Artículo de método

Fenotipado de tensión de levadura de alto rendimiento con secuenciación de ARN basada en gotas

DOI:

10.3791/61014

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21 de mayo de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences, University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

En este artículo

Resumen

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Un cuello de botella en el ciclo de ingeniería microbiana en el ciclo de "diseño-construcción-prueba" es la velocidad a la que podemos realizar pantallas funcionales de cepas. Describimos un método de alto rendimiento para el cribado de deformación unitaria aplicado a cientos a miles de células de levadura por experimento que utiliza la secuenciación de ARN basada en gotas.

Resumen

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Las potentes herramientas disponibles para editar genomas de levadura han hecho de este microbio una plataforma valiosa para la ingeniería. Si bien ahora es posible construir bibliotecas de millones de cepas genéticamente distintas, la detección de un fenotipo deseado sigue siendo un obstáculo significativo. Con las técnicas de cribado existentes, existe un equilibrio entre la producción de información y el rendimiento, con un cribado de alto rendimiento que normalmente se realiza en un producto de interés. Por lo tanto, presentamos un enfoque para acelerar el cribado de cepas mediante la adaptación de la secuenciación de ARN de una sola célula a las colonias isogénicas de picolitros de variedades de levadura genéticamente diseñadas. Para abordar los desafíos únicos de realizar la secuenciación de ARN en células de levadura, cultivamos colonias de levadura isogénicas dentro de hidrogeles y esferoplastia antes de realizar la secuenciación de ARN. Los datos de secuenciación de ARN se pueden utilizar para inferir fenotipos de levadura y ordenar vías diseñadas. La escalabilidad de nuestro método aborda una obstrucción crítica en la ingeniería microbiana.

Introducción

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Un objetivo principal de la ingeniería microbiana es modificar los microbios para inducirlos a producir compuestos valiosos1,,2. S. cerevisiae ha sido el organismo principal de la ingeniería microbiana debido a su facilidad de cultivo y la amplitud de herramientas disponibles para la ingeniería de su genoma3,4,5. Sin embargo, un obstáculo sigue siendo la realización de pantallas funcionales en la levadura modificada: el rendimiento de cribado se retrasa detrás de la ingeniería del genoma por órdenes de magnitud. El cribado normalmente implica aislar las cepas en placas de micropocillos y fenoticarlos midiendo la producción de un compuesto específico6,7. El rendimiento de este proceso está limitado por las grandes cantidades de reactivo necesario para la determinación de cepas individuales en reacciones de cien microlitros. Los microfluídicos de gotas proporcionan una solución atractiva para aumentar el rendimiento del cribado de levadura por órdenes de magnitud mediante reacciones de reducción de escala normalmente realizadas en placas depozo8. Sin embargo, al igual que con las pantallas de placas de pozo, las pantallas de gotas suelen detectar compuestos de un solo producto, lo que proporciona información limitada en la función global de la vía de ingeniería9,10,11.

La secuenciación del ARN (RNA-seq) puede permitir una caracterización más completa de la operación de la vía al permitir que los niveles de expresión de todos los genes relevantes se evalúen simultáneamente12,13. Además, los métodos de gotas permiten generar miles de celdas por experimento, proporcionando el rendimiento necesario para las bibliotecas de pantalla de las variantes de ingeniería14,15. Sin embargo, los métodos ARN-seq están optimizados para células de mamíferos; levadura, en comparación, tienen menos ARNm por célula y una pared celular que es difícil de eliminar16,excluyendo su secuenciación por métodos existentes. Si se pudiera diseñar un método de gotas de alto rendimiento para habilitar el ARN-seq de levadura, proporcionaría una plataforma de fenotipado escalable, rentable y rica en información para la ingeniería de levaduras.

