Artículo de método

Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

DOI:

10.3791/61024

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30 de abril de 2020

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1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Los productos traslacionales no dependientes del ATG asociados a la repetición son características patógenas emergentes de varias enfermedades basadas en la expansión repetida. El objetivo del protocolo descrito es evaluar la toxicidad causada por estos péptidos utilizando ensayos conductuales y celulares en el sistema modelo C. elegans.

Resumen

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C. elegans se utiliza comúnmente para modelar enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad causadas por mutaciones de expansión repetidas, como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Huntington. Recientemente, se demostró que el ARN que contiene expansión repetida es el sustrato de un tipo novedoso de traducción proteica llamada traducción no dependiente de la AUG (RAN) asociada a la repetición. A diferencia de la traducción canónica, la traducción RAN no requiere un codón de inicio y solo se produce cuando las repeticiones superan una longitud de umbral. Debido a que no hay codón de inicio para determinar el marco de lectura, la traducción RAN se produce en todos los marcos de lectura de las plantillas de ARN de detección y antisentido que contienen una secuencia de expansión repetida. Por lo tanto, la traducción DERAN amplía el número de posibles péptidos tóxicos asociados a la enfermedad de uno a seis. Hasta ahora, la traducción RAN se ha documentado en ocho diferentes enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares basadas en la expansión. En cada caso, descifrar qué productos RAN son tóxicos, así como sus mecanismos de toxicidad, es un paso crítico hacia la comprensión de cómo estos péptidos contribuyen a la fisiopatología de la enfermedad. En este artículo, presentamos estrategias para medir la toxicidad de los péptidos RAN en el sistema modelo C. elegans. En primer lugar, describimos los procedimientos para medir la toxicidad del péptido RAN en el crecimiento y la motilidad del desarrollo de C. elegans. En segundo lugar, detallamos un ensayo para medir los efectos post-desarrollo y dependientes de la edad de los péptidos RAN en la motilidad. Por último, describimos un ensayo de neurotoxicidad para evaluar los efectos de los péptidos RAN en la morfología de las neuronas. Estos ensayos proporcionan una evaluación amplia de la toxicidad de los péptidos RAN y pueden ser útiles para realizar pantallas genéticas o pequeñas moléculas a gran escala para identificar mecanismos o terapias de la enfermedad.

Introducción

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La expansión inapropiada de las secuencias de repetición de ADN es la base genética de varias enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD) y la enfermedad de Huntington (EH)1. Si bien existen modelos celulares y animales establecidos para estas enfermedades, los mecanismos subyacentes a estas condiciones no están bien definidos. Por ejemplo, la EH es causada por las expansiones de una secuencia de repetición CAG en la secuencia de codificación de la proteína Huntingtin Htt2. Debido a que CAG codifica el aminoácido glutamina, la expansión de repetición CAG da como resultado la inserción de una secuencia de poliglutamina, o polyQ, dentro de Htt. Las proteínas poliQ expandidas forman agregados proteicos dependientes de la longitud y la edad que están asociados con la toxicidad3,4. Sorprendentemente, dos estudios recientes sugieren que la longitud de la secuencia polyQ no es el principal impulsor de la aparición de la enfermedad de EH, lo que sugiere que los factores independientes del poliQ también pueden contribuir a la enfermedad5,,6.

Un posible mecanismo independiente de la poliQ implica un tipo recién descubierto de traducción de proteínas denominado Repeat Associado Non-AUG-dependiente (RAN) traducción7. Como su nombre indica, la traducción RAN sólo se produce cuando una secuencia de repetición expandida está presente y no requiere un codón de inicio canónico. Por lo tanto, la traducción RAN se produce en los tres marcos de lectura de la repetición para producir tres polipéptidos distintos. Además, debido a que muchos genes también producen una transcripción antisentido que contiene el complemento inverso de la secuencia de repetición expandida, la traducción RAN también se produce en los tres marcos de lectura de la transcripción antisentido. Juntos, la traducción RAN amplía el número de proteínas producidas a partir de una secuencia de ADN repetitiva ampliada de un péptido a seis péptidos. Hasta la fecha, la traducción RAN se ha observado en al menos ocho diferentes trastornos de expansión de repetición8. Los péptidos RAN se observan en muestras de pacientes postmortem y sólo en los casos en que el paciente lleva una repetición ampliada9,,10. Si bien estos péptidos están claramente presentes en las células del paciente, su contribución a la fisiopatología de la enfermedad no está clara.

