anteriormente14.
    NOTA: Esto tomará varios días, así que prepare y titer las existencias retrovirales y almacene alícuotas a -80 oC antes de iniciar este protocolo.
  2. Descongelar las existencias de retrovirus sobre hielo. Utilícelo inmediatamente y no vuelva a congelar, ya que el título de virus disminuye significativamente durante los ciclos de congelación y descongelación. Añadir sobrenadantes retrovirales Ctl-GFP o CXCR4-GFP a 20:1 multiplicidad de infección (MOI) a las células, en presencia de polibrena de 8 g/ml y fresco de mercaptoetanol a 55 m de concentración final. No añada existencias virales a las células reservadas para el control no transducido.
  3. Realizar la espinfección centrifugando las placas a 800 x g durante 90 min a temperatura ambiente.
  4. Incubar placas con retrovirus a 37oC, 5%coc 2 durante 3 h adicionales.
  5. Cosechar y replatear las células en medio de células B frescas e incubar a 37oC, 5% CO2 durante la noche.

4. Clasificación celular de células B-1a peritoneales transducidas

  1. Cosecha las células cultivadas y se agrupa en tres tubos cónicos separados de 50 ml para cada condición: no transducido, transducido por Ctl-GFP y transducido por CXCR4-GFP.
  2. Contar las células vivas como en el paso 1.6, luego centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar sobrenadante.
  3. Células resuspendidas a 100.000 células/L en el búfer de clasificación (PBS + 1% BSA) que contienen 1:50 anticuerpos anti-CD16/CD32 (Tabla de materiales) para bloquear los receptores Fc. Incubar sobre hielo durante 10 min a 4oC.
  4. Células Aliquot para controles de compensación (30.000 células por control de compensación): para controles de una sola mancha y alícuotas no mantenidas a partir de muestras no transducidas y para alícuotas de control de manchas únicas de GFP a partir de muestras transducidas.
    NOTA: Los cordones de compensación disponibles comercialmente se pueden utilizar alternativamente para controles de una sola mancha si el número de celda no transducido es bajo.
  5. Preparar una mezcla maestra de anticuerpos 2x que contenga los anticuerpos conjugados con fluoróforo en el tampón de clasificación (Tabla 1). Agregue 2x mezcla maestra a muestras no transducidas, transducidas por CTL-GFP y transducidas por CXCR4-GFP. Añada anticuerpos individuales a los controles de una sola mancha. Incubar durante 20 min a 4oC en la oscuridad.
    NOTA: La mezcla maestra 2x representa el volumen de líquido en el que ya se encuentran las células al incubar con anti-CD16/CD32, como en el paso 1.8. Una alícuota de células de cada condición se puede teñir por separado para CXCR4 para confirmar la sobreexpresión de CXCR4.
  6. Lavar las muestras con 1 ml de tampón de clasificación y colar a través de filtros de 70 m en tubos de polipropileno.
  7. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4oC y aspirar sobrenadante. Resuspender muestras a 50.000 células/L en el búfer de clasificación.
  8. Antes de la clasificación celular, prepare tubos de recolección de células activados por fluorescencia (FACS) con etiqueta que contengan 1 ml de medio de recogida (RPMI-1640, 20% de FBS inactivado por calor, 10 mM HEPES, 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato sódico, 50 g/ml de gentamicina, 55 m-mercaptoetanol) para cada población a clasificar.
  9. Antes de ejecutar muestras en el clasificador de celdas, agregue 2x DAPI (preparado como dilución 1:5000 en el búfer de ordenación) para la discriminación de células muertas.
  10. Ordene las células GFP+ B-1a en tubos FACS que contengan medios de recolección como muestras DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ de las muestras CTL-GFP y CXCR4-GFP. Utilice la muestra no transducente para establecer la puerta GFP+ y para ordenar las celdas DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ no transdéducidas B-1a.
    NOTA: Alternativamente, las células no transducidas también se pueden ordenar de las muestras CTL-GFP y CXCR4-GFP mediante el gating por separado de las celdas B-1a dentro de la fracción GFP-. Las células B-1b transducidas o no transducidas también se pueden ordenar utilizando esta estrategia de ordenación como DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- células.

