Detección de fitoestrógenos usando un ensayo de receptores de estrógeno a base de células β Reporter

Resumen

Hemos optimizado un receptor de estrógeno disponible comercialmente β ensayo reportero para la detección de alimentos de primates humanos y no humanos para la actividad estrogénica. Validamos este ensayo al mostrar que el alimento humano estrogénico conocido de soja de alimentos humanos registra altos, mientras que otros alimentos no muestran actividad.

Resumen

Las plantas son una fuente de alimento para muchos animales, y pueden producir miles de productos químicos. Algunos de estos compuestos afectan los procesos fisiológicos en los vertebrados que los consumen, como la función endocrina. Fitoestrógenos, los fitoquímicos endocrinos activos más bien estudiados, interactúan directamente con el eje gonadal hipotálamo-pituitario del sistema endocrino vertebrado. Aquí presentamos el novedoso uso de un ensayo basado en células para examinar extractos vegetales para detectar la presencia de compuestos que tienen actividad biológica estrogénica. Este ensayo utiliza células de mamíferos diseñadas para expresar altamente el receptor de estrógeno beta (ERβ) y que han sido transfectadas con un gen luciferasa. La exposición a compuestos con actividad estrogénica da como resultado que las células produzcan luz. Este ensayo es una forma fiable y sencilla de probar la actividad estrogénica biológica. Tiene varias mejoras sobre los ensayos transitorios de transfección, sobre todo, la facilidad de uso, la estabilidad de las células y la sensibilidad del ensayo.

Introducción

Las plantas son una fuente necesaria de alimento para muchos animales, proporcionando calorías y nutrientes críticos para la supervivencia, reproducción, crecimiento, desarrollo y comportamiento^1. Las plantas producen miles de productos químicos, muchos como adaptaciones para su propio crecimiento, mantenimiento estomático y reproducción. Otros compuestos, considerados metabolitos secundarios vegetales (PSM), tienen funciones menos claras, aunque algunos son tóxicos y probablemente utilizados como defensa contra herbívoros y parasitismo (por ejemplo, alcaloides, taninos)^2,3. Algunos de estos productos químicos tienen la capacidad de afectar los procesos fisiológicos a largo plazo en animales, como el funcionamiento endocrino, aunque por qué estos fitoquímicos endocrino-activos interactúan con el sistema endocrino vertebrado todavía no está claro^2,4.

Los fitoestrógenos, los fitoquímicos endocrinos activos más estudiados, son PSM polifenólicos que imitan estructural y funcionalmente los estrógenos, interactuando directamente con el eje gonadal hipotalo-pituitario del sistema endocrino vertebrado^5. La ingestión de fitoestrógenos en la dieta humana se asocia con la protección contra algunos tipos de cáncer, enfermedades cardíacas y síntomas menopáusicos, aunque otros efectos incluyen problemas de fertilidad. De hecho, los efectos fisiológicos de estos compuestos fueron descubiertos en la década de 1940 cuando la infertilidad en ovejas se atribuyó a su pastoreo en trébol rico en fitoestrógenos (Trifolium subterrareum)⁶. Cuando se ingiere, fitoestrógenos pueden pasar a las células e imitar los efectos del estrógeno. Mientras que los fitoestrógenos tuvieron efectos negativos sobre la fertilidad de las ovejas, la relación entre fitoestrógenos y fisiología no es simple. Al igual que las ovejas, los rinocerontes blancos del sur muestran sensibilidad a los compuestos estrogénicos en piensos derivados de grandes cantidades de soja y alfalfa. Las hijas de mujeres alimentadas con esta dieta durante el embarazo tienen menos probabilidades de^{reproducirse 7.} Sin embargo, otros estudios han demostrado que los fitoestrógenos también pueden tener efectos positivos, incluyendo la maduración de folículos ováricos en ratones mayores^8,prevención de ciertos tipos de cáncer, actividad antioxidante, y efectos antiproliferativos^9.

La amplitud de los efectos de los fitoestrógenos no es sorprendente dado que los estrógenos afectan a una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo el crecimiento, el desarrollo y la regulación de los sistemas nerviosos reproductivos y centrales^10. Aunque hay muchos mecanismos de acción, fitoestrógenos a menudo tienen la capacidad de modificar, mejorar, o interrumpir la señalización de estrógeno a través de su capacidad para actuar como ligandos para los receptores de estrógeno intranuclear alfa y beta (ERα y ERβ). Muchos fitoestrógenos tienen una estructura de anillo fenólico similar a los estrógenos que les permite unir receptores de estrógeno. Aquellos con actividad estrogénica agonística funcionan como estrógeno, formando un complejo activado de ligando ER que puede dimerizar y unirse a un elemento de respuesta de estrógeno (ERE) y desencadenar la transcripción del gen^11. Por lo tanto, estrógenos y fitoestrógenos regulan la actividad celular y las funciones del sistema a través de sus acciones como factores de transcripción.