Presentamos un protocolo detallado de nuestro método desarrollado recientemente para la secuenciación de células de levadura utilizando microfluídicos de gotas de alto rendimiento17. Para superar el desafío del ARN limitado, encapsulamos y cultivamos células de levadura únicas en esferas de hidrogel de picolitro. La cultura duplica las células, produciendo cientos de copias compartiendo la misma vía diseñada; esto reduce la variación debido a la expresión génica de una sola célula al tiempo que aumenta significativamente la cantidad de ARN disponible para la secuenciación. Después de la amplificación basada en el cultivo, esferoplastia de las células, eliminando la pared celular a través de la digestión enzimática a granel. Las membranas celulares permanecen intactas, de modo que cada colonia isogénica y su ARNm asociado permanecen encapsulados en sus esferas de hidrogel. Esto nos permite emparejar las colonias individuales con los reactivos de captura de ARNm y el búfer de lisis, y el ARNm que se capturará, se va y secuenciará siguiendo el flujo de trabajo de Drop-Seq14. Nuestro método permite el cribado en todo el transcriptoma de miles de colonias de levadura isogénicas por experimento.

Protocolo

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1. Fabricación de dispositivos microfluídicos

  1. Fabricación maestra SU-8
    1. Diseñe la máscara negativa para los canales microfluídicos para los dispositivos A y B(archivo suplementario 1 y 2) utilizando un software de diseño asistido por ordenador y pídales que se impriman en una película de placa de circuito con una resolución de al menos 10 m.
    2. Coloque una oblea de silicio limpia de 75 mm sobre una capa de centrifugado y vierta aproximadamente 1 ml de SU-8 sobre su centro. Encienda la aspiradora para fijar la oblea al mandril.
    3. Para el dispositivo A, la capa de espín SU-8 2150 a 500 rpm durante 30 s, seguida de 30 s a 2.750 rpm. Para el dispositivo B, la capa de giro SU-8 2100 a 500 rpm durante 30 s, seguida de 30 s a 2.500 rpm. Esto producirá capas SU-8 de espesor de 200 m y 120 m, respectivamente.
    4. Retire la oblea del spin-coater y colóquela en una placa de cocción a 95 oC durante 60 minutos para hornear suavemente.
    5. Retire la oblea de la placa caliente y déjela enfriar a temperatura ambiente. Coloque la máscara en la parte superior de la oblea, y exponga bajo un colimador 190 mW, 365 nm LED UV durante 2 min.
    6. Colocar la oblea en una placa de cocción a 95 oC durante 5 minutos para hornear después de la exposición.
    7. Retire la oblea y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Colocar la oblea en un baño de acetato de éter monometil de propilenglicol (PGMEA) durante 20 min.
    8. Enjuague la oblea con PGMEA seguido de isopropanol. Si algún residuo opaco es visible durante este proceso, repita el enlizado con PGMEA e isopropanol. Seque al aire la oblea.
    9. Colocar la oblea en una placa de cocción a 95 oC durante 3 minutos.
    10. Retire y coloque la oblea en una placa Petri de 90 mm de diámetro.
  2. Fundición de polidimetilsiloxano (PDMS) en su maestro SU-8
    1. Mezclar una relación de masa de 10:1 de base de silicona con agente de curado. Desgasifique el PDMS después de mezclar durante unos 30 minutos.
    2. Vierta PDMS desgasizados en la parte superior del maestro SU-8 hasta que se forme al menos una capa de 5 mm de espesor en la parte superior de la oblea.
    3. Desgasifique el PDMS en la parte superior de la oblea durante unos 30 minutos.
    4. Coloque la oblea en un horno de 65 oC durante al menos 80 minutos para curar el PDMS.
    5. Corte la losa PDMS curada de la oblea.
    6. Coloque la losa PDMS con las funciones microfluídicas orientadas hacia arriba y haga perforar los orificios de entrada y salida con un punzón de biopsia de 0,75 mm.
    7. Limpie un portaobjetos de vidrio de 50 mm x 75 mm con isopropanol y retire todo el polvo de las características microfluídicas laterales de la losa PDMS con cinta adhesiva.
    8. Exponga el portaobjetos de vidrio limpio y la losa PDMS con las funciones microfluídicas frontales de hasta 100 Pa (1 mbar O2) plasma durante 1 min.
    9. Coloque la losa PDMS con las operaciones boca abajo en la corredera de vidrio para permitir la unión. Coloque el tobogán en un horno de 65 oC durante al menos 30 minutos para completar la unión.
    10. Trate todos los canales microfluídicos lanzándolo con un líquido de tratamiento de superficie fluorado. Hornee el dispositivo en un horno de 65 oC durante al menos 10 minutos para evaporar el líquido.