5. Transferencia adoptiva

  1. Después de la clasificación celular, las células centrífugas a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar el sobrenadante cuidadosamente.
  2. Células resuspendidas en frío estéril 1x PBS a 1.000 células/L.
  3. Anestesiar macho Rag1-/- ApoE-/- ratones utilizando isoflurano e inyectar 100 l (100.000 células) por ratón a través de inyección intra-orbital o de vena de cola utilizando una jeringa de insulina ultrafina. Inyecte algunos ratones con 1x PBS como control.

6. Cuantificación de células donantes e IgM plasmática

  1. En el momento deseado de la transferencia post-adoptiva, analizar las células transferidas en ratones receptores por la médula ósea y la cosecha de tejido del bazo4 y la citometría de flujo. Cuantifique la localización de células de donantes y la sobreexpresión de CXCR4 tinndo para CD45.1, CD45.2 y CXCR4 y analice los resultados de la citometría de flujo utilizando un software como Flowjo.
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver los anticuerpos utilizados en este paso. Asegúrese de no utilizar un conjugado de anticuerpos que fluoresces en el canal FITC como GFP estará presente en las células de donantes transducidas.
  2. Aislar el plasma añadiendo 10 l de 0,5 M EDTA a la sangre entera recogida a través de una punción cardíaca en el momento del sacrificio animal. Centrifugar la sangre entera a 7.000 x g y aliquot plasma en tubos centrífugos separados de 1,5 ml. Conservar a -80 oC hasta realizar el análisis de factores secretados como IgM por ELISA4.

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Resultados

En la Figura 1se ofrece una visión general del protocolo. La Figura 2 muestra el enriquecimiento de las células peritoneales B-1a después del agotamiento magnético de otros tipos de células peritoneales. Las células individuales vivas en la fracción posterior al agotamiento tienen una mayor proporción de células CD19+ B en comparación con F4/80+ macrófagos, carecende cd5 hi CD19- células T, y contienen una mayor frecuencia de cél...

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Discusión

El método proporcionado aquí permite la administración estable y relativamente eficiente del gen celular B-1a primario, la transferencia adoptiva in vivo y la identificación y localización de las células inyectadas. Las células pudieron ser detectadas 17 semanas después de la transferencia celular y retenían el aumento de la expresión CXCR4. La entrega mediada por retrovirus produjo una eficiencia de transducción del 30-40% de las células B-1a murinas primarias con un impacto mínimo en la viabilidad celular en nuestras m...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Proyecto 3 de P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara), y R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye fue apoyado por la beca predoctoral American Heart Association 16PRE30300002 y 5T32AI007496-20. Agradecemos a Joanne Lannigan, Mike Solga y Claude Chew de la Universidad de Virginia Flow Cytometry Core por su excelente asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tapones de filtro de 70 micrasFalcon352235
microesferas anti-biotinaMiltenyi Biotec130-090-485
anti-CD16/CD32, o bloque FcLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83Clon: RA3-6B2
Beta-mercaptoetanolGibco21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82Clon: eBio1D3
CD23 biotinaeBioscience13-0232-81Clon: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82Clon: B3B4
CD3e biotinaeBioscience13-0033-85Clon: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- ratones N/AN/ACriado en casa
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580Clon: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895Clon: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- ratones N/AN/ACriado
internamente CD5 PEeBioscience12-0051-83Clon: 53-7.3
Retrovirus Ctl-GFPN/AN/AGenerado internamente utilizando el plásmido retroviral MigR1 que expresa GFP proporcionado por el Dr. T.P. Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82Clon: 2B11
CXCR4-GFPretrovirus N/AN/AGenerado internamente mediante la clonación del ratón CXCR4 en el plásmido retroviral MigR1
F4/80 biotinaLife TechnologiesMF48015Clon: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.Licencia requerida
GentamicinaGibco15710-064
Gr-1 biotinaeBioscience13-5931-82Clon: RB6-8C5
suero fetal bovino inactivado por calorGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565Clon: R6-60.2
Jeringas de insulinaBD Biosciences329461
IsofluranoHenry Schein Salud Animal029405
/Muerto Yellow LifeTechnologiesL34968
Columnas LSMiltenyi Biotec130-042-401
Biotina NK1.1BD Biosciences553163 Clon: PK136
Aminoácidos no esencialesGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
Piruvato de sodioGibco11360-070
Ter119 biotinaeBioscience13-5921-82Clon: Ter119
Vivo

Referencias

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