Para definir mejor la toxicidad potencial asociada con los péptidos RAN, varios grupos han expresado cada péptido en varios sistemas modelo, tales como levadura, moscas, ratones, y células de cultivo de tejido11,12,13,14,15,16. En lugar de utilizar la secuencia de repetición para la expresión, estos modelos emplean un enfoque de codón-variación en el que se elimina la secuencia de repetición pero se conserva la secuencia de aminoácidos. La iniciación de la traducción se produce a través de un ATG canónico y el péptido se fusiona típicamente con una proteína fluorescente en la Terminal N o C, ninguno de los cuales parece interferir con la toxicidad del péptido RAN. Por lo tanto, cada construcción sobreexpresa un solo péptido RAN. Modelar los diferentes productos RAN en un organismo multicelular con ensayos simples para medir la toxicidad del péptido RAN es de vital importancia para entender cómo los diferentes productos RAN de cada expansión repetida causante de enfermedad contribuyen a la disfunción celular y la neurodegeneración.

Al igual que otros sistemas modelo, C. elegans proporciona una plataforma experimental flexible y eficiente que permite estudiar nuevos mecanismos de enfermedad, como la toxicidad de péptidos RAN. Los gusanos ofrecen varios atributos experimentales únicos que actualmente no están disponibles en otros modelos de toxicidad por péptidos RAN. En primer lugar, los C. elegans son ópticamente transparentes desde su nacimiento hasta la muerte. Esto permite una visualización sencilla de la expresión y localización del péptido RAN, así como el análisis in vivo de la neurodegeneración en animales vivos. En segundo lugar, los métodos transgénicos para generar modelos de expresión de péptidos RAN son baratos y rápidos. Dado el corto ciclo de vida de tres días de C. elegans,se pueden producir líneas transgénicas estables que expresan cualquier péptido RAN dado de una manera específica de tipo celular en menos de una semana. En tercer lugar, las salidas fenotípicas simples se pueden combinar con métodos de cribado genéticos, como mutagénesis química o cribado de ARNi, para identificar rápidamente genes esenciales para la toxicidad del péptido RAN. Por último, la corta vida útil de C. elegans (20 días) permite a los investigadores determinar cómo el envejecimiento, que es el mayor factor de riesgo para la mayoría de las enfermedades de expansión repetida, influye en la toxicidad del péptido RAN. Juntos, esta combinación de atributos experimentales es inigualable en cualquier otro sistema de modelos y ofrece una potente plataforma para el estudio de la toxicidad del péptido RAN.

Aquí describimos varios ensayos que aprovechan las ventajas experimentales de C. elegans para medir la toxicidad de los péptidos RAN e identificar modificadores genéticos de esta toxicidad. Los péptidos RAN iniciados por ATG con codón se etiquetan con GFP y se expresan individualmente en cualquiera de las células musculares bajo el promotor myo-3 o en las neuronas motoras GABAérgicas bajo el promotor unc-47. Para la expresión en las células musculares, es importante que los péptidos RAN tóxicos se etiqueten con proteína fluorescente verde (GFP), u otra etiqueta de proteína fluorescente (FP) que se puede atacar con un vector de alimentación de ARNi. Esto se debe a que la expresión tóxica del péptido RAN generalmente bloquea el crecimiento, haciendo que tales cepas no sean viables. El uso de gfp(RNAi) inactiva condicionalmente la expresión del péptido RAN y permite el mantenimiento de cepas, cruces genéticos, etc. Para los ensayos, estos animales se eliminan de gfp (RNAi),lo que permite la expresión del péptido RAN y los fenotipos resultantes. Además de la estrategia molecular para diseñar construcciones de expresión de péptidos RAN variadas con codón, describimos ensayos para medir la toxicidad del desarrollo (motilidad larval y ensayo de crecimiento), toxicidad asociada a la edad post-desarrollo (ensayo de parálisis) y defectos morfológicos de las neuronas (ensayo de coordinación).