2. Encapsulación de levadura en hidrogeles utilizando el dispositivo A

  1. Tome el cultivo de levadura en un cultivo de suspensión y cuente con un hemocitómetro.
  2. Resuspenda las células de la solución salina tamponada de fosfato (PBS) a una concentración de aproximadamente 750 k/mL. Esto asegura que el 30% de los hidrogeles tendrán una célula de levadura en ellos. Sólo alrededor de la mitad de las células de levadura crecen en colonias, lo que lleva a un 15% de hidrogeles que contienen colonias de levadura.
  3. Mezcle la agarosa del punto de fusión ultrabajo a un 2% p/v en PBS y caliente a 90 oC hasta que se derrita. Esto toma 10 min.
  4. Cargue la mezcla de agarosa en una jeringa con un filtro de 0,22 m en una bomba de jeringa delante del calentador de espacio ajustado a 80 oC.
  5. Cargue una jeringa llena con la suspensión de levadura y una jeringa que contenga aceite fluorado con un 2% p/v de fluorosurfactante iónico18 en bombas de jeringa.
  6. Tome el dispositivo divisor de caída de coflujo fabricado en la sección 1 y conecte el tubo de las jeringas al dispositivo. Guiar el tubo desde la salida en un tubo cónico de 15 ml en un cubo de hielo para la recogida de gotas.
  7. Flujo en las tres soluciones en el dispositivo con los siguientes caudales:
    1. Flujo de la suspensión de levadura con un caudal de 3 ml/h.
    2. Flujo de la mezcla de agarosa a un caudal de 3 ml/h.
    3. Flujo del aceite fluorado a un caudal de 15 ml/h.
  8. Recoger aproximadamente 1 ml de emulsión. Espere 5 minutos adicionales para permitir que la agarosa se ajuste completamente.

3. Romper y lavar gel para el cultivo

  1. Añadir un volumen igual de 20% de perfluorooctanol (PFO) en aceite fluorado a la emulsión. Invierta el tubo cónico varias veces para permitir la mezcla.
  2. Gire la emulsión rota a 2.000 x g durante 2 min. Los geles se pellet por encima de las fases de aceite y PFO.
  3. Retirar la fase de aceite y añadir 2 mL de tampón TE-TW (10 mM Tris pH a 8.0, 1 mM EDTA, 0.01% Tween-20) para resuspender los geles. Transfiera la suspensión a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
  4. Peletar los geles como en el paso 3.2 y lavar una vez más en TE-TW para un total de dos lavados.
  5. Retire el sobrenadante y resuspenda los geles en 2 ml de medios. Traslado a un tubo de cultivo de 5 ml.
  6. Incubar a 30oC durante la noche bajo agitación.
    NOTA: Después de la incubación durante la noche, los hidrogeles de levadura se pueden mantener a 4 oC durante varios días.

4. Lisis de colonias de levadura

  1. Transfiera los geles a un tubo cónico de 15 ml e hidrogeles de pellets a 2.000 x g durante 2 min.
  2. Lavar los hidrogeles en PBS 2x.
  3. Lavar en 1x tampón de esferoplastia 1x.
  4. Realizar una dilución de 2-50x de la enzima esferoplastia en tampón de esferoplastia y añadir 1 ml a los hidrogeles.
  5. Incubar a 37oC durante 1 h. La levadura tratada se verá más transparente(Figura 3A).
  6. Tome la parte inferior 0,8 ml de suspensión de hidrogel y transfiera a una jeringa de 1 ml sin tapar.
  7. Coloque la jeringa en el soporte de la jeringa impresa en 3D(archivo suplementario 3)y gire a 2.000 x g durante 2 min. Esto hará que los hidrogeles cierren el envase en el cabezal de la jeringa.

