Los productos traslacionales no dependientes del ATG asociados a la repetición son características patógenas emergentes de varias enfermedades basadas en la expansión repetida. El objetivo del protocolo descrito es evaluar la toxicidad causada por estos péptidos utilizando ensayos conductuales y celulares en el sistema modelo C. elegans.
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Artículo de método
Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
C. elegans se utiliza comúnmente para modelar enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad causadas por mutaciones de expansión repetidas, como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Huntington. Recientemente, se demostró que el ARN que contiene expansión repetida es el sustrato de un tipo novedoso de traducción proteica llamada traducción no dependiente de la AUG (RAN) asociada a la repetición. A diferencia de la traducción canónica, la traducción RAN no requiere un codón de inicio y solo se produce cuando las repeticiones superan una longitud de umbral. Debido a que no hay codón de inicio para determinar el marco de lectura, la traducción RAN se produce en todos los marcos de lectura de las plantillas de ARN de detección y antisentido que contienen una secuencia de expansión repetida. Por lo tanto, la traducción DERAN amplía el número de posibles péptidos tóxicos asociados a la enfermedad de uno a seis. Hasta ahora, la traducción RAN se ha documentado en ocho diferentes enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares basadas en la expansión. En cada caso, descifrar qué productos RAN son tóxicos, así como sus mecanismos de toxicidad, es un paso crítico hacia la comprensión de cómo estos péptidos contribuyen a la fisiopatología de la enfermedad. En este artículo, presentamos estrategias para medir la toxicidad de los péptidos RAN en el sistema modelo C. elegans. En primer lugar, describimos los procedimientos para medir la toxicidad del péptido RAN en el crecimiento y la motilidad del desarrollo de C. elegans. En segundo lugar, detallamos un ensayo para medir los efectos post-desarrollo y dependientes de la edad de los péptidos RAN en la motilidad. Por último, describimos un ensayo de neurotoxicidad para evaluar los efectos de los péptidos RAN en la morfología de las neuronas. Estos ensayos proporcionan una evaluación amplia de la toxicidad de los péptidos RAN y pueden ser útiles para realizar pantallas genéticas o pequeñas moléculas a gran escala para identificar mecanismos o terapias de la enfermedad.
Introducción
La expansión inapropiada de las secuencias de repetición de ADN es la base genética de varias enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD) y la enfermedad de Huntington (EH)1. Si bien existen modelos celulares y animales establecidos para estas enfermedades, los mecanismos subyacentes a estas condiciones no están bien definidos. Por ejemplo, la EH es causada por las expansiones de una secuencia de repetición CAG en la secuencia de codificación de la proteína Huntingtin Htt2. Debido a que CAG codifica el aminoácido glutamina, la expansión de repetición CAG ....
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Protocolo
1. Generación de construcciones de expresión de péptidoRAN variadas con codón
- Diseñar la secuencia de codificación de péptidos RAN individual utilizando codones sinónimos para eliminar la estructura repetitiva fundamental de ADN/ARN, pero preservar la secuencia de aminoácidos superantes.
- Ordene las secuencias de codón personalizadas comercialmente en las longitudes de repetición necesarias para los estudios (normalmente de 5 a 100 repeticiones). Incluya un sitio de restricción HindIII en el extremo 5' y un sitio de restricción de BamHI en el extremo de 3' para facilitar la clonación en vectores de expresión de C. elegans, como pPD95.79.
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Resultados
Utilizamos los ensayos descritos aquí para evaluar el efecto de diferentes inhibiciones genéticas sobre la toxicidad de los dipéptidos RAN que se encuentran en pacientes con ELA con una expansión repetida G4C2. Utilizando el ensayo de crecimiento para medir la toxicidad del desarrollo, analizamos los efectos de varios mutantes noqueadores genéticos identificados en un supresor de pantalla RNAi en todo el genoma de toxicidad PR50-GFP expresada por el músculo. Si bien la expresión de PR50-GFP por sí s.......
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Discusión
Aquí informamos métodos que se pueden utilizar para analizar la toxicidad del péptido RAN modelado en el músculo o en las neuronas de C. elegans. Mientras que las proteínas neurodegenerativas tienen un fenotipo de inicio de edad en pacientes humanos, también pueden exhibir toxicidad en el desarrollo cuando se sobreexpresan en los sistemas modelo. La sobreexpresión tiene limitaciones interpretativas significativas, pero también proporciona un poderoso punto de partida para las pantallas genéticas o farmacológicas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
NIH R21NS107797
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de Petri de 35 mm x 10 mm, estéril | Productos científicos CELLTREAT | 50-202-036 | Placas de crecimiento de nematodos y SISTEMAS DE DIAGNÓSTICO DE RNAi |
| AGAR GRANULADOS DE 2 KG DF0145070 | Placas de crecimiento de nematodos y ARNi | ||
| AGAROSA ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | Microinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN | |
| CARBENICILINA 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Placas de crecimiento de nematodos y ARNi |
| CUBREOBJETOS Nº 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imagen para ensayo de comisura |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | Microinyección para generar cepas transgénicas de péptidos | |
| RAN FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN |
| Fisherbrand Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imágenes para ensayo de comisura |
| Gibco Bacto Peptona | Gibco | DF0118-17-0 | Placas de crecimiento de nematodos y ARNi |
| ACEITE DE HALOCARBONO 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | Placas de crecimiento de nematodos y ARNi | |
| Leica Software de imágenes de fluorescencia avanzada Leica | Microsystems | LAS-AF | Software de adquisición de imágenes para análisis de velocidad de vídeo y ensayo de comisura |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | Imaging para el ensayo de comisura | |
| CLORHIDRATO DE LEVAMISOL 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | Imágenes para el ensayo de comisura | |
| PUNTAS DE MICROCARGADOR 2 X 96 PIEZAS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003Microinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN | |
PLACA DE PETRI, 60X15MM,500/CS | CORNING LIFE SCIENCES PLACAS | DE CRECIMIENTO DE FB0875713A DE PLÁSTICO DE NEMATODOS Y ARNi | |
| PLACA DE CULTO DE TEJIDO 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Placas de crecimiento de nematodos y ARNi |
Referencias
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group.
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Reimpresiones y permisos