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Protocolo

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1. Generación de construcciones de expresión de péptidoRAN variadas con codón

  1. Diseñar la secuencia de codificación de péptidos RAN individual utilizando codones sinónimos para eliminar la estructura repetitiva fundamental de ADN/ARN, pero preservar la secuencia de aminoácidos superantes.
  2. Ordene las secuencias de codón personalizadas comercialmente en las longitudes de repetición necesarias para los estudios (normalmente de 5 a 100 repeticiones). Incluya un sitio de restricción HindIII en el extremo 5' y un sitio de restricción de BamHI en el extremo de 3' para facilitar la clonación en vectores de expresión de C. elegans, como pPD95.79.
    NOTA: Si la síntesis de construcciones más grandes resulta difícil, se pueden sintetizar secuencias de bloques de construcción más pequeñas y luego integrarse en repeticiones más grandes utilizando una estrategia de ligadura direccional17.
  3. Subclone la secuencia de péptidos en un vector de expresión C. elegans utilizando métodos de ligadura T4 estándar.
  4. Subclone una secuencia promotora específica del tipo de célula generada por la PCR delante de la secuencia del péptido RAN para impulsar la expresión de péptido RAN-GFP específica del tejido.
  5. Microinyectar la construcción del péptido RAN en la gónada de tipo salvaje C. elegans para generar cepas transgénicas que contienen matrices extracromosómicas utilizando métodos estándar18. Para un marcador de coinyección, se utilizó el reportero RFP específico del músculo (myo-3p::RFP (pCFJ104)), aunque también se pueden utilizar otros marcadores.
  6. Integre un transgén estable en el genoma utilizando los métodos de cribado de integración estándar C. elegans 19.
  7. Si el péptido RAN es tóxico y los animales transgénicos no sobreviven, alimenta a los animales gfp (RNAi) expresando bacterias previas y posteriores a la inyección para silenciar la expresión de la proteína tóxica.
    NOTA: La eliminación de animales de gfp (RNAi) permite la expresión del péptido RAN para análisis fenotípicos utilizando los ensayos descritos a continuación.

2. Medición de la toxicidad para el desarrollo de los péptidos RAN tras el derribo de genes basado en ARI: Protocolo de análisis de velocidad de vídeo