5. Captura de ARNm de colonias de levadura salida usando el Dispositivo B

  1. Tome 240.000 perlas Drop-Seq y transfiera a un tubo cónico de 15 ml.
  2. Perlas De pellet Drop-Seq girando hacia abajo a 1.000 x g durante 1 min.
  3. Retire el sobrenadante y resuspenda las perlas en 2 ml de tampón de lisis de levadura de 0,9x con cloruro sódico de 500 ml para una concentración de suspensión de perlas de 120.000 perlas/ml.
  4. Transfiera la suspensión del cordón a una jeringa de 3 ml con una barra de agitación insertada.
  5. Prepare una jeringa que contenga varios mililitros de surfactante de 2% p/v de perfluoropoliéter-polietilenglicol (PFPE-PEG) en aceite fluorado.
  6. Evacuar toda la cabeza acuosa de la jeringa que contiene hidrogeles estrechamente embalados y tapar la jeringa.
  7. Inserte el hidrogel, la suspensión del cordón y las jeringas de aceite en las bombas de jeringa y conéctelas a través de un tubo en el dispositivo de encapsulación fabricado en la sección 1.
  8. Conecte desde el tubo de salida a un tubo cónico de 50 ml sobre hielo.
  9. Flujo en las tres soluciones en el dispositivo con los siguientes caudales:
    1. Flujo de los hidrogeles a 0,4 ml/h.
    2. Flow la suspensión del cordón a 0,4 ml/h.
    3. Flujo del aceite fluorado a 1,6 ml/h.
  10. Recoger 1 ml de emulsión o ejecutar el dispositivo hasta que no queden más hidrogeles.

6. generación de ADNc, preparación de bibliotecas de secuenciación y secuenciación

  1. Añadir 30 mL de 6x búfer SSC y 1 mL de PFO a la emulsión recogida como se indica en el protocolo Drop-Seq14.
  2. Continúe siguiendo el protocolo Drop-Seq para generar ADNc a partir de ARNm capturado en cuentas, preparación de bibliotecas de secuenciación y análisis de datos de secuenciación.

Resultados

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Adaptamos el flujo de trabajo Drop-Seq publicado anteriormente14 para la secuenciación de colonias isogénicas (ICO-seq) para realizar perfiles de expresión génica de colonias de levadura isogénicas. Aislamos células de levadura únicas y las encapsulamos en microgeles de agarosa(Figura 1A). Después de la incubación durante la noche de microgeles, estas células de levadura encapsuladas se convirtieron en colonias isogénicas. Antes de cargar geles en un segundo dispositivo microfluídico para la captura de ARNm, digerimos la pared celular de la levadura para hacer el ARNm más accesible(Figura 1B,izquierda). Empacamos estos microgeles y fusionamos las cuentas de captura de ARNm y el tampón de lisis. Algunas gotas contenían exactamente una cuenta emparejada con una colonia de levadura salida. Se recogieron todas las cuentas en la emulsión y se sintetizó y secuenciaron el ADNc siguiendo el protocolo Drop-Seq.

Generamos colonias de levadura isogénicas a través de la encapsulación de células de levadura única dentro de microgeles de agarosa utilizando un dispositivo microfluídico de coencapsulación con un divisor de ocho gotas conectado(Figura 2A). Diluimos la suspensión de la levadura de entrada a una concentración de 750.000 ml/ml para que el 30 % de los microgeles tengan exactamente una levadura en ellos. Antes de insertar la temperatura de fusión ultrabaja en el dispositivo, la disolvimos a una temperatura elevada y mantuvimos la jeringa a esta temperatura para evitar la gelación prematura. En la unión de la generación de caídas(Figura 2B),las células de levadura se encapsularon inicialmente en gotas de 160 m. Después de la unión de la generación de caídas, un divisor de ocho pliegues dividió estas gotas en ocho gotas de 80 m(Figura 2C). Se unizó un filtro de jeringa a la agarosa fundida para evitar que se formaran obstrucciones dentro de los canales, que pueden ser tan estrechos como 37 m durante la división de gotas. Recogimos la emulsión sobre hielo, que inmediatamente comenzó el proceso de gelación de agarosa. Calculamos la polidispersidad de una emulsión típica para que sea de 6%(Figura Suplementaria 1),aunque los valores de polidispersidad de hasta el 10% son aceptables. Una vez que los geles de agarosa se pusieron, rompimos la emulsión y eliminamos la fase de aceite. Los geles se lavaron en tampón acuoso antes de la inmersión en medios de crecimiento. La incubación nocturna de los microgeles dio lugar a colonias isogénicas que crecían dentro de algunos de los microgeles(Figura 2D). El porcentaje de hidrogeles que contenían colonias de al menos 20 células dependía de las condiciones de cultivo, incluyendo el tiempo de incubación y la composición de los medios. En nuestra demostración con C. albicans,determinamos que alrededor del 15% de los hidrogeles contenían una colonia después de 20 h de cultivo de suspensión.

