La palmitoylación implica la incorporación de una mitad de palmitato de 16 carbonos a los residuos de cisteína de proteínas diana de una manera reversible. Aquí, describimos un enfoque bioquímico, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitoylación de cualquier proteína de interés en los cascos cerebrales de ratón.
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Artículo de método
Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral
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Resumen
Resumen
Alteraciones dependientes de la actividad en los niveles de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro de la densidad postsináptica (PSD) se cree que representan un mecanismo celular para el aprendizaje y la memoria. La palmitoylation regula la localización y la función de muchas proteínas sinápticas, incluyendo AMPA-R, factores auxiliares y andamios sinápticos de una manera dependiente de la actividad. Identificamos la familia de genes inducidos por la diferenciación de la sinapsis (SynDIG) de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los ACAR y regulan la fuerza de la sinapsis. SynDIG1 se palmitoylated en dos residuos de cisteína ubicados en las posiciones 191 y 192 en la región de la yuxta-transmembrana importante para el desarrollo de sinapsis excitatoria dependiente de la actividad. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitilación de cualquier proteína de interés y demostrar su utilidad con la familia de proteínas SynDIG en los cascos cerebrales de ratón.
Introducción
La S-palmitoylation es una modificación post-traduccional reversible de las proteínas diana que regula la asociación estable de membranas, el tráfico de proteínas y las interacciones proteína-proteína1. Implica la adición de una mitad de palmitato de 16 carbono a los residuos de cisteína a través del enlace tioéster catalizado por las enzimas palmitoyl acyltransferase (PAT). Muchas proteínas sinápticas en el cerebro son palmitoylated, incluyendo AMPA-Rs y PSD-95, de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización, y la función2,3,
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Protocolo
Todos los procedimientos de animales siguieron las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis.
1. Preparación de membranas cerebrales de ratón
- Decapitar el ratón usando un aparato de guillotina y diseccionar el cerebro rápidamente (en <1 min, si es posible, para minimizar los cambios de palmitoylación que pueden ocurrir durante el procedimiento de disección). Homogeneizar inmediatamente en 10 ml de tampón de homogeneización(Tabla 1) en un homogeneizador de vidrio (12 golpes) so....
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Resultados
La inmunoblotación con anticuerpos contra la proteína de interés revela el estado palmitilado (no, por separado, doblemente, etc.) en los efectos cerebrales del ratón según lo determinado por el cambio de movilidad en comparación con las muestras en las que no se incluyó el HAM. Anteriormente, habíamos demostrado que SynDIG1 estaba palmitoylated en dos sitios utilizando el ensayo ABE6; sin embargo, no pudimos determinar si ambos sitios fueron modificados en el teji.......
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Discusión
En nuestro trabajo anterior, utilizamos el ensayo ABE para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función6. Una limitación es que el ensayo ABE requiere purificación de afinidad con resinas de agarosa conjugadas con mitades de avidina como el paso final en el procedimiento, lo que resulta en una pérdida significat.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a K. Woolfrey por su consejo y aportación sobre el ensayo APEGS. Estos estudios fueron financiados por becas de investigación a E.D. de la Fundación Whitehall y el NIH-NIMH (1R01MH119347).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hidroxilamina (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Metoxi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | o equipo equivalente |
| N-etilmalemida (NEM) | Calbiochem | 34115 | Altamente tóxico. |
| Generador de imágenes óptico para densitometría | Azure Biosystems | , Sapphire Biomolecular Imager | o equipo equivalente |
| , Tubos de polipropileno con tapón | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Pipetas serológicas (vidrio) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| centrífuga de sobremesa | Beckman | , Allegra, X-15R | o equipo equivalente |
| Clorhidrato de fosfina (2-carboxietil) Tris (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
Referencias
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience.
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Reimpresiones y permisos