  1. Verter placas estándar de nematodo de crecimiento medio de crecimiento (NGM) RNAi 24 pocillos con isopropilo de 1 mM de isopropilo-D-1-tiogalactopiranoside (IPTG) y 25 g/ml de carbenicilina.
  2. Elimina los clones de alimentación de ARNi en bacterias HT115 para ser probados en caldo de Luria (LB) + placas de agar carbenicilina (25 g/ml) y crece bacterias a 37 oC durante 24 h. Incluir vector vacío (RNAi) como control positivo de toxicidad y gfp (RNAi) como control negativo.
  3. Para cada clon, escoge una sola colonia en 1 ml de medios líquidos LB + carbenicillin y crece las bacterias durante la noche durante 18 horas a 37 oC mientras agitas a 250 rotaciones por minuto (RPM).
  4. Detectar cuatro pozos individuales de los pozos NGM RNAI 24 con 20 l de los siguientes cultivos bacterianos nocturnos: columna 1 pozos á gfp (RNAi); columna 2 pozos (EV)RNAi; las columnas 3–6 pozos - ARNi contra los genes a probar. Permita que la bacteria RNAi induzca la producción de dsRNA durante la noche a temperatura ambiente (RT).
  5. Aísle los huevos del primer día a los adultos C. elegans expresando el transgén de péptido RAN integrado utilizando el método estándar de hipoclorito y los huevos de semilla de 30 C. elegans en cada pocediente de la placa de pozo sr. RNAi 24.
  6. Incubar los 24 pozos a 20oC durante 7 días.
    NOTA: Este tiempo de incubación es para cepas que expresan dipéptidos Tóxicos C9orf72 RAN, como PR50 o GR50. Otras cepas pueden requerir tiempos de incubación más cortos para evitar el agotamiento de la fuente de alimento bacteriano y posterior hambre.
  7. Adquiera vídeos ligeros transmitidos utilizando un microscopio de disección estéreo Leica MZ16FA equipado con una cámara monocromática DFC345FX conectada a un PC compatible con Windows con software de adquisición de vídeo Leica AF (versión 2.6.0.7266).
    1. Adquiera dos videos de dos pozos separados para cada condición de ARNi utilizando ajustes de adquisición de video consistentes entre pozos. Para cada vídeo, adquiera 10 segundos con una resolución de 800 x 600 píxeles y 13,16 fotogramas por segundo (dimensión de voxel de tiempo a 0,076 segundos) utilizando un aumento de 18,6x (configuración de zoom de 1,49 en el software AF). Establezca el tiempo de exposición de la imagen en 4 milisegundos. Etiquete cada video inmediatamente con la tensión, la condición de ARNI y el número de pozo.
  8. Ciega al experimentador al genotipo asociado a cada archivo de vídeo al aleatorizar el orden de los vídeos y cambiar el nombre de los vídeos a números. Guarde este grupo de vídeos como un archivo nuevo. Descerece el experimentador una vez completado el análisis.
  9. Mida la "distancia recorrida" y la longitud de cada animal para 20 animales diferentes de cada video, examinando un total de 40 gusanos para cada condición de ARNi.
    1. En el software, seleccione el botón de las herramientas de anotación y, a continuación, la herramienta de dibujo de texto. Haga clic en un punto en el centro del gusano que se mide en el primer fotograma del vídeo y márquelo como un número. Avanza el vídeo hasta el final mientras rastreas visualmente la ruta de movimiento del gusano. En el último fotograma, haga clic en un punto en el centro del gusano que se está midiendo y marque el siguiente número correspondiente. A continuación, con la herramienta de barra de escala de dibujo, dibuje una línea desde el primer número hasta el segundo número para registrar la "distancia recorrida".
    2. "Distancia recorrida" es la distancia entre los dos puntos centroides. Esta distancia se muestra adyacente a la línea de medición. Registre esta medición en una hoja de cálculo. Repita esta medida para otros 19 gusanos en el vídeo conservando cada medición individual en la ventana de análisis.
  10. Realizar mediciones de animales que presentan el movimiento más robusto para evitar la selección de animales sin mostrar ningún movimiento y sesgar los datos hacia la parálisis. Una vez completadas las mediciones, tome una instantánea del fotograma de vídeo final que ilustra todas las líneas de medición para que los datos puedan ser rastreados hasta el animal del que se originó.
  11. Analice los datos mediante una hoja de cálculo de cuatro columnas. La columna uno es el gusano "identificador", la columna dos es la distancia recorrida / tiempo (velocidad).
    1. El tiempo de cada video se puede encontrar haciendo clic derecho en el video bajo el experimento y yendo a las propiedades del video.
  12. Normalice la medición de velocidad mediante la búsqueda de la longitud de cada animal seleccionando Cuantificar y, a continuación, Estadísticas en el software. Al hacer clic en el icono de la herramienta de anotación en la pantalla de vídeo, debería permitir el uso de la herramienta "Dibujar polilínea". Esta herramienta se puede utilizar para rastrear libremente los C. elegans desde el video desde la punta de la cabeza hasta la punta de la cola. La longitud de la línea se registrará en las estadísticas.
    1. Tome una instantánea del fotograma de vídeo final que ilustra toda la polilínea utilizada para dimensionar los C. elegans para que los datos puedan ser rastreados hasta el animal del que se originaron.
  13. Analice los datos agregando dos columnas adicionales a la hoja de cálculo. La columna tres es la "Longitud del animal", y la columna cuatro es la "Velocidad Normalizada" (velocidad/longitud animal). Analice los datos de velocidad normalizados utilizando un ANOVA unidireccional con pruebas post hoc frente a vectores vacíos (RNAi).