Un segundo dispositivo de coencapsulación extrajo el ARNm de las colonias isogénicas(Figura 3A). Antes de cargar los microgeles de levadura en el dispositivo microfluídico, lavamos y sumergimos los geles en una solución para digerir las paredes celulares de levadura. La digestión adecuada de las células de levadura se verificó mediante microscopía, con levaduratratada con una morfología más reflexiva(Figura 3B). Empacamos los microgeles en una jeringa y ajustamos el caudal de entrada de gel de tal manera que un gel estaba en cada gota. Una corriente de perlas de captura de ARNm en el tampón de lisis mezclado con la corriente de gel estrechamente empaquetada antes de la unión de colocación(Figura 3C). Recogimos una emulsión resultante de 160 gotas de m, y las colonias comenzaron a cargar y liberar su contenido celular. Cargamos cuentas en una dilución limitante para minimizar el número de gotas que contienen múltiples perlas, pero el empaque cercano de los geles durante la fabricación de gotas dio lugar a aproximadamente 10% de gotas recogidas que contienen un cordón con una colonia lysed(Figura 3D).

Analizamos la expresión génica de C. albicans,una especie de levadura presente en el microbioma intestinal humano, utilizando el flujo de trabajo ICO-seq. C. albicans se destaca por su capacidad para cambiar entre dos estados de celda diferentes, llamado blanco y opaco19. Utilizamos una cepa C albicans de ingeniería, cepa RZY122, que reemplaza una copia del gen WH11, sólo activa en células blancas con YFP20. Obtuvimos un conjunto de perfiles de expresión génica utilizando el flujo de trabajo y los utilizamos para el análisis de colonias que expresan al menos 300 genes únicos. Como conjunto de datos de referencia, utilizamos datos de expresiones de C. Albicans obtenidos de un estudio publicado anteriormente17 y filtramos colonias que expresaban menos de 600 genes únicos. Después de realizar un análisis de componente principal (PC) y una reducción de dimensionalidad de la incrustación de vecinos t-estocástico (tSNE)21, encontramos concordancia general entre nuestro dataset de muestra y la referencia(Figura 4A). El análisis de PC reveló que YFP y WH11 contribuyeron significativamente a los dos primeros PC. Además, el análisis tSNE reveló tres clústeres(Figura 4B). Mientras que el clúster 2 se componía predominantemente de celdas del conjunto de datos de muestra, los clústeres 0 y 1 estaban compuestos por celdas de ambas muestras. Al superponer la expresión WH11 en el tSNE(Figura 4C, panel superior), determinamos que el clúster 1 probablemente contenía colonias blancas. También encontramos que la expresión STF2 aumentó en el clúster 1(Figura 4C, panel inferior), coherente con los datos obtenidos anteriormente17. En los clústeres 0 y 2, WH11 y STF2 se regularon significativamente en comparación con el clúster 1(Figura 4D). Los genes implicados en la fermentación, como ADH1,fueron regulados en el grupo 0, de acuerdo con estudios previos de células opacas22. Encontramos que las colonias en el grupo 2 habían disminuido el ARN ribosomal en comparación con las colonias en los grupos 0 y 1. Aunque los conjuntos de datos de muestra y referencia se obtuvieron utilizando el mismo stock de células, este resultado sugiere que incluso las diferencias sutiles en el manejo experimental pueden afectar la expresión génica.