Aquí presentamos el novedoso uso de un ensayo basado en células para examinar extractos vegetales para detectar la presencia de compuestos que tienen actividad biológica estrogénica. Este ensayo utiliza células CHO de ovario de hámster chino diseñadas para expresar altamente ERβ, que han sido transfectadas con el gen luciferasa firefly(Photinus pyralis)vinculado a un promotor de ERE^12. Cuando hay compuestos estrogénicos, se unen a urgencias, dimerizan y se unen al ERE, lo que lleva a la transcripción del gen luciferasa. Tras la adición de una solución de sustrato, la luciferasa cataliza una reacción que conduce a la emisión de fotones. Por lo tanto, las muestras positivas producen muestras ligeras y negativas.

Este ensayo disponible comercialmente elimina la necesidad de laboratorios para transfectar las células de mamíferos con el gen reportero y el receptor de estrógeno^13,14, que era inestable y variable en eficacia. El ensayo proporciona una plataforma de transfección estable que permite determinar rápida y simplemente si una planta tiene actividad estrogénica a través de la unión de receptores.

Probamos la hipótesis de que la soja tiene mayor actividad estrogénica que todos los demás alimentos dadas sus concentraciones conocidas de isoflavonas estrogénicas¹⁵ utilizando alimentos humanos de supermercados locales.

Protocolo

1. Preparación de materiales vegetales

1. Congelar los artículos de plantas secas que fueron recogidos frescos usando un liofilizador.
   1. Para proteger las muestras de la luz, cubra las cámaras con papel de aluminio durante el proceso de secado.
   2. Para asegurar que las muestras estén completamente secas, liofilizar hasta que las cámaras ya no se sientan frías al tacto y los materiales vegetales ya no pierdan masa cuando se pesan.
   3. Almacene las plantas secas en bolsas estériles de residuos bajos en ausencia de luz hasta la molienda.
2. Moler finamente muestras utilizando un molino de molienda con pantalla de malla de 0,85 mm.
   1. Guarde las muestras de tierra en las bolsas en ausencia de luz hasta su extracción.

2. Extracción de metabolitos secundarios vegetales

1. Para extraer los metabolitos secundarios de la planta, utilice una proporción de 1 g de muestra seca a 10 ml de metanol grado HPLC.
   1. Pesar la muestra en una balanza analítica y añadirla a un matraz Erlenmeyer de tamaño adecuado (125 – 250 mL). A continuación, agregue el volumen adecuado de metanol. Registre la masa de la muestra extraída.
   2. Cubra la solución de metanol de la planta con papel de aluminio, y luego ajuste para girar a una velocidad de 100 rpm a temperatura ambiente (RT) durante 3 días en un agitador orbital, permitiendo que los compuestos potencialmente estrogénicos se disuelvan en el metanol.
   3. Decantar el sobrenadante en un sistema de filtración por goteo utilizando papel filtrante (125 mm).
   4. Con un evaporador rotativo, seque el extracto de la planta hasta que la muestra se espese, pero vierta, en un matraz de fondo redondo de 300 ml. Vierta la muestra en un matraz de fondo redondo de 50 ml, enjuagando el matraz grande con una pequeña cantidad de metanol. Continúe secando la muestra en el pequeño matraz hasta que el metanol se evapore por completo.
   5. Pesar los residuos de la muestra utilizando un equilibrio analítico. Registre la masa de residuos.
   6. Disolver el extracto de la planta en sulfóxido de dimetil (DMSO) a una concentración de 0,1 g de extracto a 2 ml de DMSO. Vórtice hasta homogeneizar.
   7. Almacene la solución de extracción de la planta-DMSO a 4 °C en viales de vidrio ámbar hasta el ensayo.

PRECAUCIÓN: Las plantas pueden producir productos químicos biológicamente activos desconocidos, y DMSO es un vehículo que puede transportarlos a través de las membranas celulares. Utilice el equipo de protección personal adecuado y el cuidado al manipular estas muestras.

3. Receptor de estrógeno humano β ensayo de transfección¹²

NOTA: Se requiere técnica aséptica y una campana de flujo laminar para el día 1 del protocolo de ensayo.

