Detección de fitoestrógenos usando un ensayo de receptores de estrógeno a base de células β Reporter

Resumen

Hemos optimizado un receptor de estrógeno disponible comercialmente β ensayo reportero para la detección de alimentos de primates humanos y no humanos para la actividad estrogénica. Validamos este ensayo al mostrar que el alimento humano estrogénico conocido de soja de alimentos humanos registra altos, mientras que otros alimentos no muestran actividad.

Resumen

Las plantas son una fuente de alimento para muchos animales, y pueden producir miles de productos químicos. Algunos de estos compuestos afectan los procesos fisiológicos en los vertebrados que los consumen, como la función endocrina. Fitoestrógenos, los fitoquímicos endocrinos activos más bien estudiados, interactúan directamente con el eje gonadal hipotálamo-pituitario del sistema endocrino vertebrado. Aquí presentamos el novedoso uso de un ensayo basado en células para examinar extractos vegetales para detectar la presencia de compuestos que tienen actividad biológica estrogénica. Este ensayo utiliza células de mamíferos diseñadas para expresar altamente el receptor de estrógeno beta (ERβ) y que han sido transfectadas con un gen luciferasa. La exposición a compuestos con actividad estrogénica da como resultado que las células produzcan luz. Este ensayo es una forma fiable y sencilla de probar la actividad estrogénica biológica. Tiene varias mejoras sobre los ensayos transitorios de transfección, sobre todo, la facilidad de uso, la estabilidad de las células y la sensibilidad del ensayo.

Introducción

Las plantas son una fuente necesaria de alimento para muchos animales, proporcionando calorías y nutrientes críticos para la supervivencia, reproducción, crecimiento, desarrollo y comportamiento^1. Las plantas producen miles de productos químicos, muchos como adaptaciones para su propio crecimiento, mantenimiento estomático y reproducción. Otros compuestos, considerados metabolitos secundarios vegetales (PSM), tienen funciones menos claras, aunque algunos son tóxicos y probablemente utilizados como defensa contra herbívoros y parasitismo (por ejemplo, alcaloides, taninos)^2,3. Algunos de ....

Protocolo

1. Preparación de materiales vegetales

1. Congelar los artículos de plantas secas que fueron recogidos frescos usando un liofilizador.
   1. Para proteger las muestras de la luz, cubra las cámaras con papel de aluminio durante el proceso de secado.
   2. Para asegurar que las muestras estén completamente secas, liofilizar hasta que las cámaras ya no se sientan frías al tacto y los materiales vegetales ya no pierdan masa cuando se pesan.
   3. Almacene las plantas secas en bolsas estériles de residuos bajos en ausencia de luz hasta la molienda.
2. Moler finamente muestras utilizando un molino de molienda con pantalla de malla de 0....

Resultados

Veintidós extractos de frutas y verduras comúnmente encontrados en las dietas humanas fueron examinados para la presencia de compuestos estrogénicos. Se adivinó una variedad de alimentos, incluyendo legumbres, como soja, guisantes de nieve y guisantes, ya que la familia de guisantes es una fuente conocida de fitoestrógenos^16,así como higos, dátiles, maíz, zanahorias, manzanas, plátanos, fresas, tomate, col rizada y repollo. Los compuestos disruptores endocrinos se encuentran en sustancias comunes .......

Discusión

El ensayo de reportero ERβ desarrollado para examinar individualmente agentes farmacéuticos también es adecuado para la detección de alimentos vegetales para fitoestrógenos biológicamente activos a través del ERβ. Las consideraciones importantes en el protocolo incluyen el tratamiento de las muestras vegetales con cuidado: el material vegetal fresco debe secarse rápidamente para evitar el moldeo u otra degradación biológica, y debe mantenerse alejado de la luz para evitar la fotolisis de los compuestos^1.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1000 y micro; Pipeta
20 µ Pipeta
200 µ L pipeta
37 ° baño
37 °, humidificado 5% CO2 incubadora
70% etanol
balanza
clasificado para cultivo celular campana
dimetilsulfóxido
depósito de medios desechables,
matraces			metanol
			HPLC
Sistema de ensayo reportero, 1 ensayo en formato de 96 pocillos	Kit de ensayo IB00411 de Indigo Biosciences		: analiza 24 muestras más
un liofilizador
Pipeta
Agitador
Luminómetro			Ex. Evaporador
	rotativo Bioteck Synergy HTX
matraces			50 mL y 300 mL
tubos de microcentrífuga estériles o cubetas estériles de medios multicanal puntas
			L y 1000 µ L
Bolsas
de	polietileno estériles