3. Medición de la toxicidad para el desarrollo del péptido RAN: Ensayo de crecimiento

  1. Escoja 30 animales gravid en un punto de solución de hipoclorito de 50 ml (10 ml de lejía, 2,5 ml de 10 N NaOH, 37,5 ml de dH2O) en una placa de ARN(RNAi), gfp(RNAi), (EV)RNAi o (específica para genes) de 6 cm.
  2. Después de 24 h, mueva seis progenie transgénicas que se hayan arrastrado fuera del punto de solución de hipoclorito a una nueva placa de ARNi de 6 cm idéntica a las condiciones de ARNi en la placa en la que fueron sometidos al tratamiento de la solución de hipoclorito. Poner estas progenies (F1) a 20 oC para crecer y reproducirse.
  3. Después de 24-48 h, recoger 10 animales L4 transgénicos en 6 cm de ARN que coincidan con las condiciones de ARNi en las que los animales han estado creciendo. Deje que los animales pulsen los huevos durante 24 horas en una incubadora de 20oC.
  4. Después de las 24 h, retire los animales adultos y deséchelos. Cuente el número de huevos y larvas L1 colocadas durante el período de 24 horas utilizando un contador mecánico de mano. Este es el tamaño total de la cría.
  5. Durante las siguientes 72 h, contar el número de animales que alcanzan la etapa L4 o anterior. A medida que se cuenta cada animal, retírelo de la placa.
  6. Cuantificar el "Crecimiento porcentual" como el porcentaje de animales que alcanzan la etapa L4 o más antigua del tamaño total de la cría.
  7. Realice una prueba exacta de Fisher de 2 x 2 frente a un vector vacío (RNAi) para determinar si el crecimiento porcentual es estadísticamente significativo. Las categorías para la comparación son "Crecimiento" (o de animales que alcanzaron la etapa L4 o más antigua en 72 h) y "Sin crecimiento" (tamaño total de la cría menos el número de animales que alcanzan la etapa L4 o más antigua en 72 h).

4. Ensayo de parálisis del péptido RAN post-desarrollo

  1. Mantener cepas transgénicas C. elegans integradas que expresan péptido-GFP RAN en el músculo en gfp(RNAi) colocando 4-6 L4 transgénicos en una placa de 6 cm de gfp(RNAi) y hacer crecer los gusanos a 20 oC.
  2. Si el experimento está utilizando EL ARNI para comprobar los efectos genéticos de la toxicidad del péptido RAN, mover a 10 adultos gravid transgénicos de una placa no hambrienta a cada uno de los dos vectores vacíosde 6 cm (ARN) (control positivo para la parálisis, control negativo para los efectos genéticos), gfp(RNAi) (control negativo para la parálisis, control positivo de los efectos genéticos), específico del gen(ARNI) (es decir, 10 adultos gravid por placa de 6 cm).
  3. Si se utilizan mutantes para analizar los efectos genéticos sobre la toxicidad del péptido RAN, coloque 10 animales graves de WT o mutantes que expresen el mismo transgén RAN en cada una de las dos placas de vector eslano vacíode 6 cm (RNAi) o gfp (RNAi). Cultivar los gusanos a 20oC durante 48 h.
  4. Escoja 10 juegos de 10 L4 transgénicos de las placas RNAi de 6 cm y coloque cada conjunto en una placa DE 3 cm de ARNi (es decir, n a 100 animales para cada genotipo). Asegúrese de que el L4 seleccionado para el ensayo todos tienen una motilidad superficialmente normal. Coloque las placas dentro de una bolsa de almacenamiento con cremallera para retener la humedad.
  5. Coloque las placas embolsadas con L4 en la incubadora de 25oC.
  6. Retirar los animales 24 h más tarde de la incubadora de 25oC una cepa a la vez para minimizar la cantidad de tiempo que están fuera en RT.
  7. Toque las placas del microscopio de disección para comprobar si hay movimiento. Si los animales se mueven más que una longitud corporal, cuente el animal como móvil y transfiéralo a una nueva placa RNAi de 3 cm. Utilice un pico de platino para tocar los gusanos restantes en la cabeza o la cola. Si el animal se mueve más que una longitud corporal, cuente el animal como móvil y transfiéralo a una nueva placa RNAi de 3 cm.
    NOTA: No exceda de 10 gusanos por placa durante la transferencia. Tenga cuidado de evitar mover la progenie a la nueva placa de ARNi porque el ensayo depende de seguir animales envejecidos solamente.
  8. Agrupe todos los gusanos no móviles para que se pueda detectar fácilmente el movimiento de más de una longitud corporal. Dé al animal al menos un minuto para mover más de una longitud corporal. Si todavía no se mueve, está paralizado, embolsado (es decir, larvas nacidas dentro de la madre), o muerta.
  9. Censurar a los animales que exhiben embolsado, desecar en los lados de la placa, exhibir intestinos extruidos, cavar, perderse o morir por el ensayo en el momento de la detección. Los gusanos paralizados se cuentan, se dejan en la vieja placa de RNAi y se desechan.
  10. Anota a los animales para que los deletan todos los días durante 5-7 días, como se describe en los pasos 4.6–4.9.
  11. Analice los datos de parálisis con una prueba de clasificación de registros idéntica a la utilizada para analizar la vida útil. En este análisis estadístico, los gusanos en movimiento se puntúan como "Vivos", los gusanos paralizados se puntúan como "Muertos", y los gusanos muertos, embolsados, extruidos por tripa, desecados, enterrados o perdidos se puntúan como "Censurados".
    NOTA: En este análisis, el número "Porcentaje vivo" indica los animales "Porcentaje en movimiento". El inverso representa el "Porcentaje Paralizado". Utilice la herramienta de análisis en línea OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) para realizar los análisis estadísticos de rango de registro.