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Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo ICO-seq. (A) El cultivo de levadura en un cultivo de suspensión se diluyó en tampón y coencapsulado con agarosa fundida en un dispositivo generador de gotas de enfoque de flujo para permitir la carga de Poisson de microgeles de agarosa con células de levadura únicas. Los geles se fijaron cuando la agarosa se enfrió, la suspensión de aceite / agua se rompió, y el aceite fue eliminado, produciendo una suspensión de cuentas de gel en agua. Después del cultivo nocturno, las células de levadura se convirtieron en colonias isogénicas dentro de los microgeles. (B) Las colonias fueron sometidas a un búfer de degradación de la pared celular, después de lo cual fueron estrechamente embaladas y coencapsuladas con perlas de captura de ARNm en un segundo dispositivo microfluídico. El embalaje cercano de los microgeles aseguró que cada gota tenía un gel, mientras que la carga de Poisson de las perlas redujo la posibilidad de múltiples perlas dentro de una gota. Las gotas recogidas se procesaron para la síntesis de ADNc y la generación de una biblioteca de secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Generación de colonias de levadura isogénicas dentro de microgeles de agarosa utilizando el Dispositivo A. (A) Esquema del dispositivo microfluídico, mostrando las ubicaciones de las tres entradas y puertos de salida. La unión de colocación se resalta en rojo. (B) Primer plano de la unión de colocación durante el funcionamiento normal del dispositivo. (C) Micrografía de gotas recogidas, con un primer plano de una gota que contiene una celda encapsulada (inset). (D) Micrografía de colonias de levadura isogénicas en microgeles de agarosa después de una incubación de 24 horas, con un primer plano de dos colonias (inset). Todas las barras de escala de 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Captura de lisis y ARNm de colonias isogénicas utilizando el Dispositivo B. (A) Esquema del dispositivo microfluídico, mostrando las ubicaciones de las tres entradas y puertos de salida. La unión de colocación se resalta en rojo. (B) Micrografía de colonias de levadura después de la digestión de la pared celular, con un primer plano de una colonia (inset). (C) Primer plano de la unión de colocación durante el funcionamiento normal del dispositivo. (D) Micrografía de emulsiones recogidas después del emparejamiento de microgeles y cuentas, con un primer plano que muestra una gota con un cordón y una colonia lysed (inset). Todas las barras de escala de 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de la respuesta de conmutación blanco-opaco en C. albicans. (A) gráfica tSNE de un dataset de ejemplo combinado con un dataset de referencia de Liu17. (B) La agrupación en clústeres de transcriptomes revela tres clústeres visualizados en una gráfica tSNE. (C) Los genes clave implicados en la respuesta de conmutación blanco-opaco contribuyeron a la variación determinada a través del análisis de componentes principales. (D) Gráficas de violín de niveles de expresión normalizados de YFP y WH11 por clústeres marcados en la gráfica tSNE. **indica p <<< 0.05 y * indica p << 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figuras suplementarias 1 y 2. Por favor, haga clic aquí para descargar estos filgures.

Archivos Suplementarios 1-3. Haga clic aquí para descargar estos archivos.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nuestro método para la secuenciación de ARN de colonias de levadura isogénica (ICO-seq) adapta una plataforma de secuenciación de ARN de una sola célula publicada, Drop-Seq, para el cribado de alto rendimiento de cepas de levadura de ingeniería. Las células de levadura contienen menos del 10% de las copias de ARNm de una célula de mamífero típica y tienen una pared celular que necesita ser degradada antes de la captura de ARNm16. Estos dos factores impiden la aplicación directa de levadura a Drop-Seq u otras plataformas scRNA-seq basadas en gotas. Para abordar estos problemas, encapsulamos células individuales dentro de hidrogeles y las cultivamos en colonias para proporcionar suficiente material de entrada para la secuenciación de ARN y digerimos la pared celular de levadura para generar esferoplastias antes de la captura de lisis y ARNm. Estos cambios agregan complejidad adicional en el flujo de trabajo ICO-seq en comparación con el flujo de trabajo original de Drop-Seq y son pasos críticos que los usuarios deben garantizar que continúen sin problemas.