1. Prepare diluciones de 17β-Estradiol para la curva estándar.
   1. Transfiera el medio de detección de recuperación celular y compuesto (CSM) del almacenamiento del congelador y descongele en un baño de agua de 37 °C.
   2. Tubos de microcentrífuga de etiqueta Intermedios 1 y 2 (INT1, INT2) y 1-8.
   3. Rellene INT1 con 995 μL de CSM, INT2 con 615 μL de CSM, tubo 1 con 900 μL de CSM y tubos 2-8 con 600 μL de CSM. Deja a un lado el tubo 8.
   4. Transferir 5 μL de 100 μM 17β-Estradiol Stock a INT1. Deseche la punta. Vórtice.
   5. Antes de cada transferencia, enjuague la pipeta 3 veces y, a continuación, transfiera 10 μL del INT1 al INT2. Deseche la punta.
   6. Enjuague la pipeta 3 veces y, a continuación, transfiera 100 μL del INT2 al tubo 1. Deseche la punta. Transferir 300 μL del tubo 1 al tubo 2. Repita los tubos del 3 al 7. Deseche 300 μL del tubo 7 en un contenedor de residuos. El tubo 8 es un Cero y no recibe estradiol. Las concentraciones finales de los estándares chapados son: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 y 0 pM estradiol.
2. Preparar compuestos de muestra.
   1. Muestras de vórtice.
   2. Tome 4 μL de cada muestra de planta en DMSO y agregue a 496 μL de CSM para producir una solución DMSO del 0,8%.
3. Descongela rápidamente las células de los reporteros.
   1. Recuperar el tubo del medio de recuperación celular del baño de agua de 37 °C. Desinfectar la superficie exterior usando 70% etanol.
   2. Recuperar células reporteras de -80 °C de almacenamiento y descongelar mediante la transferencia de 10 ml del CRM pre-calentado en el tubo de las células congeladas.
   3. Cierre el tubo de células reporteras y transfiéralo a un baño de agua de 37°C durante 5-10 min.
   4. Recuperar el tubo de la suspensión de celda reportera del baño de agua. Invertir el tubo de las células varias veces suavemente para romper los agregados de las células y producir una suspensión homogénea. Limpie la superficie del tubo con un 70% de etanol.
4. Chapado de ensayo
   1. Dispense 100 μL de la suspensión de celda reportera en cada pozo utilizando una pipeta multicanal.
   2. Dispense 100 μL de muestras en triplicato en pozos de ensayo apropiados.
   3. Transfiera la placa a una incubadora de 37 °C, humidificada 5% CO₂ para 22-24 h.
5. Sustrato de detección de deshielo y búfer de detección en un refrigerador oscuro durante la noche para prepararse para el día 2.
6. Justo antes del final de la incubación de placas, retire el sustrato de detección y el búfer de detección del refrigerador y colóquelo en zona de poca luz hasta que esté equilibrado a RT. Una vez en RT, invierta cada tubo suavemente varias veces para mezclar soluciones a fondo.
   1. Inmediatamente antes de que se complete la incubación, vierta todo el contenido del búfer de detección en el tubo del sustrato de detección para crear reactivo de detección luciferasa. Mezcle suavemente para no producir espuma.
   2. Una vez completada la incubación, invierta la placa para desechar el contenido en un contenedor de residuos adecuado. Toque suavemente la placa en una toalla de papel absorbente limpia para eliminar las últimas gotas de los pozos.
   3. Agregue 100 μL del Reactivo de Detección luciferasa a cada pozo. Deje reposar la placa de ensayo en RT durante 15 minutos. No agite el plato.
7. Cuantifique la luminiscencia utilizando un luminosómetro de lectura de placas de 96 pozos.

Resultados

Veintidós extractos de frutas y verduras comúnmente encontrados en las dietas humanas fueron examinados para la presencia de compuestos estrogénicos. Se adivinó una variedad de alimentos, incluyendo legumbres, como soja, guisantes de nieve y guisantes, ya que la familia de guisantes es una fuente conocida de fitoestrógenos^16,así como higos, dátiles, maíz, zanahorias, manzanas, plátanos, fresas, tomate, col rizada y repollo. Los compuestos disruptores endocrinos se encuentran en sustancias comunes ...

Discusión

El ensayo de reportero ERβ desarrollado para examinar individualmente agentes farmacéuticos también es adecuado para la detección de alimentos vegetales para fitoestrógenos biológicamente activos a través del ERβ. Las consideraciones importantes en el protocolo incluyen el tratamiento de las muestras vegetales con cuidado: el material vegetal fresco debe secarse rápidamente para evitar el moldeo u otra degradación biológica, y debe mantenerse alejado de la luz para evitar la fotolisis de los compuestos^1...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1000 y micro; Pipeta
20 µ Pipeta
200 µ L pipeta
37 ° baño
37 °, humidificado 5% CO2 incubadora
70% etanol
balanza
clasificado para cultivo celular campana
dimetilsulfóxido
depósito de medios desechables,
matraces			metanol
			HPLC
Sistema de ensayo reportero, 1 ensayo en formato de 96 pocillos	Kit de ensayo IB00411 de Indigo Biosciences		: analiza 24 muestras más
un liofilizador
Pipeta
Agitador
Luminómetro			Ex. Evaporador
	rotativo Bioteck Synergy HTX
matraces			50 mL y 300 mL
tubos de microcentrífuga estériles o cubetas estériles de medios multicanal puntas
			L y 1000 µ L
Bolsas
de	polietileno estériles