5. Medición de la patología de las neuronas: Ensayo de comunición

  1. Generar C. elegans transgénicos expresando el péptido RAN de interés en las neuronas GABAérgicas utilizando el promotor unc-47. También expresar unc-47p::GFP o unc-47p::RFP para revelar la morfología celular de las neuronas GABA.
  2. Escoge 50 animales L4 transgénicos y colócalos en una placa OP50 de 6 cm a 25oC durante 24 h.
  3. Transfiera los 50 animales transgénicos a una nueva placa OP50 de 6 cm a 25 oC durante 24 h.
  4. Haga almohadillas de agarosa para tomar imágenes de los animales bajo microscopía de campo ancho.
    1. Coloque dos trozos de cinta encima de dos diapositivas de microscopio. Coloque una diapositiva limpia sin cinta adhesiva en el centro de las dos diapositivas grabadas.
    2. Dispensar 100 l (1 gota de una pipeta Pasteur de plástico desechable) de agarosa fundida del 3% sobre el portaobjetos medio con una pipeta de transferencia estéril desechable.
    3. Coloque inmediatamente una segunda diapositiva limpia a través de la gota de agarosa fundida para que se apoye en las diapositivas grabadas y cree una capa fina y uniforme de agarosa entre las diapositivas.
    4. Después de que la agarosa se haya enfriado y solidificado, retire cuidadosamente las dos diapositivas con la capa de agarosa entre ellas, sin separarlas, y colóquelas en una bolsa de plástico con un pedazo de papel húmedo debajo de ellos. Haga una diapositiva por cada 10 gusanos para ser examinado junto con tres diapositivas adicionales.
  5. Retire los C. elegans transgénicos de la incubadora de 25 oC y escoja 10 C. elegans transgénicos en una caída de 100 oL de levamisol de 10 mM en un portaobjetos de depresión de vidrio. Incubar durante 10 minutos o hasta que los animales estén paralizados.
  6. Retire un par de diapositivas de la bolsa de plástico y sepárelas cuidadosamente. Etiqueta la diapositiva con la agarosa con el genotipo y añade 2 ml de levamisol de 10 mM a la mitad de la agarosa. Mueve los 10 animales a la levamisol de la almohadilla de agarosa. Cubrir los animales con un cubreobjetos de espesor #1.
  7. Animales de imagen en los que la vulva está orientada de tal manera que está en el lado derecho del animal. Si la vulva está en el lado izquierdo de la cabeza, las comisuras de las neuronas motoras estarán debajo de los animales y no serán tan claramente visibles, lo que dificulta la cuantificación precisa. Omitir la cuantificación de estos animales. En esta orientación, las comisuras de las neuronas motoras son más cercanas a la cubierta y son claramente visibles en un microscopio de fluorescencia de campo ancho invertido. Visualice las comisuras de la neurona que expresan GFP con un microscopio de fluorescencia de campo ancho invertido Leica DMI4000B con una lente de inmersión de aceite 63X 1.4X NA y un conjunto de filtros Leica L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). Si la neurona commisa RFP expreso en lugar de GFP, utilice un conjunto de filtros Leica TX2 RFP (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualice las comisuras de la neurona que expresan GFP con un microscopio de fluorescencia de campo ancho invertido con una lente de inmersión de aceite de 63x 1.4x NA y un conjunto de filtros GFP (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Si la neurona commisa rFP expreso en lugar de GFP, utilice un conjunto de filtros de proteína fluorescente roja (RFP) (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Imagen de los gusanos dentro de los 45 minutos de colocar el cubreobjetos en los gusanos para minimizar la toxicidad de la inmovilización.
  9. Para cada gusano, cuente el número de comisarios visibles. Hay 16 comisarios visibles en animales de tipo salvaje. También cuente el número de comisuras que tienen cuentas grandes (es decir, blebs) en las commissures, así como el número de commissures que están rotos. Para confirmar que la comisura está rota, siga la comisura del cordón dorsal hasta el cordón ventral ajustando el plano focal.
    NOTA: Las commisisuras en las que la fluorescencia unc-47p::GFP exhibe un hueco se consideran rotos. Una comisura rota normalmente tiene un bleb a ambos lados de la rotura, lo que ayuda a mostrar que las comisuras están rotas. Cuente la cantidad de blebeos y roturas para 20 gusanos.
  10. Calcular la fracción de comisuras con manchas o roturas sobre el número total de comisuras observadas para cada animal. También se puede medir el número absoluto de comisarios contados por animal (incluyendo el tipo salvaje, el manchado y los eventos rotos).
  11. Para cada categoría, calcule la media de SD y analice estadísticamente con la prueba t de un estudiante para la comparación entre dos poblaciones, o un ANOVA unidireccional para comparaciones entre 3 o más poblaciones.