El funcionamiento adecuado del dispositivo A es necesario para encapsular células de levadura únicas dentro de hidrogeles de agarosa. Se debe seguir el recuento adecuado de la suspensión de la levadura de entrada para minimizar el número de hidrogeles con más de una célula de levadura, a la vez que se garantiza que los hidrogeles suficientes contengan una sola célula para garantizar una eficiencia de captura celular razonable durante la captura de ARNm. Durante el funcionamiento del dispositivo microfluídico, la mezcla de gel de agarosa debe disolverse bien y pasar a través de un filtro de jeringa para minimizar la posibilidad de obstrucción del dispositivo. La mezcla de gel de agarosa es viscosa y la región en la que un solo canal se divide en ocho es especialmente propensa a la obstrucción. Al centrar una cámara de alta velocidad para visualizar el funcionamiento del dispositivo en esa región del dispositivo, los usuarios pueden supervisar la uniformidad de las gotas que emergen de cada uno de los ocho canales y reaccionar rápidamente si la uniformidad cambia debido a obstrucciones en cualquiera de los canales. La inspección de una pequeña cantidad de emulsión recogida bajo el microscopio proporciona un método secundario para confirmar una emulsión de alta calidad.

Tras el crecimiento de colonias de levadura dentro de hidrogeles, se realizan varias precauciones para garantizar la extracción de ARNm de calidad a nivel de una sola colonia. Es importante optimizar el tiempo que la levadura está en el cultivo de hidrogel, porque si la levadura se deja en cultivo durante demasiado tiempo, muchos escaparán de los confines de los hidrogeles, lo que conduce a una señal de fondo más alta durante la secuenciación de ARN y menor sensibilidad al discriminar entre los tipos de células. La generación adecuada de esferoplastias con Zymolyase garantiza que el ARNm se libere después de la exposición celular al tampón de lisis. La inspección visual de las colonias de levadura que siguen a Zymolyase debe producir células de levadura más brillantes. Una digestión inadecuada de la pared celular conducirá a una menor eficiencia de captura de ARN. Por último, los hidrogeles deben estar embalados de cerca a medida que se inyectan en el dispositivo B. La supervisión de la entrada de hidrogel con una cámara de alta velocidad permitirá la terminación de la recogida de emulsión una vez que los hidrogeles ya no estén estrechamente embalados al introducirlos en el dispositivo, de lo contrario se verá afectada la eficiencia de captura.

Una preocupación potencial con nuestro método es que el cultivo de microgel de levadura puede alterar significativamente la expresión génica. Los trabajos previos que investigan la expresión génica de levadura en microgeles y en el agar demuestran diferencias en los promedios de expresión génica, pero en general una correlación positiva17, aunque una investigación adicional de esta afirmación sobre una variedad de cepas de levadura es prudente. El método también tiene una eficiencia limitada de captura de células debido a la carga estocástica de cuentas de captura de ARNm siguiendo las estadísticas de Poisson14. Actualmente alrededor del 10% de las gotas contienen un cordón y una colonia, y se espera que la tasa de encapsulaciones dobles sea inferior al 1%. Las encapsulaciones dobles conducen a la confunción de elementos durante el análisis de datos DE ARN-seq y su filtrado sigue siendo un reto23; una tasa de captura del 25% llevaría a un aumento correspondiente de encapsulaciones dobles al 5%(Figura Suplementaria 2). Aunque demostramos ICO-seq utilizando la plataforma Drop-Seq, hay otras plataformas de ARN-seq de gotas que introducen cuentas de captura de ARNm de manera determinista en lugar de estadísticamente, como la plataforma 10x Genomics Chromium disponible comercialmente15,24. La integración de esas plataformas con ICO-seq podría aumentar la eficiencia de captura más allá de lo que permiten las estadísticas de Poisson. Por último, una limitación fundamental de la gota ARN-seq es la incapacidad de recuperar células de interés después de la secuenciación. Esta limitación debe tenerse en cuenta al considerar los tipos de bibliotecas de levadura sin levadura para analizar utilizando este método.