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Resultados

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Utilizamos los ensayos descritos aquí para evaluar el efecto de diferentes inhibiciones genéticas sobre la toxicidad de los dipéptidos RAN que se encuentran en pacientes con ELA con una expansión repetida G4C2. Utilizando el ensayo de crecimiento para medir la toxicidad del desarrollo, analizamos los efectos de varios mutantes noqueadores genéticos identificados en un supresor de pantalla RNAi en todo el genoma de toxicidad PR50-GFP expresada por el músculo. Si bien la expresión de PR50-GFP por sí s...

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Discusión

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Aquí informamos métodos que se pueden utilizar para analizar la toxicidad del péptido RAN modelado en el músculo o en las neuronas de C. elegans. Mientras que las proteínas neurodegenerativas tienen un fenotipo de inicio de edad en pacientes humanos, también pueden exhibir toxicidad en el desarrollo cuando se sobreexpresan en los sistemas modelo. La sobreexpresión tiene limitaciones interpretativas significativas, pero también proporciona un poderoso punto de partida para las pantallas genéticas o farmacológicas...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de Petri de 35 mm x 10 mm, estérilProductos científicos CELLTREAT50-202-036Placas de crecimiento de nematodos y SISTEMAS DE DIAGNÓSTICO DE RNAi
AGAR GRANULADOS DE 2 KG DF0145070Placas de crecimiento de nematodos y ARNi
AGAROSA ULTRAPURELIFE TECHNOLOGIESMicroinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN
CARBENICILINA 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485Placas de crecimiento de nematodos y ARNi
CUBREOBJETOS Nº 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542BImagen para ensayo de comisura
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSMicroinyección para generar cepas transgénicas de péptidos
RAN FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485CMicroinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN
Fisherbrand  Portaobjetos de microscopio Superfrost PlusTHERMO SCI ERIE12-550-15Imágenes para ensayo de comisura
Gibco  Bacto Peptona Gibco DF0118-17-0Placas de crecimiento de nematodos y ARNi
ACEITE DE HALOCARBONO 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLMicroinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSPlacas de crecimiento de nematodos y ARNi
Leica Software de imágenes de fluorescencia avanzada LeicaMicrosystemsLAS-AFSoftware de adquisición de imágenes para análisis de velocidad de vídeo y ensayo de comisura
Leica Immersion type N (Oil)W NUHSBAUM INCImaging para el ensayo de comisura
CLORHIDRATO DE LEVAMISOL 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICSImágenes para el ensayo de comisura
PUNTAS DE MICROCARGADOR 2 X 96 PIEZASEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242956003Microinyección para generar cepas transgénicas de péptidos RAN

PLACA DE PETRI, 60X15MM,500/CS		CORNING LIFE SCIENCES PLACASDE CRECIMIENTO DE FB0875713A DE PLÁSTICO DE NEMATODOS Y ARNi
PLACA DE CULTO DE TEJIDO 24WEL 50/CSCORNING LIFE SCIENCES DL87721Placas de crecimiento de nematodos y ARNi
16500500 E5242952008 BP162010 NC9547002 AC187870100

Referencias

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