Se ha demostrado heterogeneidad célula a célula a nivel clonal para microbios como E. coli25 y S. cerevisiae26 revelando nuevos estados celulares que un análisis a nivel masivo de otra manera enmascararía. Los análisis a granel de ARN-seq realizados en C. albicans tienden a examinar los cambios de transcriptoma de toda la población, o las células blancas y opacas como dos poblaciones separadas27,28. La aplicación de ICO-seq podría conducir al descubrimiento de subestados adicionales y proporcionar un marco analítico para descubrir nuevos estados celulares dentro de otras especies de levadura. Sin embargo, el crecimiento de células dentro de hidrogeles no se limita a la levadura: otros tipos de células, como células de mamíferos, bacterianas y otras células fúngicas también pueden cultivarse dentro de hidrogeles29,,30. La secuenciación de colonias isogénicas frente a células individuales conduce a la promediación del ruido biológico debido a la variación de célula a célula, mejorando la discriminación entre los tipos de células. Esto puede ayudar al analizar las células donde la diversidad genética se centra en vías de síntesis específicas. Las posibilidades ampliadas de la entrada de tipo celular a ICO-seq y su posible integración con plataformas DE ARN-seq de gotas disponibles comercialmente posicionan a ICO-seq como una plataforma prometedora para disuacar la heterogeneidad celular a nivel genético.

Divulgaciones

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Los autores no declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este proyecto fue apoyado por el Premio de Carrera de la Fundación Nacional de Ciencias DBI-1253293, el Premio Nacional de Institutos de Salud Nuevo Innovador DP2AR068129 y otorga R01HG008978, el Centro Tecnológico de la Fundación Nacional de Ciencias otorgando DBI-1548297, y el Centro de Construcción Celular de la UCSF. ARA y ZJG son investigadores de Chan-Zuckerberg Biohub.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de jeringa de 0,22 mmmMilipore SigmaSLGP033RS
0,5M EDTA, pH 8,0Thermo-Fisher15575020Se utiliza para fabricar el tampón TE-TW
Punzón de biopsia de 0,75 mmWorld Precision Instruments504529
jeringas de 1 mLBD309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)Sigma-Aldrich370533
1M Tris-HCI, pH 8.0Thermo-Fisher15568025 Se utiliza para fabricar agujas de calibre 27 tampón TE-TW
Jeringas BD305109
de 3 mL309657
Obleas de silicona de 3", tipo P, grado de prueba virgenUniversity Wafers447
Soporte de jeringa de centrífuga impreso en 3D(personalizado)personalizado)Ver archivos complementarios para archivo de impresión 3D
Agarosa, baja temperatura de gelificaciónSigma-Aldricha9414
Aquapel (tratamiento hidrofóbico del vidrio)Pittsburgh Glass Works47100
Drop-Seq BeadsChemGenesMACOSKO-2011-10
Portaobjetos de microscopio de vidrio (75 mm x 50 mm)Corning294775X50
Ionic Krytox SurfactantInstrucciones de síntesis en ref 14. Se puede sustituir con surfactante PEG-PFPE.
IsopropanolSigma-Aldrich109827
NaClSigma-AldrichS9888
Novec 75003M98-0212-2928-5Comúnmente conocido como HFE 7500
PBSFisher ScientificBP243820
Tubería de polietileno PE-2Scientific CommoditiesB31695-PE/2
Tensioactivo PEG-PFPERan Biotechnologies008-FluoroSurfactante
Desarrollador PGMEASigma-Aldrich484431
FotomascarillasCadArt Servcies(personalizado)Ver archivos complementarios para diseños de máscaras
Recubrimiento por centrifugadoSistemas de recubrimiento especialesG3P-8
Tampón SSCSigma-AldrichS6639
SU-8 2100MicroChem
SU-8 2150MicroChemY111077
Sylgard 184 kit de elastómero de siliconaKrayden4019862
Tween-20Sigma-AldrichP1379Se utiliza para fabricar tampón TE-TW
YR Tampón de digestiónZymo ResearchR1001-1Tampón esferoplasto
Tampón de lisis YR ZymoResearchR1001-2
ZymolyaseZymo ResearchE1005Mezcla de enzimas esferoplastas
BD (Y111075

Referencias

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